專利名稱：一種合成利那洛肽的方法
技術領域：
本發明涉及醫藥合成領域，具體涉及一種合成利那洛肽的方法。
背景技術：
利那洛肽(Linaclotide)是一種新型GC-C (腸上皮細胞尿苷酸環化酶C)受體激動劑，該化合物為14個氨基酸組成的多肽，通過固相合成技術得到。利那洛肽可激活腸上皮細胞頂端表面的GC-C受體，導致細胞內和細胞外環鳥苷酸增多。其凈效應是氯和碳酸氫鹽分泌進入腸腔增加，進而導致液體分泌增多以及大便通過加速，用于治療成人慢傳輸型便秘和便秘型腸易激綜合征(IBS-C)患者，結構序列為NH2-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-COOH (3 對 二硫鍵為 1-6、2-10、5-13)。關于利那洛肽的制備方法，國內外均沒有專利報道，僅有Miriam等人發表一篇文獻嘗試了利那洛妝的合成(Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of theCysteine-Rich Pertide Linaclotide, Published online 4 August 2010 in WileyOnline Library)。文獻中分別采用了三種方法進行合成(I)采用Trt為Cys保護基固相合成線性粗肽，然后在液相中室溫一步氧化得到利那洛肽；(2)分別采用Trt，Acm為Cys保護基固相合成線性粗肽，然后采用半選擇性策略完成二硫鍵的合成；(3)分別采用Mmt，Acm, Trt或Acm, Trt, pMeOBzlm為Cys保護基固相合成線性粗肽,然后采用完全選擇性策略完成二硫鍵的合成。但是，方法2、3使用了多種側鏈脫除和氧化試劑，每一個步驟必然帶來雜質的增多，因此不利于得到高純度，高收率的產物，也不利于工藝的放大。方法I雖然過程步驟簡單，只使用了一種保護基保護半胱氨酸側鏈巰基，但是半胱氨酸側鏈保護基的選擇是影響利那洛肽合成的關鍵因素之一，方法I選用的Trt保護基不利于利那洛肽線性粗肽純度的提高，造成線性粗肽純度較低，往往需要純化才能進行利那洛肽3對二硫鍵的環化，不利于大規模生產。此外，方法I在最后一步的氧化形成利那洛肽粗品過程中，采用GSH (還原性谷胱甘肽)氧化體系進行3對二硫鍵的環化，但是該氧化體系不能準確定位3對二硫鍵的位置，極易造成大量雜質的產生，造成利那洛肽粗品純度較低，不利于后續的純化和總收率。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種合成利那洛肽的方法，使得本發明所述方法能夠提高利那洛肽線性粗肽純度以及利那洛肽粗品純度和總收率。為實現上述目的，本發明提供如下技術方案一種合成利那洛肽的方法，包括以下步驟步驟I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr側鏈上、Cys側鏈上、Asn側鏈上、Tyr側鏈上、Glu側鏈上偶聯有保護基以及在C端偶聯有樹脂固相載體的利那洛肽樹脂，所述Cys側鏈上偶聯的保護基為Mmt保護基；
步驟2、利那洛肽樹脂裂解脫除所有保護基和樹脂固相載體得到利那洛肽線性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化體系對利那洛肽線性粗肽進行氧化反應，按照其N端到C端的氨基酸順序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫鍵、第2位Cys和第10位Cys的二硫鍵以及第5位Cys和第13位Cys的二硫鍵得到利那洛肽粗品，純化后即得利那洛肽。其中，所述樹脂固相載體優選為王樹脂，更優選為替代度為I. Ommol/g的王樹脂。GSH/GSSH氧化體系所指為還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSH)聯合使用的氧化體系。本發明采用一步氧化方法制備利那洛肽，避免了不同氧化方法帶來的雜質。同時，本發明采用Mmt作為Cys的側鏈保護基團能夠極大的提高線性粗肽的純度，使線性粗肽不經過純化直接應用于下一步的氧化過程中。而且，采用GSH/GSSH體系能夠極大的降低線性粗肽中的雜質，有利于下一步純化過程。在本發明所述方法中，以利那洛肽線性主鏈N端到C端的氨基酸順序編號，如下式 NH2-Cysl-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cysi0-Thrll-Gly12-Cys13-Tyr14-C00HSEQ ID NO: I所示氨基酸序列即為上式中多肽序列，本發明在步驟I中固相合成的利那洛肽樹脂是在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列基礎上，在其N端、、Thr側鏈上、Cys側鏈上、Asn側鏈上、Tyr側鏈上、Glu側鏈上偶聯有保護基以及在C端偶聯有樹脂固相載體。本發明所述保護基是在氨基酸合成領域常用的保護氨基酸主鏈以及側鏈上氨基、羧基、巰基等干擾合成的基團的保護基團，防止氨基、羧基、巰基等在制備目標產物過程中發生反應，生成雜質。對于利那洛肽的合成，其Cys側鏈保護基的選擇關系著利那洛肽線性粗肽的純度，保護基隨意的選擇有可能造成利那洛肽線性粗肽的純度較低，如文獻“Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide,Published online 4 August 2010 in Wiley Online Library” 中公開的第一種方法，按照其記載的方法，所得到的利那洛肽線性粗肽的純度僅為40%左右，可見要提高利那洛肽線性粗肽純度，需要在深入研究利那洛肽合成的基礎上，付出創造性勞動，方可找到合適的Cys側鏈保護基。而對于其余需要保護側鏈的氨基酸，本發明優選通過Trt保護基保護Asn的側鏈；通過OtBu保護基保護Glu的側鏈；通過tBu保護基保護Tyr、Thr的側鏈。