纖維糊精和β-D-葡萄糖的增強型發酵的制作方法
【專利摘要】本發明提供用于發酵纖維糊精和β-D-葡萄糖的組合物和方法。提供宿主細胞和具有葡萄糖酶活性的重組多肽。此外，還提供用于在含纖維糊精和β-D-葡萄糖的混合物的發酵過程中，提高細胞生長、化學品產量、以及在含纖維糊精和β-D-葡萄糖的消耗的方法。
【專利說明】纖維糊精和β-D-葡萄糖的增強型發酵
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年I月21日提交的臨時申請61/435，216的權益，其全部內容通過參考引入此處。
【技術領域】
[0003]本發明涉及纖維糊精和β-D-葡萄糖的發酵。具體地，本發明涉及用于纖維糊精和β -D-葡萄糖的發酵的組合物，該組合物包括重組多肽和含有重組核苷酸和多肽的宿主細胞，以及其使用方法。本發明還涉及用于纖維糊精和β-D-葡萄糖的發酵的方法。
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【背景技術】
[0006]由于對能源安全，可持續發展和全球氣候的改變逐漸關心，人們以開始對生物能源的深入研究。人們認為將植物基材料生物轉化至生物燃料是化石燃料的化學生產的有吸引力的替換。
[0007]纖維素，植物的主要成分和地球上最豐富的有機化合物之一，是一種由β (1-4)連接的D-葡萄糖分子的長鏈構成的多糖。由于其糖基組合物，纖維素是用于生產生物燃料的豐富的潛在源材料。例如`，糖可以被發酵成生物燃料，例如乙醇。為了使纖維素內的糖用于生產生物燃料，必須將纖維素分解成更小的分子。
[0008]纖維素可通過纖維素酶的作用而酶解。纖維素酶包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、和β-葡聚糖苷酶。纖維素酶的作用分開纖維素內的1-4 β-D-糖苷鍵，并導致β-D-葡萄糖分子的最終釋放。在纖維素分解為單個糖分子時，可形成不同長度的葡萄糖聚合物，作為中間分解產物。長度約為2-6個分子的葡萄糖聚合物來源于纖維素的水解，稱為“纖維糊
ο
[0009]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),也稱為面包酵母，已經幾千年來用于將己糖生物轉化為乙醇。它也是使用最廣泛的微生物，用于將D-葡萄糖發酵成乙醇的大規模工業化的生產中。釀酒酵母是非常合適的候選者，用于將植物基生物質生物轉化為生物燃料。它具有研究的非常好的遺傳學和生理學背景，充分的遺傳工具，和對高濃度乙醇的耐受性高。釀酒酵母的低的發酵pH還可以防止發酵過程中的細菌污染。
[0010]近年來，證明了利用釀酒酵母對存在于纖維素水解物中的混合糖進行共同發酵的新方略(Ha et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.108:504-509, 2011 ;Li et al., Mol.Biosyst.6(11):2129-2132, 2010)。這種方法不僅便于纖維二糖和木糖的同時共發酵，而且由于纖維二糖和木糖共發酵的協同作用提高了乙醇的產率和產量。與葡萄糖發酵相比，由工程釀酒酵母(engineered S.cerevisiae)通過細胞內的水解進行的纖維二糖的發酵具有幾個優點。首先，纖維二糖可以與其他糖例如木糖或半乳糖被共同消耗，而不受到葡萄糖的阻遏作用。第二，纖維二糖和其他糖的共同使用可提高總的生產率。第三，不需要昂貴的β-葡萄糖苷酶使完整的纖維素降解至葡萄糖。
[0011]除了上述優點，該纖維二糖的消耗率遠遠低于葡萄糖的消耗率。此外，在纖維二糖發酵過程中，在培養基中會積累有少量的葡萄糖和纖維糊精纖維三糖和纖維四糖。當細胞內的纖維二糖和葡萄糖的濃度高時，由于β-葡萄糖苷酶的轉糖基作用的活性產生纖維三糖和纖維四糖。這些觀察表明對于工程釀酒酵母的纖維二糖的發酵效率可能存在未知的限制步驟。
[0012]本文公開了利用微生物的、用于纖維糊精和β -D-葡萄糖分子的發酵的改進的組合物和方法。
【發明內容】
[0013]本發明的一些實施例滿足該要求，提供具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽、含有編碼具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的重組DNA的宿主細胞，以及它們的生產方法和使用。本發明的一些實施例滿足該要求，提供用于纖維糊精和β-D-葡萄糖分子的發酵的方法，用于提高化學品的產量的方法，和用于提高細胞生長率的方法。
[0014]在一個實施例中，本發明提供宿主細胞，該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA，和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，其中當在含有纖維二糖的培養基中生長時，該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子。
[0015]在另一個實施例中，本發明提供宿主細胞，該宿主細胞含有編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA，和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，其中當在含有纖維二糖的培養基中生長時，該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子，其中該宿主細胞還包括編碼一種或多種葡萄糖苷酶的重組DNA。
[0016]在另一個實施例中，本發明提供宿主細胞，該宿主細胞含有編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA，和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，其中當在含有纖維二糖的培養基中生長時，該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子，其中具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0017]在另一個實施例中，本發明提供宿主細胞，該宿主細胞含有編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA，和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，其中當在含有纖維二糖的培養基中生長時，該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子，其中具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0018]在另一個實施例中，本發明提供用于發酵含纖維二糖的混合物的方法，該方法包括將該含纖維二糖的混合物與宿主細胞接觸，其中該宿主細胞含有編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，其中當在含有纖維二糖的培養基中生長時，該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子；并在支持發酵的條件下孵化該宿主細胞。
[0019]在另一個實施例中，本發明提供用于發酵含纖維二糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞含有編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相t匕，細胞對纖維二糖消耗的增加。
[0020]在另一個實施例中，本發明提供用于發酵含纖維二糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，所述細胞對纖維二糖消耗的增加，其中該宿主細胞還包括編碼一種或多種β_葡萄糖苷酶的重組DNA。
[0021]在另一個實施例中，本發明提供用于發酵含纖維二糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，所述細胞對纖維二糖消耗的增加，其中具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ IDNOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0022]在另一個實施例中，本發`明提供用于發酵含纖維二糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，細胞對纖維二糖消耗的增加，其中具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ IDNOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0023]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品的產量的增加。[0024]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品的產量的增加，其中該宿主細胞還包括編碼一種或多種β_葡萄糖苷酶的重組 DNA。
