專利名稱：人乳頭瘤病毒e7抗原組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療人乳頭瘤病毒感染及相關疾病狀況的化合物和組合物。更具體地，本發明涉及用于治療人乳頭瘤病毒感染及相關疾病狀況的人乳頭瘤病毒E7抗原化合物和組合物。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(HPV)是一組超過100種相關，但通常不同的病毒“種類”，其可以廣義地分為低危和高危。低危型HPV與尋常疣(或乳頭狀瘤)相關，它們通常是良性的且沒有生命危險。相比之下，高危型HPV的持續感染與癌前宮頸非典型性增生和宮頸癌相關(1、2)。高危型HPV還與肛門癌、外陰癌、陰道癌和陰莖癌(3)，以及頭頸癌的某些子集(4-6)和乳腺癌(57)相關。引起宮頸癌的高危型HPV通過性傳播并且在正常的健康人群中十分普遍。據估算，大部分人在發生性活躍之后不久就被感染(7、59)。絕大部分高危HPV感染被認為是自我限制的，與病理學很少相關，然而感染高危HPV可能發展為惡性腫瘤(8)。盡管HPV16和HPV18是最普遍的高危型HPV，然而還有很多其他高危型HPV。近期對1，918例宮頸癌患者1，928例健康對照婦女的比較分析揭示，癌癥患者中最常見的HPV類型(按頻率降序排列)為HPV類型16、18、45、31、33、52、58和35(11)。類似地，宮頸癌中HPV盛行的全球分析揭示，HPV16存在于50%的病例中，HPV18存在于14%的病例中，HPV45存在于8%的病例中并且H PV31存在于5%的病例中，而13種“高危”類型中的其他成員組成剩余的病例(12)。由于HPV16和HPV18的盛行，它們已經是意在預防HPV的最初感染的廣泛預防免疫計劃的焦點(9、10)，并且目前批準的預防性疫苗靶向高危毒株HPV16和HPV18 (以及低危毒株HPV6和HPV11)，預期預防性疫苗將消滅或預防以后的生活中HPV相關的惡性腫瘤的發生。還顯示，HPV16和HPV18預防性疫苗可以賦予針對其他高危型HPV的部分交叉保護(13-15)。目前臨床應用的預防性HPV疫苗由自發地形成人工病毒樣顆粒(VLP)的重組病毒衣殼糖蛋白(LI)組成(60、61)。用基于VLP的免疫，預防性疫苗產生針對LI蛋白的強烈的中和抗體應答，其防止病毒感染變成既定事實。然而，預防性疫苗似乎對既定的感染有很小的影響(16)。例如，宮頸癌預防性疫苗對那些已經暴露于HPV的個體是無效的，因為一旦病毒已經進入到細胞中，其被保護免受細胞外抗體的中和作用，從而允許病毒復制(和潛在性感染)順利進行。感染高危HPV可能導致病毒游離基因整合入宿主DNA中，通常導致一些早期(E2、E4和E5)基因和晚期(LI和L2)基因的刪除，保留HPV蛋白E6和E7，它們是僅有的在感染的細胞中持續表達的病毒蛋白(23，24，59)。在這種情況下，疫苗誘導的針對LI衣殼蛋白的免疫對治療無效。此外，由于HPV感染在當今成人人群中的高度流行以及宮頸癌變的緩慢進程，預期將在20年或更多年后直到預防性疫苗大量實施后，將對宮頸癌的發病率有影響。此外，在一些實例中，預防性疫苗已經遭遇抗性并且接種疫苗的比例是多變的(17)。在一些地區，疫苗成本仍然是個問題(18)。治療性HPV疫苗(設計為通過產生針對表達病毒蛋白的HPV感染細胞的細胞免疫，消滅之前已經存在的病變)已被開發作為HPV相關癌癥治療的替代品(綜述于，參見19，20，62-65)，并且許多這些方法已經針對開發能引起強烈⑶8T細胞應答的疫苗，因為目前證明許多疫苗通常難以引起⑶8免疫￠6,67)。HPV E7治療性接種方法已經包括肽免疫(26，28-30)，DNA免疫(31-33，68)，利用重組的表達E7的牛痘病毒免疫(25，34)，用腺病毒免疫(35-37)，用鼠傷寒沙門氏菌免疫(38，39)或用單核細胞增多性李斯特氏菌免疫(40，41)，用E7脈沖樹突狀細胞免疫(42-45)或用包含E7的病毒樣顆粒(VLP)免疫，以及用已經進行早期臨床試驗的·這樣一些治療性疫苗策略免疫。許多這些治療性疫苗策略通常在邏輯上是繁瑣的，并且其引起的應答極少達到在真正的抗病毒免疫應答的急性期所觀察到的CD8T細胞增殖的水平出9)。通過加強接種增強CD8免疫的策略已經用于引起CD8免疫，所述策略例如多種類型的異源初免-加強策略，包括用于初免-加強的DNA-肽，DNA-病毒或兩種不同的病毒載體(70-72)。然而，這些方法難以轉化至臨床，并且關于哪種方法最佳沒有共識。HPV疫苗已在很多出版物中公布，包括PCT公布W02005/089164(2005年9月29日公布)，W02007/121894(2007 年 11 月 I 號公布)，W02007/121895 (2007 年 11 月 I 日公布)，W02008/049329 (2008 年 5 月 2 日公布)，和 W02008/145745 (2008 年 12 月 4 號公布)。TC-1模型腫瘤系統，最初來源于用HPV16的E6和E7癌基因轉化的小鼠原代肺上皮細胞，E6和E7癌基因是感染細胞的轉化和永生化以及轉化狀態的細胞的維持(21，22)，以及活化人c-Ha-ras所必需的(25)，該系統已被廣泛采用為HPV治療性疫苗的測試系統。TC-1腫瘤細胞植入免疫感受態C57BL/6小鼠導致接種部位形成快速進展的腫瘤。然而，針對HPV16E7蛋白的特異性細胞免疫可以賦予對TC-1腫瘤生長的保護。例如，已報道，對E7的H-2Db-限制性表位(E749-57; RAHYNIVTF)特異的CD8+T細胞能夠裂解表達E7的腫瘤細胞，并且造成已建立的TC-1腫瘤的消退(26，27)。整個外源蛋白質免疫接種已經表明是誘導I類MHC限制性⑶8+T細胞應答的低效手段(50)。然而，已經報道，當分別與QuilA或含有CpG的寡核苷酸一起遞送時，用重組的
(51)或合成的(52)全長E7蛋白免疫能夠誘導CD8+T細胞免疫。同樣，由免疫原性的熱休克蛋白(HSP)和選定的靶抗原之間融合組成的重組蛋白也被報告誘導對該靶抗原的CD8+免疫。已經表明，用整個外源蛋白質加TLR3或TLR9激動劑的免疫促進交叉啟動的過程，并促進抗原特異性CD8+T細胞應答的發展(55，56)。目前，宮頸非典型性增生和早期宮頸癌是最常見使用被稱為LEEP(環形電切術)的外科手術治療，其中使用帶有電流的細鐵絲環去除異常組織。更晚期的宮頸癌通過手術(部分或根治性子宮切除術)結合化療或放射治療而治療。發明簡述本發明一部分提供了人乳頭瘤病毒E7抗原的化合物和組合物。所述化合物和組合物可用于治療或診斷人乳頭瘤病毒感染和相關的疾病狀況。在一方面中，本發明提供了多肽，其包含與兩種或更多種人乳頭瘤病毒(HPV)E7抗原的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，其中所述E7抗原選自至少兩種不同的HPV毒株。