作為優選方案，步驟I具體為在活化體系存在下，將N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有tBu保護基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu)-0H)與樹脂固相載體偶聯后脫Fmoc保護基得到H-Tyr (tBu)-樹脂固相載體，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯有Fmoc保護基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有tBu保護基的Thr (Fmoc-Thr (tBu)-0H)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶聯有 Fmoc 保護基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶聯有Fmoc保護基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Trt保護基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、兩個N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有tBu保護基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -OH)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有OtBu保護基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、兩個N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)進行延伸偶聯，偶聯完后脫除Fmoc保護基，得到利那洛肽樹脂(H-Cys(Mmt)-Cys (Mmt)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Cys (Mmt)-Cys (Mmt)-Asn (Trt)-Pro-Ala-Cys(Mmt) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Mmt) -Tyr (tBu)-樹脂固相載體)。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優選方案中，所述延伸偶聯是指在第一個氨基酸與固相載體偶聯后，剩余氨基酸按照各自序列的順序逐個和前一個偶聯的氨基酸發生縮合反應(主鏈氨基和羧基的縮合反應)進行偶聯。在延伸偶聯中，由于每個氨基酸N端都有保護基，因此需要先脫除N端保護基再偶聯，這對本領域技術人員來說是公知常識，本發明優選用DBLK脫除N端保護基。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優選方案中，進一步優選，所述H-Tyr (tBu)-樹脂固相載體替代度為O. 4-0. 62mmol/g,最優選為O. 5mmol/g。 在上述固相合成利那洛肽樹脂的優選方案中，進一步優選，所述活化體系為HOBt/DMAP/DIP⑶I三體系活化體系或HOBt/DIP⑶I雙體系活化體系。對于這些多體系的活化體系，其各組分的配比在本領域中是一定的且是公知的，如HOBt/DMAP/DIPCDI三體系活化體系，HOBt:DMAP:DIPCDI 的摩爾比為 12:1:12 ;H0Bt/DIPCDI 雙體系活化體系，HOBt:DIPCDI 的摩爾比為1:1。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優選方案中，進一步優選，所述活化體系采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種溶解，更優選為，采用體積比DMF = DCM為I: I的混合溶劑溶解。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優選方案中，進一步優選，所述樹脂固相載體為王樹脂，更優選為替代度為I. Ommol/g的王樹脂。作為優選，步驟2所述GSH/GSSH氧化體系中GSH和GSSH的摩爾比為5:1-15:1，更優選為10:1，步驟2所述氧化反應的pH值為7. 8-8. O,更優選為7. 9，步驟2所述氧化反應的溫度為0-30°C，更優選為5°C。作為優選，步驟2所述裂解采用由體積百分比為90-95%的TFA、2_4%的TIS和余量水組成的裂解液裂解，更優選為采用由體積百分比為94%的TFA、3%的TIS和3%的水組成的裂解液裂解。作為優選，所述裂解液和利那洛肽樹脂的體積質量比為IOml :lg。本發明所述純化可以采用本技術領域常規純化方法，如HPLC純化方法。由本發明所述方法合成的利那洛肽線性粗肽經HPLC檢測，純度介于75-80%，利那洛肽粗品純度為35-60%，總收率為11_27%，而在相同環境下利用文獻“OptimizedFmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide, Publishedonline 4 August 2010 in Wiley Online Library”中公開的第一種方法合成，其合成的利那洛肽線性粗肽經HPLC檢測，純度為40%左右，利那洛肽粗品純度為20%左右，總收率不到10%,明顯不如本發明所述方法。由以上技術方案可知，本發明所述方法采用Mmt保護基保護半胱氨酸側鏈，采用逐一偶聯方式合成利那洛肽線性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化體系氧化得到利那洛肽。本發明所述方法與現有方法相比，提高了線性粗肽純度，可不經純化即可進行氧化，且所獲得利那洛肽粗品純度和收率也顯著提高。
具體實施例方式本發明公開了一種合成利那洛肽的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的的化合物和制備方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。在本發明具體實施方式
中，所有偶聯由保護基的氨基酸均可通過市售獲得，本發明中的保護氨基酸購自于吉爾生化有限公司，所用王樹脂購自于天津南開和成有限公司，申請文件中所用英文縮寫對應的中文含義見表I。表I英文縮寫釋義
權利要求