[0025]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0026]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID N0s:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0027]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇。
[0028]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該宿主細胞還包括編碼一種或多種β_葡萄糖苷酶的重組DNA。[0029]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQID NOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0030]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQID NOs:28-32的氨基酸序列 的多肽。
[0031]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該醇選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇。
[0032]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該醇選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇，其中該宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的重組DNA。
[0033]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該醇選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0034]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為醇，該醇選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0035]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為萜類化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有機酸。
[0036]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋`酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為萜類化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有機酸，其中該宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的重組DNA。
[0037]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為萜類化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有機酸，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0038]在另一個實施例中，本發明提供用于提高化學品的產量的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的化學品產量的增加，其中該化學品為萜類化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有機酸，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0039]在另一個實施例中，本發明提供用于提高細胞生長率的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的生長率的提聞。
[0040]在另一個實施例中，本發明提供用于提高細胞生長率的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的生長率的提高，其中該宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的重組DNA。
[0041]在另一個實施例中，本發明提供用于提高細胞生長率的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的生長率的提高，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19,21,和23的氨基酸序列的多肽。
[0042]在另一個實施例中，本發明提供用于提高細胞生長率的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;并在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞的生長率的提高，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0043]用于發酵含β -D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括將含β -D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸，將含β -D-葡萄糖的混合物與細胞接觸，其中含β-D-葡萄糖的混合物與細胞的接觸伴隨著或者在含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸之后；并在支持發酵的條件下孵化該細胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽的接觸導致，與含β -D-葡萄糖的混合物未與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸的情況相比，在發酵時該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物消耗的增加。
[0044]用于發酵含β -D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括將含β -D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸，將含β -D-葡萄糖的混合物與細胞接觸，其中含β-D-葡萄糖的混合物與細胞的接觸伴隨著或者在含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸之后；并在支持發酵的條件下孵化該細胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽的接觸導致，與含β -D-葡萄糖的混合物未與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸的情況相比，在發酵時該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物消耗的增加，其中該含β -D-葡萄糖的混合物通過纖維素的水解而獲得。
[0045]用于發酵含β -D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括將含β -D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸，將含β -D-葡萄糖的混合物與細胞接觸，其中含β-D-葡萄糖的混合物與細胞的接觸伴隨著或者在含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸之后；并在支持發酵的條件下孵化該細胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽的接觸導致，與含β -D-葡萄糖的混合物未與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸的情況相比，在發酵時該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物消耗的增加，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19,21,和23的氨基酸序列的多肽。