在可替代的實施方案中，不同的HPV毒株可以是高危毒株，如HPV16，HPV18,HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或HPV82。在可替代的實施方案中，E7抗原可以選自五種不同的HPV毒株，如HPV18，HPV16，HPV31, HPV45 和 HPV52。在可替代的實施方案中，所述多肽可包含兩個或更多個SEQ ID NO:1至15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1至5中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO: 16或17所示的氨基酸序列。在可替代的實施方案中，所述多肽可由包含兩個或更多個SEQ ID NO:18到32所示的核苷酸序列的核苷酸序列編碼。在可替代的實施方案中，所述多肽可由包含兩個或更多個SEQ ID NO:18到22所示的核苷酸序列的核苷酸序列編碼，如SEQ ID N0:33或34。在可替代的實施方案中，E7抗原可以誘導對兩種不同HPV毒株的免疫應答。在其它方面，本發明提供了核酸分子，其包含與兩種或更多種人乳頭瘤病毒(HPV)E7抗原的核苷酸序列基本上相同的序列，其中所述E7抗原選自至少兩種不同的HPV毒株。在可替代的實施方案中，不同的HPV毒株可以是高危毒株，如HPV16，HPV18,HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或HPV82。在可替代的實施方案中，E7抗原可以選自五種不同的HPV毒株，如HPV16，HPV18，HPV31, HPV45 和 HPV52。在可替代的實施方案中，所述核酸分子可以包含兩個或更多個SEQ ID N0:18至32所示的核酸序列。在可替代的實施方案中，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:18至22所示的核酸序列，如 SEQ ID NO: 33 或 34。在其它方面中，本發明提供了編碼HPV E7多肽的核酸分子。在其它方面中，本發明提供了包含本文所述的核酸序列的表達載體，所述核酸序列可操作地連接到允許所述核酸序列在宿主細胞中表達的序列。在其它方面中，本發明提供了包含如本文所述的核酸分子或表達載體的宿主細胞。在其它方面中，本發明提供一種組合物，所述組合物包含本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞。所述組合物可包含載體和/或佐劑。佐劑可以是Toll樣受體(TLR)激動劑諸如TLR3激動劑(例如，多聚(1: C))或TLR9激動劑(例如，含有CpG的寡核苷酸)等。作為另外一種選擇或除此之外，該佐劑可以是干擾素a，4-lBB受體的激動劑，⑶40受體的激動劑，或抗-⑶40抗體。在其它方面中，本發明提供了通過給予有需要的個體本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞而在 所述個體中刺激免疫應答的方法。在替代方面中，本發明提供了通過給予有需要的個體本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞而治療或預防所述個體中與HPV感染相關的疾病狀況的方法。在替代方面中，本發明提供了通過給予有需要的個體本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞而治療所述個體HPV感染的方法。
在其它方面中，本發明提供了本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞在有需要的個體中刺激免疫應答的用途。在其它方面中，本發明提供了本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞在治療或預防有需要的個體中與HPV感染相關的疾病狀況的用途。在其它方面中，本發明提供了本文所述的多肽、核酸分子、表達載體或宿主細胞治療有需要的個體中HPV感染的用途。與HPV感染相關的疾病狀況可以是乳腺癌，宮頸癌，肛門癌，外陰癌，陰道癌，陰莖癌，頭頸癌和肺癌，或其癌前病變中的一種或多種，或者可以是癌前宮頸上皮內瘤變(CIN I至CIN III)或宮頸癌。在可替代的實施方案中，HPV感染可以是高危型HPV，如HPV16，HPV18，HPV31,HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或 HPV82。在可替代的實施方案中，所述方法或用途還可以包括給予佐劑，如Toll樣受體(TLR)激動劑(例如，TLR3激動劑如多聚(1:C)或TLR9激動劑如含有CpG的寡核苷酸)。作為另外一種選擇或除此之外，該佐劑可包括干擾素a ,4-1BB受體的激動劑，CD40受體的激動劑,或抗-⑶40抗體。給藥可以包括在少于14天的時期多劑量給藥，或可以包括在I至4天的多劑量給藥，和/或可以包括多個日劑量給藥。在其它方面中，本發明提供了基本上由序列TSNYNIVTF (SEQ ID NO:35)，AEPDTSNYNIVTFCC (SEQ ID NO:36)或 TSNYNIVTFCCQCKS (SEQ ID NO:37)中的一個或多個組成的肽。在其它方面中，本發明提供了診斷HPV31感染的方法，包括將樣品與基本上由序列TSNYNIVTF(SEQ ID NO:35),AEPDTSNYNIVTFCC(SEQ ID NO:36)或TSNYNIVTFCCQCKS(SEQID N0:37)中的一個或多個組成的肽接觸。在其它方面中，本發明提供了確定個體對HPV31感染的應答的方法，包括將樣品與基本上由序列TSNYNIVTF(SEQ ID NO:35)，AEPDTSNYNIVTFCC (SEQ ID NO:36) 或 TSNYNIVTFCCQCKS (SEQ ID NO:37)中的一個或多個組成的肽接觸。本發明簡述不一定描述了本發明的所有特征。
從下面的描述中，參考了附圖，本發明的這些特征和其它特征將變得更加明顯，其中:圖1A-B是示出不具有親和標簽的Pentarix蛋白(A),或具有可切割的6X親和標簽和凝血酶切割位點的Pentarix蛋白(B)的示意圖。圖1C示出了具有可切割的6X親和標簽的Pentarix蛋白的制備和純化。該圖顯示了重組Pentarix蛋白在大腸桿菌中的表達和使用鎳親和純化的典型純化的實例。通過考馬斯亮藍染色檢測通過HisTrap柱(GE Healthcare)之前和之后的IPTG-誘導的大腸桿菌裂解物內包含的總蛋白和在漸增濃度的咪唑存在下從該柱(Fr # 1-12)中洗脫的蛋白(左圖)。純化的Pentarix蛋白的鑒定是通過利用抗6Xhis標簽抗體或抗HPV16E7抗體對來自未誘導的和誘導的培養物的裂解物以及純化的Pentarix和HPV16E7蛋白進行免疫印跡分析來確認。圖2A是圖表，示出響應于用完整的外源性OVA蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)或多聚IC/LC免疫而誘導的0VA257_264特異性⑶8+T細胞應答。用加上或減去多聚(1:C) (10 u g)或多聚IC/LC (10 u g/ml)的完整的OVA蛋白(500 u g)對初次接受實驗的C57BL/6小鼠(2只小鼠/情況)進行免疫。免疫后七天處死小鼠，并通過IFN- y ELISP0T對免疫小鼠大量脾細胞中的0VA257_264 (SIINFEKL)特異性CD8+T細胞的數目進行定量。