1.一種合成利那洛肽的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr側鏈上、Cys側鏈上、Asn側鏈上、Tyr側鏈上、Glu側鏈上偶聯有保護基以及在C端偶聯有樹脂固相載體的利那洛肽樹月旨，所述Cys側鏈上偶聯的保護基為Mmt保護基； 步驟2、利那洛肽樹脂裂解脫除所有保護基和樹脂固相載體得到利那洛肽線性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化體系對利那洛肽線性粗肽進行氧化反應，按照其N端到C端的氨基酸順序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫鍵、第2位Cys和第10位Cys的二硫鍵以及第5位Cys和第13位Cys的二硫鍵得到利那洛肽粗品，純化后即得利那洛肽。
2.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟I具體為 在活化體系存在下，將N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有tBu保護基的Tyr(Fmoc-Tyr (tBu) -0H)與樹脂固相載體偶聯后脫Fmoc保護基得到H-Tyr (tBu)-樹脂固相載體，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個將N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯有Fmoc保護基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有tBu保護基的Thr (Fmoc-Thr (tBu) -0H), N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶聯有 Fmoc 保護基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶聯有Fmoc保護基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Trt保護基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、兩個N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有tBu保護基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -0H)、N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有OtBu保護基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、兩個N端偶聯有Fmoc保護基以及側鏈偶聯有Mmt保護基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)進行延伸偶聯，偶聯完后脫除Fmoc保護基，得到利那洛肽樹脂(H-Cys(Mmt)-Cys (Mmt)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Cys (Mmt)-Cys (Mmt)-Asn (Trt)-Pro-Ala-Cys(Mmt) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Mmt) -Tyr (tBu)-樹脂固相載體)。
3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述H-Tyr(tBu)-樹脂固相載體替代度為O.4-0. 62mmol/g0
4.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述活化體系為HOBt/DMAP/DIPCDI三體系活化體系或HOBt/DIP⑶I雙體系活化體系。
5.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述活化體系采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種溶解。
6.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述樹脂固相載體為王樹脂。
7.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述GSH/GSSH氧化體系中GSH和GSSH的摩爾比為5:1-15:1。
8.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述氧化反應的pH值為7.8-8. O。
9.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述氧化反應的溫度為0-30°C。
10.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述裂解采用由體積百分比為90-95%的TFA、2-4%的TIS和余量水組成的裂解液裂解。
全文摘要
本發明涉及醫藥合成領域，公開了一種合成利那洛肽的方法。本發明所述方法固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、Thr側鏈上、Cys側鏈上、Asn側鏈上、Tyr側鏈上、Glu側鏈上偶聯有保護基以及在C端偶聯有樹脂固相載體的利那洛肽樹脂，裂解脫除保護基和樹脂固相載體后用GSH/GSSH氧化體系進行氧化反應，得到利那洛肽粗品，純化后即得利那洛肽。本發明所述方法采用Mmt保護基保護半胱氨酸側鏈，用逐一偶聯方式合成利那洛肽線性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化體系氧化得到利那洛肽，與現有方法相比，提高了線性粗肽純度，可不經純化即可進行下步氧化步驟，且所獲得利那洛肽粗品純度和收率也顯著提高。
文檔編號C07K1/04GK102875655SQ20121037524
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者宓鵬程, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司