[0046]用于發酵含β -D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括將含β -D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種 重組多肽接觸，將含β -D-葡萄糖的混合物與細胞接觸，其中含β-D-葡萄糖的混合物與細胞的接觸伴隨著或者在含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸之后；并在支持發酵的條件下孵化該細胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽的接觸導致，與含β -D-葡萄糖的混合物未與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸的情況相比，在發酵時該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物消耗的增加，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
[0047]用于發酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物的消耗的增加。
[0048]用于發酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物的消耗的增加，其中該含β -D-葡萄糖的混合物通過纖維素的水解而獲得。
[0049]用于發酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞對含β-D-葡萄糖的混合物的消耗的增加，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ IDNOs: 17, 19，21，和23的氨基酸序列的多肽。
[0050]用于發酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，該方法包括提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA，在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致與缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞對含β-D-葡萄糖的混合物的消耗的增加，其中該具有變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ IDNOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
`[0051]在另一個實施例中，本發明提供含有編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA，和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組DNA的宿主細胞，其中當在含纖維二糖的培養基中生長時，該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子，其中該具有葡萄糖變旋酶活性的多肽含有一種或兩種SEQ ID NO: 28和29的氨基酸序列。在一些方面，該具有葡萄糖變旋酶活性的多肽含有SEQ ID NOs: 28和29的氨基酸序列。在一些方面，該宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的重組DNA。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052]圖1展示了五種不同醛糖1-表異構酶的過表達對纖維二糖在工程釀酒酵母親本菌株D452-BT中的利用的影響。該工程釀酒酵母在多復制質粒PRS423中表達重組纖維糊精轉運子、β_葡萄糖苷酶、和醛糖1-表異構酶基因，如圖例所示。該醛糖1-表異構酶基因和源生物(source organism)為:galM(大腸桿菌)；GAL10_Sc (釀酒酵母,系統名稱YBR019C) ; GALlO-Ps (樹干畢赤酵母)；YHR210C (釀酒酵母，系統名稱 YHR210C) ;YNR071C (釀酒酵母，系統名稱YNR071C)。該對照生物表達重組纖維糊精轉運子和β -葡萄糖苷，且包括空PRS423質粒。利用過表達該不同醛糖1-表異構酶的釀酒酵母發酵含纖維二糖的培養基，并測定每個菌株的纖維二糖的消耗量(左側面板；以g/升測量)，細胞生長(中間面板；測量600nm處的光密度)，和乙醇產量(右側面板；以g/升測量)。
[0053]圖2展示了含有纖維二糖的培養基發酵過程中，乙醇產率、乙醇生產率，和乙醇濃度的比較，其中含纖維二糖的培養基的發酵通過在多復制質粒PRS423中表達重組纖維糊精轉運子、β -葡萄糖苷酶、和醛糖1-表異構酶基因的釀酒酵母進行。該醛糖1-表異構酶基因和源生物為=GALlO-Sc (釀酒酵母，系統名稱YBR019C) ; YHR210C (釀酒酵母，系統名稱YHR210C);和YNR071C (釀酒酵母，系統名稱YNR071C)。
[0054]圖3展示了釀酒酵母GAL10/YBR019C的過表達對由釀酒酵母進行的纖維二糖的發酵的影響。通過表達重組纖維糊精轉運子的對照釀酒酵母和過表達GAL10/YBR019C、重組纖維糊精轉運子、和β -葡萄糖苷酶的釀酒酵母發酵含有纖維二糖的培養基，并測定兩種菌株的細胞生長(左側面板；測量600nm處的光密度)；纖維二糖的消耗(中間面板；以g/升測量)，和乙醇產量(右側面板；以g/升測量)
[0055]圖4展示了兩種不同的醛糖1-表異構酶的過表達對纖維二糖在工程釀酒酵母親代菌株SLOl中利用的影響。該工程釀酒酵母在多復制質粒PRS424中表達重組纖維糊精轉運子，β-葡萄糖苷酶，和醛糖1-表異構酶基因，如圖例所示。該醛糖1-表異構酶基因和源生物為:scAEP (釀酒酵母，系統名稱YHR210C)和ncAEP (粗糙脈孢菌，系統名稱NCU09705)。該對照生物表達重組纖維糊精轉運子和葡萄糖苷酶，并包含空PRS424質粒。通過過表達不同醛糖1-表異構酶的釀酒酵母發酵含有纖維二糖的培養基，并測量每個菌株的細胞生長(面板左上角；測量600nm處的光密度)，纖維二糖的消耗(面板右上角；測量每升的纖維二糖的克數)，葡萄糖的濃度(面板左下角；測量每升葡萄糖的克數)，和乙醇產量(面板右下角；測量每升乙醇的克數)。
[0056]圖5展示了從釀酒酵母敲除兩種醛糖1-表異構酶基因時，釀酒酵母對纖維二糖的利用的影響。釀酒酵母含有三種假定醛糖1-表異構酶基因:YBR019C，YHR210C，和YNR071C。制備敲除YHR210C和YNR071C的以及敲除YBR019C和YHR210C基因的釀酒酵母SLOl菌株。圖例所示的不同的菌株為:“ Δ (YHR+YNR) ” (YHR210C和YNR071C敲除)，“ Δ (YHR+GAL10) ” (YHR210C和YBRO19C敲除)，和“對照組”(未敲除醛糖1-表異構酶)。利用釀酒酵母醛糖1-表異構`酶敲除菌株發酵含纖維二糖的培養基，測量每個菌株的細胞生長(頂部面板；測量600nm處的光密度)；纖維二糖的消耗(中間面板；測量每升的纖維二糖的克數)，和乙醇產量(底部面板；測量每升乙醇的克數)。
[0057]圖6展示了從釀酒酵母敲除一種醛糖1-表異構酶基因時，釀酒酵母對纖維二糖的利用的影響。釀酒酵母含有三種假定醛糖1-表異構酶基因:YBR019C，YHR210C,和YNR071C。制備敲除一種假定醛糖1-表異構酶基因的釀酒酵母SLOl菌株。圖例所示的不同的菌株為:Δ YHR(YHR210C 敲除)，Δ GALlO (YBR019C 敲除)，Δ YNR(YNR071C 敲除)，和“對照組”(未敲除醛糖1-表異構酶)。利用釀酒酵母醛糖1-表異構酶敲除菌株發酵含纖維二糖的培養基，測量每個菌株的細胞生長(頂部面板；測量600nm處的光密度);纖維二糖的消耗(中間面板；測量每升的纖維二糖的克數)，和乙醇產量(底部面板；測量每升乙醇的克數)。
[0058]圖7展示了利用含有纖維二糖轉運子(cdt-Ι)和細胞內β -葡萄糖苷酶(ghl-1)基因的工程釀酒酵母D452-BT菌株進行的葡萄糖發酵(A)和纖維二糖發酵(B)的比較。符號:0D(〇)，葡萄糖(▼),纖維二糖(▲)，和乙醇(?)?