結果報告為僅用介質、用SIINFEKL肽(10 u g/ml)或不相關的H2Db結合肽(10 u g/ml)刺激后，每I X IO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目。圖2B是圖表，示出用完整的外源性OVA蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)免疫接種后，以劑量依賴性的方式誘導0VA257_264特異性CD8T細胞應答。圖3A-E顯示響應于長或短間隔(集群)的同源初免-加強免疫而誘導的0VA257_264特異性CD8+T細胞或HPV16E7應答。A.用完整的OVA蛋白(IOOug)加多聚(1:C) (IOug)在-7天、-21天、或-7天和-21天對初次接受實驗的C57BL/6小鼠(2只小鼠/情況)進行免疫，并在第0天處死。通過IFN- y ELISP0T對免疫小鼠大量脾細胞中的0VA257_264特異性CD8+T細胞的數目進行定量。B.用指定數量的連續日劑量的完整的可溶性OVA蛋白(100 u g)與多聚(1:C) (10 u g)混合對初次接受實驗的C57BL/6小鼠(3只小鼠/情況)進行免疫。一組額外的小鼠接受單次免疫，相當于正常日劑量的4倍(即400 ii g的OVA蛋白加40iig的多聚(1:C))。第一次免疫后七天處死小鼠，通過IFN-Y ELISP0T評估大量脾細胞制劑，以對0VA257_264特異性CD8+T細胞的數目進行定量。A和B的結果被報告為僅用介質或用SIINFEKL肽(IOii g)刺激后每I X IO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目。C.如顯示的，用I次劑量或4次連續日劑量的完整的可溶性OVA蛋白(IOOiig)加多聚(1:C)(IOug)對初次接受實驗的C57BL/6小鼠進行免疫。D.從第一輪免疫模擬后第47天開始，用另一相同的4次連續日劑量對圖C中接受4次連續日劑量的OVA蛋白加多聚(1:C)的小鼠進行重新免疫。從個體小鼠的隱靜脈獲得外周血，在免疫后指定的天數連續放血。裂解外周血中的RBC，用FITC標記的抗-⑶8和PE標記的H_2Kb/0VA257_264四聚體對淋巴細胞進行染色，并通過流式細胞術分析。C和D中所示的事件是在CD8+淋巴細胞上設門分選的，并來自代表性的單個動物，從而允許精確監測指定的動物中抗原特異性T細胞應答隨時間的進展。E.用 I次劑量(左圖)，四次連續日劑量的完整的可溶性HPV16E7蛋白(IOOiig)加多聚(1:C) (lOiig)，或僅用四次連續日劑量的完整的可溶性HPV16E7蛋白(IOOiig)對初次接受實驗的C57BL/6小鼠進行免疫。免疫后七天,從免疫的小鼠獲得外周血。用FITC標記的抗-CD8和PE標記的Db/E749_57四聚體對淋巴細胞進行染色，并通過流式細胞術進行分析。顯示的事件是對CD8+淋巴細胞設門分選的。圖4是表示用完整的可溶性蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)連續每日免疫接種誘導大的已建立的腫瘤的消退的一系列圖表。在第0天向C57BL/6小鼠(3只小鼠/群)植入表達OVA的EG7腫瘤細胞(I XlO5)，并進行以下處理:留下未處理(左上)，或用I次劑量的多聚(1:C) (IOug)處理(右上)，或用I次劑量的完整的可溶性OVA蛋白(IOOiig)加多聚(1:C) (IOug)處理(左下)，或用4次連續日劑量的完整的可溶性OVA蛋白(IOOiig)加多聚(1:C) (IOug)處理(右下)。箭頭指示每組的處理時間。每組處理時的平均腫瘤體積為224mm3 (只用多聚(1: C))，194mm3 (I次劑量的OVA+多聚(1: C))或344mm3 (4次劑量的OVA+多聚(1:C))。最后一群小鼠故意在腫瘤尺寸較大時處理，以體現連續每日免疫接種的有利影響。圖5A和5B是示出響應于用完整的Pentarix蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)進行單次免疫接種而誘導的HPV16E 749_57特異性⑶8+T細胞應答的圖。初次接受實驗的C57BL/6小鼠被留下未處理，或用IOOii g完整的可溶性Pentarix蛋白與IOy g的多聚(1:C)混合進行免疫，或僅用IOyg的多聚(1:C)處理(5B)。免疫后七天處死小鼠，通過IFN-Y ELISP0T評估大量脾細胞制劑，以對HPV16E749_57特異性CD8+T細胞的數目進行定量。簡要地說，僅用介質或用HPV16E749_5J^ (10 u g/ml)或不相關的對照肽(KAVYNFATM; SEQ ID NO:40)對來自個體動物的脾細胞(3 X IO5細胞/孔，每種情況三個孔)進行過夜刺激。包括來自初次接受實驗(未免疫過)的小鼠的結果用于進行比較。結果報告為僅用介質，或用!^16￡749_57肽或不相關的肽(10 u g/ml)刺激后，每I X IO6個脾細胞中IFN- y斑點形成細胞的數目(5B)。圖6A和6B是示出響應于用完整的Pentarix蛋白加TLR9激動劑CpG寡核苷酸的單次免疫接種而誘導的HPV16E749_57特異性CD8+T細胞應答的圖。初次接受實驗的C57BL/6小鼠被留下未處理或用IOOii g完整的可溶性Pentarix蛋白與IOy g的CpG寡聚物# 2395 (Invivogen)混合進行免疫,或僅用CpG寡聚物進行免疫。免疫后七天處死小鼠,通過IFN- y ELISP0T評估大量脾細胞制劑，以對HPV16E749_57特異性⑶8+T細胞的數目進行定量。簡要地說，僅用介質或用即￥16￡ 749_57肽(IOii g/ml)或不相關的對照肽(KAVYNFATM; SEQID NO:40)對來自個體動物的脾細胞(3 X IO5細胞/孔，每種情況三個孔)進行過夜刺激。包括來自初次接受實驗(未免疫過)的小鼠的結果用于進行比較。結果報告為僅用介質，或用HPV16E749_57肽或不相關的肽(10 u g/ml)刺激后，每I X IO6個脾細胞中IFN- y斑點形成細胞的數目。圖6B中所給出的數據代表三次實驗；結果報告為每I X IO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目+/-SD，一式三份。圖7A-B是示出響應于用完整的Pentarix蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)單次免疫接種，或用4次連續日劑量的Pentarix蛋白加多聚(1:C)免疫接種而誘導的HPV16E749_57特異性CD8+T細胞應答的圖。初次接受實驗的C57BL/6小鼠(對于圖7B每群3只)被留下未處理(初次接受實驗)，或用IOOii g完整的可溶性Pentarix蛋白與IOy g多聚(1:C)混合進行I次或4次免疫(第1-4天每天I次)。免疫后七天(7A)或八天(7B)處死小鼠，通過IFN- y ELISP0T評估 大量脾細胞制劑，以對HPV16E749_57特異性⑶8+T細胞的數目進行定量。