專利名稱：一種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于化學技術領域，涉及一種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產工藝，具體涉及一種將酪蛋白分步驟連續酶解制備酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的方法。
背景技術：
乳是哺乳動物乳腺的分泌產物，是一種營養十分豐富的生物液體。乳的營養價值，對人類和動物生長調節與免疫保護中的獨特功能以及各成分之間的合適比例，是新生哺乳動物最好的營養素。乳脂、乳糖和乳蛋白是乳的基本成份，牛乳中蛋白質含量約為3. 3% 3.5%，人乳中為1.4%。乳蛋白是一類營養全價的蛋白質，它種類多，含量豐富，分布廣泛。·乳蛋白主要有酪蛋白(casein, CN)和乳清蛋白(wheyprotein)兩大類，以及含量相對較少的乳脂肪球膜蛋白(MFGMP)。酪蛋白是乳腺上皮細胞合成的一組含有大量磷和鈣的蛋白質。在PH為4. 6，溫度為20°C的條件下，即可從脫脂乳中沉淀得到酪蛋白。釀蛋白是乳含量最豐富的蛋白質，占乳蛋白的76% 86，含有人體生長發育所必須的氨基酸。酪蛋白作為一種重要的營養物質，有著廣泛的用途，如用于酪蛋白活性肽的制備，食品的增稠劑和乳化劑等。目前為止，人們已從酪蛋白酶解物中發現了多種具有生物活性的功能肽，如酪蛋白抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽等等。但在目前報道中，都以某一功能肽為目標進行制備生產，沒有關于分步驟聯產4種活性肽的報道，對原料和能源造成極大的浪費。自1966年Katzir等人從凝乳酶酶解酪蛋白酶解產物中發現具有抗菌特性的物質以來，酪蛋白活性肽活性肽日趨成為乳品領域的研究熱點進展極為迅速。迄今為止，人們已經中發現了數十種具有重要生理功能的酪蛋白生物活性肽，它們具有廣泛而重要的生物學機能和機體調節功能。目前的專利報道中，湖北武漢的鄒遠東報道了“用復合蛋白酶酶解酪蛋白制得酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制備方法和用途”的專利；日本卡爾皮斯株式會社山本直之等人報道了“酪蛋白水解物及其生產過程與應用”，該專利涉及發明了一種含有在體內具有最低酶分解性的游離氨基酸及體內非分解性的肽的酪蛋白水解物，預計它能夠在活體內表現出諸如降血壓作用等功能；浙江工業大學的孟祥河等人發明了“一種酪蛋白糖巨肽的制備方法”;但目前并沒有聯產4種酪蛋白活性肽研究的報道。
發明內容
本發明的目的在于克服上述技術缺陷，提供一種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產工藝，本發明所聯產的4種活性肽，其中酪蛋白抗菌肽具有抗病毒、抗感染、抗寄生蟲、抗腫瘤等功能；酪蛋白磷酸肽(CPPs)具有促進鈣鐵鋅等礦物元素的吸收、抗齲齒、促進動物體外受精和增強機體免疫力等功能；酪蛋白酪啡肽具有鎮靜止痛、安眠和延遲胃排空時間，抑制腸道運轉消化物等生理作用；酪蛋白糖巨肽(CGMP)具有對益生菌的增殖作用、免疫調節作用和抑制病毒和細菌等附著的作用。其技術方案為
一種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產工藝，包括以下步驟1)酪蛋白抗菌肽的制備在97份lOOmg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，調節酶解液PH為8. 5，55°C恒溫水解2. 5h，之后使用分子量為3000和10000的超濾膜對水解液進行超濾，收集分子量3000-10000的酶水解液冷凍干燥即得到酪蛋白抗菌肽；2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制備取步驟I)中剩余的酶水解液繼續水解lh，在4°C條件下，10000r/min離心20min除去未水解的大分子物質和溶液中的雜質,沉淀收集備用，向上清液中加入10% (v/v)CaCl2和無水乙醇，使兩者在溶液中的終濃度分別為1%和50%,上清液室溫放置過夜，在4°C條件下，10000r/min離心20min，收集沉淀，用無水乙醇經過3次洗滌沉淀，最終沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)；3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制備取步驟I)和步驟2)中剩余的酶水解殘留物質，調節pH至I. 6使沉淀溶解,配制成為10mg/ml溶液,按照胃蛋白酶與酶解液質量比 I 100在溫度55°C、pH值為I. 6條件下水解2h，調節水解液pH為4. 6，4°C條件下，IOOOOr/min離心20min，取上清液備用，回調pH到7. 