[0059]圖8展示了粗糙脈孢菌在蔗糖或含培養基的芒草水解液中的AEP的轉錄分析的比較。1，在蔗糖中16h;2，在芒草中16h;3，在芒草中40h;4，在芒草中112h;5，在芒草中232h。[0060]圖9展示了來自粗糙脈胞菌的兩種AEPs和來自釀酒酵母的兩種假定AEPs的氨基酸序列比對。
[0061]圖10展示了通過含有纖維二糖發酵路徑的BY4741 AYHR，Λ YNR和AGAL菌株進行的纖維二糖發酵的對比。誤差在15%內。符號:對照組(.)，AYHR(A)，AYNR(.)，和 Δ GAL ( ? ) ο
[0062]圖11展示了在纖維二糖(A)或葡萄糖(B)中生長的BY4741AEP敲除菌株的具體AEP活性。一單位的AEP活性定義為除了非酶反應速率之外，在22°C下，Imin內將Iymol的α -葡萄糖轉化為β -葡萄糖的酶量。誤差在15%以內。
[0063]圖12展示了在含有纖維二糖發酵途徑的工程釀酒酵母D452-BT中過表達AEP基因的三種釀酒酵母D452-BT菌株(GAL10-Sc，YHR210C，或YNR071C)對纖維二糖發酵的對t匕。在全部發酵結果中，值為兩種獨立發酵的平均，誤差條表示標準誤差。 【具體實施方式】
[0064]本發明涉及具有葡萄糖變旋酶活性的多肽及其使用方法，編碼具有葡萄糖變旋酶活性的核苷酸，含有具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的組合物及其使用方法，和含有編碼具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的核酸的組合物及其使用方法。本發明還涉及用于發酵含纖維糊精的材料的方法，在含纖維糊精的材料的發酵過程中提高纖維糊精的消耗的方法，在含纖維糊精的材料的發酵過程中提高化學品產量的方法，在含纖維糊精的材料的發酵過程中提高細胞生長的方法，以及進行這些方法的組合物。本發明還涉及發酵含β-D-葡萄糖的材料的方法，在含β-D-葡萄糖的材料的發酵過程中提高含β-D-葡萄糖的材料的消耗的方法，在含β-D-葡萄糖的材料的發酵過程中提高化學品產量的方法，在含β-D-葡萄糖的材料的發酵過程中提高細胞增長的方法，和用于進行這些方法的組合物。
[0065]纖維素和纖維糊精由β (1-4)連接的D-葡萄糖分子構成。纖維糊精或纖維素水解成單個葡萄糖分子導致β-D-葡萄糖分子的釋放。對于用于生物，如釀酒酵母的各種代謝途徑的葡萄糖分子而言，葡萄糖分子通常首先被己糖激酶磷酰化。在釀酒酵母中，己糖激酶優選或專門地磷酰化a-D-葡萄糖分子。a-D-葡萄糖分子可以通過變旋酶的作用由β-D-葡萄糖分子產生，該變旋酶可以使α和β形式的D-葡萄糖相互轉變。
[0066]釀酒酵母對于a -D-葡萄糖和β -D-葡萄糖的利用的偏好是纖維素、纖維糊精、和β-D-葡萄糖分子轉化為有用的發酵化學品，例如乙醇的潛在的限制步驟。因此，本文提供用于將β-D-葡萄糖分子轉化為a-D-葡萄糖分子的組合物和方法。不希望被理論所束縛，通過促進β-D-葡萄糖分子至a-D-葡萄糖分子的轉化，可增加釀酒酵母利用的β-D-葡萄糖分子和含有β-D-葡萄糖分子的材料，例如纖維糊精和纖維素。本文進一步提供用于通過釀酒酵母提高β-D-葡萄糖和纖維糊精的使用的組合物和方法。此外，本文公開的組合物和方法還包括通過生物合適地使用β -D-葡萄糖或其他糖分子的組合物和方法，該生物優先利用α或β形式的糖。
[0067]如文中所用的“醛糖1-表異構酶”指的是具有葡萄糖變旋酶活性的任何多肽，如下所定義的。如文中使用的“醛糖1-表異構酶”還指的是編碼醛糖1-表異構酶多肽的多核苷酸。
[0068]如文中所用的，纖維糊精指的是不同長度的葡萄糖聚合物，包括，但不限于，纖維二糖(2個葡萄糖單體)、纖維三糖(3個葡萄糖單體)、纖維四糖(4個葡萄糖單體)、纖維五糖(5個葡萄糖單體)、和纖維六糖(6個葡萄糖單體)。
[0069] 如文中所用的，糖涉及單糖類(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖)，二糖類(纖維二糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖)，和低級多糖(通常含有3至10個單糖成分)。
[0070]本發明的多肽
[0071]如本文中所使用的，“多肽”是包括多個連續聚合的氨基酸殘基(例如，至少約15個連續聚合的氨基酸殘基)的氨基酸序列。該多肽可選擇地包括修飾的氨基酸殘基，未被密碼子編碼的天然存在的氨基酸殘基，和非天然存在的氨基酸殘基。
[0072]如本文中所使用的，“蛋白質”指的是氨基酸序列、寡肽、肽、多肽、或者其部分，無論是自然存在或合成的。
[0073]具有葡萄糖變旋酶活性的多肽
[0074]本文中公開了具有變旋酶活性的重組多肽。如本文中所使用的，“變旋酶活性”指的是將β -D-葡萄糖轉化至a -D-葡萄糖和/或將a -D-葡萄糖轉化至β -D-葡萄糖的酶的能力。“變旋酶活性”還指將其他糖的α和β形式之間進行轉化的酶的能力，這些糖包括L-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、麥芽糖和乳糖。
[0075]本文中公開的具有變旋酶活性的重組多肽包括，但不限于，釀酒酵母多肽GALlO/YBRO19C(SEQ ID NO: 17)、YHR210C(SEQ ID NO: 19)和YNR071C(SEQ ID N0:21)，和粗糙脈孢菌多肽 NCU09705(SEQ ID NO: 23)。