結果報告為僅用介質或用HPV16E 749_57或不相關的肽(IOii g/ml)刺激后每IXlO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目(7B)。僅用介質或用1^16￡ 749_57肽(10 y g/ml)或不相關的對照肽(KAVYNFATM，SEQ ID NO:40)對來自個體動物的脾細胞(3 X IO5細胞/每孔)進行過夜刺激。圖7B中所給出的數據代表三次實驗；結果報告為每I X IO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目+/-SD，一式三份。圖7C顯示了研究結果，其中用FITC標記的抗-CD8和PE標記的Db/16E 749_57四聚體對來自連續4天用100 u g Pentarix蛋白加10 y g多聚(1:C)(左二圖)或僅用100 u gPentarix蛋白(右圖)進行免疫的小鼠的脾臟和外周血淋巴細胞進行染色，并用流式細胞術分析。示出的事件是對CD8淋巴細胞設門分選的并代表4只這樣的動物。圖8A和8B是顯示用完整的可溶性Pentarix蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)進行免疫接種誘導大的已建立的TCl的一系列圖表。A.在第-14天向C57BL/6小鼠(3只小鼠/群)植入表達E7的TCl腫瘤細胞(3 XlO5)，在第0天(當腫瘤達到約200mm3的尺寸)，小鼠被留下未處理(左)，或用I次劑量的多聚(I = C)(IOyg)處理(中)或I次劑量的完整的可溶性Pentarix蛋白(100 y g)加多聚(1:C) (10 y g)處理(右)。使用電子數顯卡尺每2-3天測量腫瘤，并使用以下公式計算大小:寬度2X長度X0.5。B.向初次接受實驗的C57BL/6小鼠(8只/群)皮下植入I X IO5個表達E7的TC-1腫瘤細胞。一旦腫瘤達到350mm3的平均體積,用單次劑量的Pentarix(100 ii g)加多聚(1:C) (IOiig)處理小鼠,4次連續日劑量的Pentarix(IOOiig)加多聚(I = C)(IOyg)處理小鼠，僅用4次連續日劑量的多聚(1:C)(每劑量IOyg)處理小鼠，或保留小鼠為未處理。用電子卡尺每2至4天測量腫瘤，當腫瘤體積超過約2，OOOmm3或當小鼠垂死或失去>20%的體重時處死荷瘤小鼠。數據顯示為群內所有小鼠的平均腫瘤體積(左圖)或存活率(右圖)。圖8C為用Pentarix蛋白加多聚(1:C)對TCl荷瘤小鼠進行免疫接種誘導腫瘤完全消退，并建立在腫瘤進展后保持的E7特異性CD8+記憶細胞。向初次接受實驗的C57BL/6小鼠皮下植入I X IO5個表達E7的TC-1腫瘤細胞。一旦腫瘤達到200mm3的平均體積，用單次劑量的Pentarix(IOOiig)加多聚(I = C)(IOyg)處理小鼠，免疫接種后15天之內腫瘤完全消退。免疫后21天從隱靜脈取外周血樣品，并用FITC標記的抗-⑶8和PE標記的Db/16E749_57四聚體，以及記憶表現型標記⑶62L，⑶127和KLRGl進行染色，并用流式細胞儀分析。示出的時間是對CD8+淋巴細胞設門分選的。圖9A-B是表示用完整的可溶性Pentarix蛋白結合多聚(1:C)或CpG寡核苷酸進行免疫接種誘導已建立的TCl腫瘤的消退的一系列圖表。A.在第-21天向C57BL/6小鼠(4只小鼠/群)植入表達E7的TCl腫瘤細胞(I XlO5)，并且在第0天，用I次劑量的完整的可溶性Pentarix蛋白(IOOyg)加CpG寡聚物# 2395 (10 Ug)處理(左上)或僅用I次劑量的CpG寡聚物# 2395 (IOiig)處理(右上)或留下未經處理(左下)。使用電子數顯卡尺每2-3天測量腫瘤，并使用以下公式計算大小:寬度2X長度X0.5。左上方，右上方和左下方3張圖顯示個體小鼠中的腫瘤消退，而右下圖顯示每群的組合平均腫瘤體積測量結果。B.向初次接受實驗的C57BL/6小鼠(指定數量的小鼠/群)皮下植入IXlO5個表達E7的TC-1腫瘤細胞。一旦腫瘤達到約200mm3的平均體積，(如上)用單次劑量的Pentarix(100 u g)加多聚(1:C) (10 u g)處理小鼠，或用單次劑量的Pentarix (100 y g)力口CpG寡核苷酸(IOii g)或多聚(1:C) (IOu g)處理小鼠，或僅用CpG寡核苷酸(IOii g)或Pentarix蛋白(100 y g)處理小鼠,或留下小鼠未處理。用電子卡尺每2至4天測量腫瘤，并且數據顯示為每群內的個體小鼠隨時間的腫瘤體積(上部6幅圖)或群內所有小鼠的存活率(下部2幅圖)。當腫瘤體積超過約2，OOOmm3或當小鼠垂死或失去>20%體重時處死荷瘤小鼠，采用log秩次(曼特爾-考克斯)檢驗計算P值。圖1OA是示出響應于用完整的Pentarix蛋白加TLR3激動劑多聚(1:C)進行單次免疫接種而誘導的表位特異性⑶8+T細胞應答的圖。用IOOiig完整的可溶性Pentarix蛋白與IOy g多聚(1:C) (Amersham)混合對初次接受實驗的C57BL/6小鼠進行免疫接種。免疫后七天處死小鼠，通過IFN- y ELISP0T評估大量脾細胞制劑，以對示出的各種肽特異的CD8+T細胞的數目進行定量。結果報告為僅用介質或指定的肽(IOi1 g/ml)刺激后，每I X IO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目。圖10B-D是表示用完整的可溶性Pentarix蛋白加多聚(1:C)進行免疫接種誘導針對多個HPV基因型的免疫應答的圖。用IOOiig Pentarix蛋白結合10 y g多聚(1:C)對C57BL/6 (B)或HLA-A2/Db轉基因小鼠(C)連續4天每天進行免疫(s.c.)。免疫后八天處死小鼠，通過IFN- y ELISP0T分析大量(B和C)或CD4剔除的脾細胞制劑(僅B)(剔除后通過FACS分析測量，⑶4剔除為>99%)。用跨越整個Pentarix蛋白的覆蓋15聚體的肽組(重疊11個氨基酸)對大量脾細胞和CD4剔除的脾細胞制劑進行過夜刺激。D.僅用介質，或用最小肽表位HPV16E749_57，HPV31E749_57或不相關的對照肽(KAVYNFATM)對來自利用Pentarix蛋白結合IOiig多聚(1:C)進行免疫(s.c.)的C57BL/6小鼠的脾細胞進行過夜刺激，并通過IFN- y ELISP0T進行分析。結果報告為每I X IO6個脾細胞中IFN- y斑點形成細胞的數目，并代表3個這樣的實驗。圖11是示出響應于僅用完整的Pentarix蛋白(無佐劑)單次免疫或僅用4次連續日劑量的Pentarix蛋白(無佐劑)免疫而誘導的HPV16E749_57特異性⑶8+T細胞應答的圖。用PBS中的100 u g完整的可溶性Pentarix蛋白對初次接受實驗的C57BL/6小鼠進行I次或4次(第1-4天每天I次)免疫接種。免疫后七天處死小鼠,通過IFN-Y ELISP0T評估大量脾細胞制劑，以對HPV16E749_57特異性CD8+T細胞的數目進行定量。結果報告為僅用介質，用HPV16E749_57或不相關的陰性對照肽(每種為10 u g/ml)刺激后，每I X IO6個脾細胞中IFN-Y斑點形成細胞的數目。圖 12A-0 顯示分別來自 HPV16，HPV18, HPV31，HPV45，HPV52, HPV33, HPV35, HPV39,HPV51, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, HPV82 的 E7 蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NOs:1-15)和核苷酸序列(SEQ ID NOs:18-32)。圖12P-Q 顯示有(SEQ ID NO:16)和沒有(SEQ ID NO:17)氨基末端的 6XHis 親和標簽的Pentarix蛋白的氨基酸序列。圖12R-S 顯示有(SEQ ID NO:34)和沒有(SEQ ID NO:33)氨基末端的 6XHis 親和標簽的Pentarix蛋白的核苷酸序列。發明詳述