0，此時水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍體存在，其分子量為20000 40000之間，而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000，使用分子量為1000的超濾膜對上清液進行超濾分離，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的組分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的組分中，分別冷凍干燥兩種組分。步驟I)中以大腸桿菌為指示菌，測出其抑菌圈大小為19. 43mm，得率為18. 83Img/g°步驟2) CPPs 得率為 11. 41mg/g，氮磷比為 10.27。步驟3)中水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率為40. 13%，得率為1.693mg/g。^ -酪啡肽-5 含量 0. 0297mg/mg,得率為 0. 1257mg/g, ^ -酪啡肽-7 含量 0. 03054mg/mg,得率為 0. 1292mg/g。與現有技術相比，本發明的有益效果為本發明一種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產工藝，充分利用了酪蛋白酶和胃蛋白酶不同酶解條件，以及水解目的產物分子量不同的特點，分布水解得到抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽。各種功能肽的產率均較高，且各種性質和生物活性具有重現性和穩定性，彌補了已有生產工藝單一的不足。
圖I是蛋白抗菌肽在以大腸桿菌為指示菌株產生的抑菌圈；圖2是酪蛋白酪啡肽@ -酪啡肽-5和￠-酪啡肽-7的色譜圖；圖3是酪蛋白抗菌肽抑菌圖；圖4是驗證實驗酪蛋白抗菌肽抑菌圖；圖5是酪蛋白酪啡肽色譜圖；圖6是驗證實驗酪蛋白酪啡肽色譜圖。
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施方式
對本發明的制備方法作進一步詳細地說明。實施例I
I)酪蛋白抗菌肽的制備在97份100mg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，調節酶解液pH為8. 5，55°C恒溫水解2. 5h，之后使用分子量為3000和10000的超濾膜對水解液進行超濾，收集分子量3000-10000的酶水解液冷凍干燥即得到酪蛋白抗菌肽。以大腸桿菌為指示菌，測出其抑菌圈大小為19.43_，得率為18.831mg/g。蛋白抗菌肽在以大腸桿菌為指示菌株產生的抑菌圈如圖I所示。2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制備取步驟I)中剩余的酶水解液繼續水解lh，在4°C條件下，10000r/min離心20min除去未水解的大分子物質和溶液中的雜質,沉淀收集備用。向上清液中加入10% (v/v) CaCl2和無水乙醇，使兩者在溶液中的終濃度分別為I %和50%。上清液室溫放置過夜，在4°C條件下，10000r/min離心20min，收集沉淀，用無水乙醇經過3次洗滌沉淀，最終沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)，此時CPPs得率為11.41mg/g，氮磷比為10. 27。3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制備取步驟I)和步驟2)中剩余的酶水解殘留物質，調節pH至I. 6使沉淀溶解,配制成為10mg/ml溶液,按照胃蛋白酶與酶解液質 量比I : 100在溫度55°C、pH值為I. 6條件下水解2h，調節水解液pH為4. 6，4°C條件下，10000r/min離心20min，取上清液備用。回調pH到7. 0，此時水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍體存在，其分子量為20000 40000之間,而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000。使用分子量為1000的超濾膜對上清液進行超濾分離，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的組分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的組分中，分別冷凍干燥兩種組分。此時水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率為40. 13%，得率為1.693mg/g。P -酪啡肽_5含量0. 0297mg/mg，得率為0. 1257mg/g, ^ -酪啡肽-7含量0. 03054mg/mg，得率為0. 1292mg/g，色譜圖見圖2。實施例2I)酪蛋白抗菌肽的制備及檢測配制濃度lOOmg/mL的酪蛋白溶液，以胰蛋白酶在酶底比3%、溫度55°C、pH值為8. . 5條件下水解，水解2. 5h后，滅酶，經離心過濾、微濾去除未水解大分子物質，收集沉淀備用。上清液分別使用分子量為3000和10000的超濾管對水解液進行超濾，分離酪蛋白抗菌肽，據現有技術報道，酪蛋白抗菌肽分子量大于3000，故取分子量在3000-10000區間內的水解液冷凍干燥，測定其得率，以大腸桿菌為指示菌，驗證其抑菌性。利用水解2. 5h后分離出抗菌肽，冷凍干燥后各取Ig樣品溶于ImL蒸餾水(濃縮20倍)使用大腸桿菌驗證抑囷性。結果如表I、圖3和圖4所不。表I酪蛋白抗菌肽實驗結果