[0076]在一個實施例中，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為釀酒酵母多肽GAL10/YBR019C。該釀酒酵母GALlO多肽在文獻中被稱為各種名稱，包括醛糖1-表異構酶、m)P-葡萄糖4-表異構酶、UDP-半乳糖4-表異構酶，和變旋酶(mutarotase)。釀酒酵母GALlO是雙功能酶，其中蛋白質的N-末端部分具有UDP-葡萄糖表異構酶活性(UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之間轉化)，和蛋白質的C-末端部分具有變旋酶活性。在近期的期刊雜志上公開了釀酒酵母GALlO 酶的晶體結構(見 Thoden and Holden, (2005) J Biol Chem280 (23): 21900-21907)。
[0077]根據本發明的一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為全長GAL10/YBR019C蛋白質(SEQ ID NO: 17)。根據本發明的另一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為具有GALlO/YBR019C蛋白質的約C端半段的多肽。另一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為GALlO/YBRO19C 蛋白質(SEQ ID NO:30) (SEQ ID NO: 17 的氨基酸編號 378-699)的 Ile-378 至Ser-699的氨基酸殘基。另一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為GAL10/YBR019C蛋白質(SEQ ID N0:31) (SEQ ID NO: 17 的氨基酸編號361-699)的氨基酸殘基Glu_361 至Ser-699。另一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為GAL10/YBR019C蛋白質(SEQ ID NO:32) (SEQ IDNO: 17的氨基酸編號364-699)的氨基酸殘基Phe_364至Ser-699。本領域技術人員理解，可以制備額外截短形式的GAL10/YBR019C，其中去除主要涉及或完全涉及GAL10/YBR019C的異構酶活性的N末端氨基酸，保留變旋酶活性所需的C末端氨基酸。這種截短形式的GALlO/YBR019C可以被識別，例如，通過制備各種截短形式的GAL10/YBR019C蛋白質，并測試用于葡萄糖變旋酶活性的截短蛋白質。用于制備截短形式的蛋白質的方法在本領域是已知的，可以涉及，例如通過PCR產生截短形式的基因編碼的GAL10/YBR019C蛋白質，克隆基因編碼的截短形式的蛋白質至表達載體，利用表達載體轉化宿主細胞，并在該宿主細胞中表達該蛋白質。[0078]在另一個實施例中，具有變旋酶活性的多肽為釀酒酵母多肽YHR210C(SEQ IDNO: 19)。一方面，YHR210C多肽序列基于序列同源性與GAL10/YBR019C蛋白質的氨基酸殘基 Phe-364 至 Ser-699 對齊。
[0079]在另一個實施例中，具有變旋酶活性的多肽為釀酒酵母多肽YNR071C(SEQ IDN0:21)。一方面，YNR071C多肽序列基于序列同源性與GAL10/YBR019C蛋白質的氨基酸殘基 Phe-364 至 Ser-699 對齊。
[0080]在另一個實施例中，具有變旋酶活性的多肽為粗糙脈孢菌多肽NCU09705 (SEQ IDNO:23)。一方面，NCU09705多肽序列基于序列同源性可以與GAL10/YBR019C蛋白質的氨基酸殘基Ala-386至Arg-697對齊。
[0081]在另一個實施例中，具有變旋酶活性的多肽為含有一個或兩個以下氨基酸基序(amino acid motifs)的多月太。
[0082]基序1:G-X-[VTI]-[VPI]-G-R-[VTY]-[AT]-N-R-[VILT] (SEQ ID NO:28)(與 GAL/YBR019C的殘基424-434對應)，其中X為氨基酸，對于括號中氨基酸位置，氨基酸為括號內的氨基酸的任意一個。例如，[VTI]是V、T或I。
[0083]基序2:T-[VPI]-[VI]-[MGN]-X-[STA]-[NSQHP]-H-[1ST]-Y-[FW]-N-L(SEQ IDNO:29)(與GAL/YBR019C的殘基530-542對應)，其中X為氨基酸，對于括號中氨基酸位置，氨基酸為括號內的氨基酸的任意一個。例如，[VPI]是V、P或I。
[0084]一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽具有含有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的氨基酸序列。一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽具有含有SEQ ID N0:29的氨基酸序列的氨基酸序列。一方面，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽具有含有以上SEQ ID N0:28和SEQIDNO: 29的氨基酸序列的氨基酸序列。