本發明一部分提供了人乳頭瘤病毒E7抗原的化合物和組合物。所述化合物和組合物可用于治療或診斷人乳頭瘤病毒感染和相關的疾病狀況。 在一些實施方案中，本發明的化合物和組合物可用于靶向多種HPV類型，例如，至少兩種或更多種HPV基因型，如高危型HPV。因此，本發明的化合物和組合物可以用于誘導針對一種或多種HPV類型的免疫應答，從所述HPV類型得到所述化合物或組合物所包含的HPV E7抗原，或與HPV E7抗原基本相同的序列。具有廣泛的人口覆蓋率的這些化合物和組合物在商業上可能是有用的，因為它們適用于更大的人群。人乳頭瘤病毒(HPV)“人乳頭瘤病毒”或“HPV”是指屬于一組100多種相關，但遺傳上為不同“類型”的病毒，大致可歸類為“低危”和“高危”。“低危”型 HPV 包括，但不限于，HPV 類型 HPVl I，HPV40, HPV42, HPV43, HPV44, HPV54,HPV61, HPV70, HPV72，和 HPV81。“高危”型 HPV 包括，但不限于，HPV16, HPV18, HPV31，HPV33，HPV35, HPV39, HPV45,HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 和 HPV82。HPV基因組通常是由蛋白質衣殼包圍的約7000-8000個堿基對的雙鏈環狀DNA。基因組具有編碼早期抗原E1-E7的早期(E)區和編碼結構性LI和L2衣殼蛋白的晚期(L)區。E6和E7蛋白是感染的細胞的轉化和永生化所需的，并且需要這些蛋白質的持續表達以維持細胞處于轉化狀態。有時，HPV DNA整合到宿主細胞的DNA中，并且這一過程與幾種病毒基因的喪失有關。例如，整合通常導致幾種早期(E2，E4和E5)和晚期(LI和L2)基因的缺失，留下E6和E7作為在被感染的細胞中持續表達的唯一病毒蛋白。HPV基因組序列已被描述，并且在不同的公共數據庫可獲得。這樣的序列，可以參見，例如，GenBank登錄號 02718 (HPV16)，X05015 (HPV18)，J04353 (HPV31)，M12732 (HPV33)，M62849 (HPV39)，X74479(HPV45)， NC_001533(HPV51), X74481(HPV52), X74483(HPV56), D90400(HPV58),NC_001635/X77858 (HPV59)，X67161 (HPV68)等。來自多種HPV類型的E7抗原的序列已被描述，并且在不同的公共數據庫可獲得。這樣的序列，可以參見，例如，GenBank 登錄號 NP_041326 (HPV16E7)，NP_040311 (HPV18E7)，AAA46951 (HPV31E7)，AAA46959(HPV33E7)，AAA46967 (HPV35E7)，AAA47051 (HPV39E7)，P21736 (HPV45E7) , P26558 (HPV51E7) , P3683I(HPV52E7)，P36833 (HPV56E7)，P26557 (HPV58E7) , CAA54850(HPV59E7) , P54668 (HPV68E7) , CAA63883(HPV73E7)和AAK28450 (HPV82E7)等。治療的適應癥本發明的化合物和組合物可用于治療HPV感染或與這樣的感染相關的疾病狀況。HPV感染已與多種疾病狀況相關，包括但不限于，尋常疣(或乳頭狀瘤)，癌癥等。在一般情況下，低危型HPV與尋常疣(或乳頭狀瘤)相關，而高危型HPV與癌癥相關。“癌”或“贅生物”是指任何不想要的沒有生理功能的細胞生長。在一般情況下，贅生物細胞從其正常的細胞分裂控制脫離，即其在細胞環境中的生長不受通常的生物化學和物理影響的細胞。在大多數情況下，贅生物細胞增殖形成良性或惡性的細胞克隆。癌或贅生物的例子包括，但不限于，轉化的和永生化的細胞，腫瘤，以及癌癥，例如乳腺細胞癌和宮頸癌。術語癌包括嚴格來說是良性的，但攜帶變成惡性的風險的細胞生長。“惡性”是指任何細胞類型或組織的異常生長。術語惡性包括嚴格來說是良性的，但攜帶變成惡性的風險的細胞生長。該術語還包括任何癌(cancer),癌癥(carcinoma),贅生物(neoplasm),瘤形成(neoplasia)或腫瘤(tumor)。
因此，“與HPV感染相關的疾病狀況”是指已經與現有的HPV感染的存在相關的任何疾病狀況、疾病或病癥，例如，已經與現有的高危HPV感染的存在相關的任何疾病狀況、疾病或病癥。在一些實施方案中，與HPV感染相關的疾病狀況包括宮頸、下生殖道或肛門生殖器道、皮膚或口腔的疾病狀況、疾病或病癥。在一些實施方案中，與HPV感染相關的疾病狀況包括宮頸、下生殖道或肛門生殖器道的惡性和/或癌前病變，例如，宮頸癌，肛門癌，外陰癌，陰道癌，會陰癌，陰莖癌等，或其癌前病變。在可替代的實施方案中，與HPV感染相關的疾病狀況包括肺癌，呼吸道癌，上皮細胞癌，頭頸癌，乳腺癌，口腔癌等，或其癌前病變。在可替代的實施方案中，與HPV感染相關的疾病狀況包括癌前非典型性增生的疾病狀況，例如癌前宮頸非典型性增生，宮頸上皮內瘤樣病變(CIN) I級，2級或3級，外陰上皮內瘤樣病變(VIN)，陰道上皮內瘤樣病變(VAIN)，肛門上皮內瘤樣病變(AIN)等。在一些實施方案中，本發明的化合物和組合物可用于診斷HPV感染。在可替代的實施方案中，包含序列 TSNYNIVTF (SEQ ID NO:35)，AEPDTSNYNIVTFCC (SEQ ID NO:36)或TSNYNIVTFCCQCKS (SEQ ID NO:37)中的一個或多個的肽可用于診斷HPV31感染，或用于確定包含HPV31E7序列的化合物對HPV31的免疫應答。另外，TSNYNIVTF, AEPDTSNYNIVTFCC或TSNYNIVTFCCQCKS中的一個或更多個序列可以用于排除HPV31感染。