實驗平均抑菌圈直徑(mm)每克酷蛋白中抗菌狀得率(mg/g)聯產實驗19.43188.31 驗證實驗 19.17 182.252)酪蛋白磷酸肽的制備水解3. 5h時，采用乙醇沉淀法分離出酪蛋白磷酸肽。并使用旋轉蒸發儀回收水解液中的乙醇。收集收集水解產生的酪蛋白磷酸肽冷凍干燥，計算其得率，測定其中氮含量、磷含量以及氮磷比。水解3. 5h后分離出酪蛋白磷酸肽，冷凍干燥，測定其中的氮元素、磷元素以及氮磷比的值。結果如表2所示。表2酪蛋白磷酸肽測定結果
權利要求
1.ー種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產エ藝，其特征在于，包括以下步驟1)酪蛋白抗菌肽的制備在97份100mg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，調節酶解液PH為8. 5，55°C恒溫水解2. 5h，之后使用分子量為3000和10000的超濾膜對水解液進行超濾，收集分子量3000-10000的酶水解液冷凍干燥即得到酪蛋白抗菌肽； 2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制備取步驟I)中剩余的酶水解液繼續水解lh，在4°C條件下，10000r/min離心20min除去未水解的大分子物質和溶液中的雜質,沉淀收集備用，向上清液中加入10% (v/v)CaCl2和無水こ醇，使兩者在溶液中的終濃度分別為1%和50%，上清液室溫放置過夜，在4°C條件下，10000r/min離心20min,收集沉淀,用無水こ醇經過3次洗滌沉淀，最終沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)； 3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制備取步驟I)和步驟2)中剰余的酶水解殘留物質，調節pH至I. 6使沉淀溶解,配制成為10mg/ml溶液,按照胃蛋白酶與酶解液質量比I 100在溫度55°C、pH值為I. 6條件下水解2h，調節水解液pH為4. 6，4°C條件下，IOOOOr/min離心20min，取上清液備用，回調pH到7. 0，此時水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍體存在，其分子量為20000 40000之間，而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000，使用分子量為1000的超濾膜對上清液進行超濾分離，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的組分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的組分中，分別冷凍干燥兩種組分。
2.根據權利要求I所述的聯產エ藝，其特征在于，步驟I)中以大腸桿菌為指示菌，測出其抑菌圈大小為19. 43mm，得率為18. 831mg/g。
3.根據權利要求I所述的聯產エ藝，其特征在于，步驟2)CPPs得率為11.41mg/g，氮磷比為10. 27。
4.根據權利要求I所述的聯產エ藝，其特征在于，步驟3)中水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率為40. 13%，得率為1.693mg/g，P -酪啡肽_5含量0. 0297mg/mg，得率為.0.1257mg/g，^ -酪啡肽-7 含量 0. 03054mg/mg，得率為 0. 1292mg/g。
全文摘要
本發明公開了一種酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的聯產工藝，包括以下步驟1)酪蛋白抗菌肽的制備；2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制備；3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制備。本發明充分利用了酪蛋白酶和胃蛋白酶不同酶解條件，以及水解目的產物分子量不同的特點，分布水解得到抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽。各種功能肽的產率均較高，且各種性質和生物活性具有重現性和穩定性，彌補了已有生產工藝單一的不足。
文檔編號C07K1/30GK102732590SQ20121021873
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者代斌, 張良, 杜軍, 章華, 胡莉莉, 袁永俊 申請人:西華大學