`[0085]在某些實施例中，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽與GALlO/YBRO19C, YHR210C, YNR071C或NCU09705的多肽具有約至少20%，約至少29%，約至少30%，約至少40%，約至少50%，約至少55%，約至少60%，約至少65%，約至少70%，約至少75%，約至少80%，約至少85%，約至少90%，約至少92%，約至少94%，約至少96%，約至少98%，約至少99%，或100%的氨基酸殘基序列一致性。在某些實施例中，具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為具有至少 7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，或 50 個 GALlO/YBRO19C, YHR210C, YNR071C或NCU09705多肽的連續氨基酸的多肽。
[0086]具有葡萄糖變旋酶活性的多肽包括重組多肽，該重組多肽為GALlO/YBRO19C, YHR210C,和 YNRO71C,和 NCU09705 多肽的保守性修飾的變體(conservativelymodified variants)。文中使用的“保守性修飾的變體”包括向多肽序列的單個取代、刪除或添加，導致利用化學性質相似的氨基酸取代氨基酸。本領域已知提供功能相似的氨基酸的保守性取代表。這種保守性修飾的變體并不排除本發明的多肽變體、異種同源基因、等位基因。以下八組包含彼此為保守性取代的氨基酸的例子:1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ;2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ;5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(U，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ;7)絲氨酸(S),蘇氨酸(T) ;8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(見例如Creighton, Proteins (1984))。
[0087]具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽還包括是GAL10/YBR019C，YHR210C, YNR071C和NCU09705多肽的同源基因或直系同源基因的(orthologs)多肽。本文中使用的“同源性”指的是參考序列與第二序列的至少一部分片段的序列一致性。可通過本領域已知的任何方法識別同源性，優選地，通過BLAST工具，對照參考序列與單個的第二序列或序列的片段，或者序列的數據庫。如下面所描述的，BLAST將基于一致性和相似性百分比比較序列。本文使用的“直系同源”指的是來源于共同的祖先基因的不同物種的基因。
[0088]本發明的多核苷酸
[0089]如本文中使用的，術語“多核苷酸”，“核酸序列”，“核酸的序列”及它們的變形通用于多聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(含有D-核糖)，或是嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷的其他類型的多核苷酸，以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物，唯有該聚合物含有核堿基，在該結構中允許堿基配對和堿基堆積，如DNA和RNA中。因此，這些術語包括已知類型的核酸序列修飾，例如用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸；核苷酸間的修飾(inter-nucleotide modifications),例如,那些不帶電荷的鍵合(如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)，帶負電荷鍵合(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，帶正電荷的鍵合(如氨烷基磷酰胺酯(aminoalkylphosphoramidates),氨烷基磷酸三酯)；這些含有側基(pendant moieties),例如,蛋白質(包括核酸酶,毒素,抗體，信號肽，聚_L_賴氨酸，等)；那些嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)；那些含有螯合劑的(例如金屬，放射性金屬，硼素，氧化金屬等)。如本文中使用的，用于核苷酸和多核苷酸的標記為生化命名委員會IUPAC-1UB推薦的那些。
[0090]編碼具有變旋酶活性的多肽的多核苷酸
[0091]本發明包括編碼具有變旋酶活性的多肽的重組多核苷酸。本發明還涉及宿主細胞和使用該宿主細胞的方法，其中該宿主細胞包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的多核苷酸。
[0092]本發明的重組多核苷酸包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的本文公開的多肽的任意多核苷酸。在一些方面，`本發明的多核苷酸包括編碼SEQ ID N0:17(GAL10/YBR019C多肽)，SEQ ID N0:19(YHR210C多肽)，SEQ ID NO: 21 (YNR071C多肽)，SEQ ID NO: 23 (NCU09705多肽)的多肽的多核苷酸。在一些方面，本發明的多核苷酸包括多核苷酸:SEQ IDN0:16(編碼GAL10/YBR019C多肽)，SEQ ID NO: 18 (編碼 YHR210C 多肽)，SEQ ID NO:20 (He碼 YNR071C 多肽)，和 SEQ ID NO: 22 (編碼 NCU09705 多肽)。