HPV E7化合物，測試化合物，及其制備方法本發明的化合物包括，但不限于，包含來自不同HPV基因型的兩種或更多種HPVE7抗原的氨基酸序列的多肽，其類似物，變體，同系物和片段，以及編碼這些多肽的核酸分子。在一些實施方案中，所述兩種或更多種HPV E7抗原將能夠誘導針對它們所衍生自的不同HPV基因型的免疫應答，如T細胞CD8+應答。“蛋白”，“肽”或“多肽”是兩個或更多個氨基酸的任何鏈，包括天然存在的或非天然存在的氨基酸或氨基酸類似物，與翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)無關。本發明的“氨基酸序列”，“多肽”，“肽”或“蛋白”可包括具有異常鍵，交叉連接和端帽，非肽鍵或替代性的修飾基團的肽或蛋白。這些修飾也在本發明的范圍內。術語“修飾基團”意圖包括直接連接到肽結構的結構(例如，通過共價連接)，以及間接連接到肽結構的那些結構(例如，通過穩定的非共價結合，或共價連接到其它氨基酸殘基，或其模擬物，類似物或衍生物，所述氨基酸殘基，或其模擬物，類似物或衍生物可以位于核心肽結構側翼)。例如，修飾基團可被連接到肽結構的氨基末端或羧基末端，或被連接至核心結構域側翼的肽或肽模擬物區。或者，修飾基團可連接到肽結構中的至少一個氨基酸殘基的側鏈，或核心結構域側翼的肽或肽模擬物區(例如，通過賴氨酰殘基的e氨基基團，通過天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基，通過的酪氨酰殘基，絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基基團，或氨基酸側鏈上的其它合適的反應性基團)。共價連接到肽結構的修飾基團可以通過在本領域中公知的用于連接化學結構的工具和方法連接，包括，例如，酰胺基，烷基氨基，氨基甲酸酯或脲鍵。術語“核酸”或“核酸分子”包括兩個RNA (正負鏈)和DNA，所述DNA包括cDNA，基因組DNA和合成的(例如，化學合成的)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈。在單鏈的情況下，核酸可以是有義鏈或反義鏈。核酸分子，可以是兩個或更多個共價鍵合的核苷酸的任何鏈，包括天然存在的或非天然存在的核苷酸或核苷酸類似物或衍生物。“RNA”是指兩個或更多個共價鍵合的，天然存在的或修飾的核糖核苷酸的序列。該術語包括的修飾RNA的一個實例的是硫代磷酸酯RNA。“DNA”，是指兩個或更多個共價鍵合的，天然存在的或修飾的脫氧核糖核苷酸的序列。“cDNA”是指通過RNA依賴的DNA聚合酶(逆轉錄酶)的作用從RNA模板產生的互補的或拷貝的DNA。因此，“cDNA克隆”是指在克隆載體中攜帶的與目的RNA分子互補的雙鏈DNA序列。“互補”是指兩個核酸，如DNA或RNA，含有足夠數量的能夠形成Watson-Crick堿基對的核苷酸，從而在兩個核酸之間產生雙鏈區。因此，在DNA或RNA的一條鏈中的腺嘌呤與相對的互補DNA鏈中的胸腺嘧啶配對，或與相對的互補RNA鏈中的尿嘧啶配對。應當理解，不需要核酸分子中的每個核苷酸與相對的互補鏈中的核苷酸形成匹配的Watson-Crick堿基對，以形成雙鏈。如果在高嚴緊條件下核酸分子與第二核酸分子雜交，則所述核酸分子與另一核酸分子是“互補”的。本發明的核酸分子包括兩個互補的分子。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與來自不同的HPV類型的兩種或更多種E7抗原的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或編碼這類多肽的核酸分子，所述不同的 HPV 類型例如 HPV16，HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45,HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或 HPV82。在可替代的實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與來自不同的HPV類型的三種或更多種E7抗原的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或編碼這類多肽的核酸分子，所述不同的HPV類型例如HPV類型，如HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或 HPV82。在可替代的實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與來自不同的HPV類型的四種或更多種E7抗原的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或編碼這類多肽的核酸分子，所述不同的HPV類型例如HPV類型，如HPV16，HP18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或 HPV82。在可替代的實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與來自不同的HPV類型的五種或更多種E7抗原的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或編碼這類多肽的核酸分子，所述不同的HPV類型例如HPV16，HP18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39,HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 或 HPV82。在可替代的實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與來自不同的HPV類型的五種E7抗原的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或編碼這類多肽的核酸分子，所述不同的HPV類型例如HPV16，HPV18, HPV31, HPV45和HPV52。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:1-15中兩個或更多個所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:1-15中三個或更多個所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:1-15中四個或更多個所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:1-15中五個或更多個所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。例如，本發明的化合物 包括，但不限于，包含與SEQ ID NO: 16或17所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:18-32中兩個或更多個所示的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的核酸分子。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:18-32中三個或更多個所示的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的核酸分子。