[0093]在某些方面，本發明的該重組多核苷酸包括與SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQID NO:20,和SEQ ID NO: 22的多核苷酸具有約至少20%，約至少30%，約至少40%，約至少50%,約至少55%，約至少60%，約至少65%，約至少70%，約至少75%，約至少80%，約至少85%，約至少90%，約至少92%，約至少94%，約至少96%，約至少98%，約至少99%，或約至少100%的
核苷酸殘基序列的一致性的多核苷酸。
[0094]本發明的多核苷酸還包括編碼多肽的多核苷酸，該多肽具有一個或兩個SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
[0095]本發明的多核苷酸還包括編碼GAL10/YBR019C, YHR210C, YNR071C,和NCU09705的多肽的保守性修飾變體的多核苷酸。本發明的多核苷酸還包括編碼GAL10/YBRO19C, YHR210C, YNR071C,和NCU09705的多肽的同源基因或直系同源基因的多核苷酸。
[0096]可通過本領域已知的任何合適的方法制備本發明的多核苷酸的序列，包括，例如直接化學合成或克隆。對于直接化學合成，核酸聚合物的形成通常涉及將3’ -封端和5’ -封端核苷酸單體順序加入生長的核苷酸鏈的末端5’ -羥基，其中通過生長的鏈的末端5’ -羥基在添加的單體3’ -位點上的親和攻擊實現每次添加，加入的單體通常為磷衍生物，例如磷酸三酯，亞磷酰胺等。這種方法在本領域是已知的，并在相關文本或文獻中有所描述[e.g., in Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Lett21:719-722; U.S.Pat.Nos.4, 500,707; 5, 436，327;and5, 700, 637]。此外，利用合適的限制性內切酶分裂DNA，從而從天然來源中分離出所需序列，利用凝膠電泳分離該片段，然后通過本領域已知的技術，例如利用聚合酶鏈反應(PCR;e.g.，U.S.Pat.N0.4，683，195)從凝膠中回收所需核酸序列。 [0097]可將本發明的每種多核苷酸結合至表達載體。“表達載體”或“載體”指的是這樣的化合物和/或組合物:該化合物和/或組合物轉化、轉換、或感染宿主細胞，從而使該細胞表達核酸和/或蛋白質；所述載體不是天然存在于細胞中的物質，或者說是以非天然存在的方式作用于所述細胞的。“表達載體”包含將要被該宿主細胞表達的核酸序列(通常的RNA或DNA)。可選擇地，該表達載體還包括幫助核酸進入宿主細胞的物質，例如病毒、脂質體、蛋白質涂層、或類似物。考慮用于本發明的該表達載體包括可以插入核酸序列的這些，以及任何優選的或需要的操作元素(operational elements)。進一步地,該表達載體必須是可以轉化至宿主細胞并在其中復制。優選的表達載體為質粒，特別是這些具有限制性位點的這些，它們已被記載，并含有核酸序列的轉錄優選或必須的操作成分。這種質粒，以及其他表達載體在本領域是已知的。
[0098]可通過已知的方法引入單個多核苷酸，例如，使用限制性內切酶(如BamHI, EcoRI, HhaI, XhoI, XmaI等等)以劈開表達載體如質粒內的特定位點。該限制性內切酶產生單鏈末端，可退火為多核苷酸，該多核苷酸具有或合成有，帶有與裂開的表達載體的末端互補的序列終點。使用合適的酶進行退火，例如DNA連接酶。本領域技術人員將理解，表達載體和理想多核苷酸通常通過相同的限制性內切酶來切割，從而確保表達載體的末端和多核苷酸的末端彼此互補。此外，DNA連接基因可用于幫助將核酸序列連接至表達載體。
[0099]可利用本領域通常的技術(如美國專利4,683，195)將單個多核苷酸系列結合起來。例如，每個理想多核苷酸可最初在單獨的PCR中生成。然后，設計特異性引物，以使PCR產物的末端包含互補序列。當該PCR產物混合，變性，在退火時，在其3’末端具有匹配序列的鏈重疊，并且彼此作為引物。通過DNA聚合酶延伸該重疊，產生分子，在該分子中最初的序列“拼接”在一起。這樣，單個多核苷酸系列可“拼接”在一起，然后同時轉導至宿主細胞中。因此，實現了多個多核苷酸中的每一個的表達。
[0100]單個多核苷酸，或“拼接的”多核苷酸，隨后納入表達載體內。本發明并不限于多核苷酸納入表達載體中的方法。本領域技術人員熟知用于將多核苷酸納入表達載體中的必要步驟。典型的表達載體包含理想多核苷酸，該理想多核苷酸前面帶有一個或多個調控區，以及核糖體結合位點，例如3-9個核苷酸長度、位于大腸桿菌初始密碼子的上游的3-11個核苷酸處的核苷酸序列。見 Shine and Dalgarno (1975) Nature254 (5495): 34-38andSteitz(1979)Biological Regulation and Development(ed.Goldberger, R.F.), 1:349-399(Plenum, New York)。
[0101]本文中使用的術語“可操作地連接”指的是一種結構，其中控制序列位于相對于DNA序列或多核苷酸的編碼序列的合適位置，以使控制序列知道多肽的表達。