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:18-32中四個或更多個所示的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的核酸分子。在一些實施方案中，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:18-32中五個或更多個所示的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的核酸分子。例如，本發明的化合物包括，但不限于，包含與SEQ ID NO:33或34所示的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的核酸分子。“基本上相同”的序列是僅由一個或多個本文中所述的保守型取代或由一個或多個非保守型取代，缺失，或插入而不同于參照序列的氨基酸或核苷酸序列，所述非保守型取代、缺失或插入處于所述序列的不會破壞或基本上不會降低由所述氨基酸序列表示的、或由所述核酸分子編碼的多肽的T細胞識別和/或HLA結合的位置。當使用例如比對程序(Myers和Miller，CAB10S, 1989, 4:11-17)或FASTA在氨基酸或核苷酸水平上與用于比較的序列進行最佳比對時，這樣的序列可以是從50%至99%，或更通常地至少為50%，55% 或 60%，或至少 65%，75%, 80%, 85%, 90%,或 95%，或高達 96%，97%, 98%,或 99% —致的任何值。對于多肽，比較序列的長度可以是至少2，5，10，或15個氨基酸，或至少20，25，或30個氨基酸。在可替代的實施方案中，比較序列的長度可以是至少35，40，或50個氨基酸，或超過60，80，或100個氨基酸。對于核酸分子，比較序列的長度可以是至少為5，10，15，20，或25個核苷酸，或至少30個，40個，或50個核苷酸。在可替代的實施方案中，比較序列的長度可以是至少60，70，80，或90個核苷酸，或超過100，200，或500個核苷酸。序列同一丨I"生，可以很容易地使用公眾可用的序列分析軟件測量(Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin BiotechnologyCenter, 1710University Avenue, Madison, ffis.53705,或可從 National Library ofMedicine得到的BLAST軟件，或本文所述的軟件)。有用的軟件的實例包括程序Pile-up和PrettyBox。這種軟件通過指定與各種取代，缺失，置換和其它修飾的同源性程度而匹配相似的序列。可選地或另外，如果兩條核酸序列在高嚴緊條件下雜交，則它們可以是“基本相同的”。在一些實施方案中，高嚴緊條件例如是，允許與以下發生的雜交可比的雜交條件:使用長度為至少500個核苷酸的DNA探針，在含有0.5M的NaHPO4, pH值7.2，7%SDS，ImM EDTA和1%BSA(組分V)的緩沖液中，在65°C的溫度下雜交；或在含48%甲酰胺，4.8 X SSC，0.2MTris-Cl，pH值7.6，I XDenhardt溶液，10%硫酸葡聚糖和0.1%SDS的緩沖液中，在42° C的溫度下雜交。(這些是高嚴緊Northern或Southern雜交的典型條件)。雜交可進行約20至30分鐘的一段時間，或約2至6小時，或約10至15小時，或超過24小時或更長時間。高嚴緊雜交也依賴于分子生物學家進行的眾多技術的成功，如高嚴緊PCR，DNA測序，單鏈構象多態性分析以及原位雜交。與Northern和Southern雜交相反,這些技術通常用相對較短的探針進行(例如，對于PCR或測序，通常為約16個核苷酸或更長，對于原位雜交，為約40個核苷酸或更長)。在這些技術中所使用的高嚴緊條件是分子生物學領域的技術人員所公知的，并且它們的例子可以參見，例如，Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.，1998,通過引用將其并入本文。在一些實施方案中，本發明的化合物包括與天然HPV E7抗原序列基本上相同的化合物。因此，本發明化合物中使用的序列可包括與SEQ ID NO:1-34中的任何一個，或任何其它HPV E7序列基本上相同的序列。應該理解，單個E7抗原序列可以以任何順序存在于本發明化合物的氨基酸或核苷酸序列中，只要來自不同的HPV基因型的至少兩個或更多個E7抗原序列存在于單個分子中。在一些實施方案中，來自不同的HPV類型的3，4，5，6，7，8，9或10種或更多種不同的HPVE7抗原可以用于本發明的化合物中。示例性的HPV E7抗原序列排序包括在表I中所示的那些。表1:來自5種HPV類型的E7序列的示例性排列
權利要求
1.多肽，其包含與兩種或更多種人乳頭瘤病毒(HPV)E7抗原的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列，其中所述E7抗原選自至少兩種不同的HPV毒株。
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述不同的HPV毒株為高危毒株。
3.如權利要求2所述的多肽，其中所述高危毒株選自以下的兩種或更多種:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73和 HPV82。
4.如權利要求1所述的多肽，其中所述E7抗原選自5種不同的HPV毒株。
5.如權利要求4所述的多肽，其中所述5種不同的HPV毒株包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV45 和 HPV52。
6.如權利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:1-15所示的兩條或更多條氨基酸序列。
7.如權利要求6所述的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:1-5所示的氨基酸序列。
8.如權利要求7所述的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO: 16或17所示的氨基酸序列。
9.如權利要求6所述的多肽，其中所述多肽由這樣的核苷酸序列編碼，該核苷酸序列包含SEQ ID NO:18-32所示的兩條或更多條核苷酸序列。
10.如權利要求8所述的多肽，其中所述多肽由包含SEQID NO:33或34的核苷酸序列編碼。`
11.如權利要求1-10中任一項所述的多肽，其中所述多肽能夠誘導針對至少兩種不同HPV毒株的免疫應答。
12.核酸分子，其包含與兩種或更多種人乳頭瘤病毒(HPV)E7抗原的核苷酸序列基本上一致的序列，其中所述E7抗原選自至少兩種不同的HPV毒株。
13.如權利要求12所述的核酸分子，其中所述不同的HPV毒株為高危毒株。
14.如權利要求13所述的核酸分子，其中所述高危毒株選自以下的兩種或更多種:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73 和 HPV82。
15.如權利要求12所述的核酸分子,其中所述E7抗原選自5種不同的HPV毒株。
16.如權利要求15所述的核酸分子，其中所述5種不同的HPV毒株包括HPV16、HPV18、HPV3UHPV45 和 HPV52。
17.如權利要求12所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO:18-32所示的兩條或更多條核酸序列。
18.如權利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO:18-22所示的核酸序列。
19.如權利要求18所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO:33或34所示的核酸序列。
20.核酸分子，其編碼權利要求1-11中任一項所述的多肽。
21.表達載體,其包含權利要求12-20中任一項所述的核酸序列，所述核酸序列可操作地連接到允許所述核酸序列在宿主細胞中表達的序列。
22.宿主細胞，其包含權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21中所述的表達載體。
23.組合物，其包含權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞。
24.如權利要求23所述的組合物，其還包含載體。
25.如權利要求23或24所述的組合物，其還包含佐劑。
26.如權利要求25所述的組合物，其中所述佐劑包含Toll樣受體(TLR)激動劑。
27.如權利要求26所述的組合物，其中所述TLR激動劑為TLR3激動劑或TLR9激動劑。
28.如權利要求 27所述的組合物，其中所述TLR3激動劑為多聚(1:C)。
29.如權利要求27所述的組合物，其中所述TLR9激動劑為包含CpG的寡核苷酸。
30.如權利要求25所述的組合物，其中所述佐劑包括干擾素a、4_1BB受體的激動劑、⑶40受體的激動劑或抗⑶40抗體。
31.在有需要的個體中刺激免疫應答的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞。
32.治療或預防有需要的個體中與HPV感染相關的疾病狀況的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述與HPV感染相關的疾病狀況選自以下的一種或多種:乳腺癌、Hj頸癌、肛門癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、頭頸癌和肺癌，或以上的癌前病變。
34.如權利要求32所述的方法，其中所述與HPV感染相關的疾病狀況為癌前宮頸上皮內瘤變(CIN I至CIN III)或宮頸癌。
35.治療有需要的個體中HPV感染的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞。
36.如權利要求31-35中任一項所述的方法，其中所述HPV感染由高危型HPV引起。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述高危型HPV選自以下的一種或多種:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73和 HPV82。
38.如權利要求31-37中任一項所述的方法，其還包括給予佐劑。
39.如權利要求38所述的方法，其中所述佐劑包含Toll樣受體(TLR)激動劑。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述TLR激動劑為TLR3激動劑或TLR9激動劑。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述TLR3激動劑為多聚(1:C)。
42.如權利要求40所述的方法，其中所述TLR9激動劑為包含CpG的寡核苷酸。
43.如權利要求38所述的方法，其中所述佐劑包括干擾素a、4_1BB受體的激動劑、⑶40受體的激動劑或抗⑶40抗體。
44.如權利要求31-43中任一項所述的方法，其中所述給予包括在少于14天的時間范圍內多劑量的給藥。
45.如權利要求31-43中任一項所述的方法，其中所述給予包括在1-4天內多劑量的給藥。
46.如權利要求44或45所述的方法，其中所述給予包括多次日劑量的給藥。
47.有效量的權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞在有需要的個體中刺激免疫應答的用途。
48.有效量的權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞在有需要的個體中治療或預防與HPV感染相關的疾病狀況的用途。
49.如權利要求48所述的用途，其中所述與HPV感染相關的疾病狀況選自以下的一種或多種:乳腺癌、宮頸癌、肛門癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、頭頸癌和肺癌，或以上的癌前病變。
50.如權利要求48所述的用途，其中所述與HPV感染相關的疾病狀況為癌前宮頸上皮內瘤變(CIN I至CIN III)或宮頸癌。
51.有效量的權利要求1-11中任一項所述的多肽或權利要求12-20中任一項所述的核酸分子或權利要求21所述的表達載體或權利要求22所述的宿主細胞在有需要的個體中治療HPV感染的用途。
52.肽，其基本上由氨基酸序列TSNYNIVTF(SEQ ID NO:35)、AEPDTSNYNIVTFCC(SEQ IDNO:36)或 TSNYNIVTFCCQCKS(SEQ ID NO:37)中的一個或多個組成。
53.診斷HPV31感染的方法，其包括將樣品與肽接觸，所述肽基本上由氨基酸序列TSNYNIVTF(SEQ ID NO:35)、AE`PDTSNYNIVTFCC(SEQ ID NO:36)或TSNYNIVTFCCQCKS(SEQ IDNO:37)中的一個或多個組成。
54.確定個體對HPV31感染應答的方法，其包括將樣品與肽接觸，所述肽基本上由氨基酸序列 TSNYNIVTF (SEQ ID NO: 35)、AEPDTSNYNIVTFCC (SEQ ID NO:36)或TSNYNIVTFCCQCKS (SEQ ID NO:37)中的一個或多個組成。
全文摘要
本發明涉及用于治療人乳頭瘤病毒感染及相關疾病狀況的人乳頭瘤病毒E7抗原化合物和組合物。部分地，本發明提供多肽和核酸分子及其使用方法，所述多肽和核酸分子包含與兩種或更多種人乳頭瘤病毒(HPV)E7抗原的序列基本上一致的序列，其中所述E7抗原選自至少兩種不同的HPV毒株。
文檔編號C07K14/025GK103119168SQ201180043114
公開日2013年5月22日 申請日期2011年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者約翰·R·韋伯, 戴潤·阿恩·維克 申請人:不列顛哥倫比亞癌癥局分支機構