[0102]調控區包括，例如含有啟動子和操縱基因的區域。啟動子可操作地連接至理想多核苷酸，從而通過RNA聚合酶開始多核苷酸的轉錄。操縱基因是與啟動子相鄰的核酸序列，其包括可結合阻遏蛋白的蛋白質結合域。當不存在阻遏蛋白時，通過啟動子啟動轉錄。當存在時，對操縱基因的蛋白質結合域具有特異性的阻遏蛋白結合至該操縱基因，從而抑制轉錄。這樣，根據使用的特定的調控區，以及相應阻遏蛋白的存在與不存在，實現了對轉錄的控制。例如乳糖啟動子(當與乳糖接觸時，Lad阻遏蛋白將改變結構，從而防止Lad阻遏蛋白結合至操縱基因)和色氨酸啟動子(當與色氨酸絡合時，TrpR阻遏蛋白具有結合至操縱基因的結構；當不存在色氨酸時，該TrpR阻遏蛋白具有不能結合至操縱基因的結構)。另外例如 tac 啟動子(見 de Boer et al., (1983) Proc Natl Acad Sci USA80 (I): 21-25)。本領域技術人員將理解，這些或其他表達載體可用于本發明，且本發明并不限于這些。
[0103]雖然任何合適的表達載體可用于納入理想序列，但是容易獲得的表達載體包括，但不限于，質粒，如 pSClOl, pBR322, pBBRlMCS-3, pUR, pEX, pMRlOO, pCR4, pBAD24, pUC19 ;噬菌體，如M13噬菌體和λ噬菌體。當然，這種表達載體可以僅僅適用于特定的宿主細胞。本領域技術人員可以通過常規實驗容易地確定任何特定的表達載體是否適用于任何給定的宿主細胞。例如，可將表達載體引入宿主細胞，隨后檢測該宿主細胞內含有的序列的存活率和表達。此外，可參照描述表達載體和它們對任何特定的宿主細胞的適應性的相關文本和文獻。[0104]序列比對和序列一致性
[0105]本領域已知用于對照序列比對的方法。例如，可利用數學算法來確定任意兩個序列之間的序列一致性的百分比。這種數學算法的非限制性的例子如Myers和Miller (1988)CAB10S4:1117 的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482 的局部同源性算法；Needleman和Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443453的同源性比對算法；Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:24442448 搜索相似性的方法；Karlin 和 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:58735877 中修改的 Karlin 和Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264 的算法。
[0106]這些數學算法的計算機執行過程可用于序列的比對，以確定序列一致性。這種實現包括但不限于，這種執行過程包括，但不限于，PC/基因程序中的CLUSTAL (由Intelligenetics, Mountain View, Calif 獲得)；ALIGN 程序(2.0 版)，和威斯康星州的遺傳學分析軟件包(Wisconsin Genetics Software Package),版本8中的GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA,和 TFASTA (由 Genetics Computer Group (GCG), 575ScienceDrive, Madison, ffis.，USA獲得)。可利用默認參數進行使用這些程序的對照。Higginset al.(1988)Gene73:237244(1988);Higgins et al.(1989)CAB10S5:151153;Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16:1088190;Huang et al.(1992)CAB10S8:15565;和Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307331 很好的描述了 CLUSTAL 程序。ALIGN 程序是基于同上Myers和Miller (1988)的算法。當比較氨基酸序列時，PAM120重量殘留表，12的空隙長度罰分，和4的空隙罰分可與ALIGN程序共同使用。Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403 的 BLAST 程序基于以上 Karlin 和 Altschul (1990)的算法。BLAST 核苷酸搜索可利用BLASTN程序進行，得分=100，字長=12，以獲得與編碼本發明的蛋白質的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序，得分=50，字長=3進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發明的蛋白質或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(gapped alignments),使用如 Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389描述的空位BLAST (BLAST2.0)。或者，可以使用PS1-BLAST (BLAST2.0)進行檢測分子間遠距離關系的重復搜索。見同上的Altschul et al.(1997)。當使用BLAST,空位BLAST，或PS1-BLAST時，使用相應程序的(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白質的BLASTX)的默認參數。JAL http://www.ncb1.nlm.nih.gov0也可以手動檢查比對。
[0107]如本文中所使用的，序列一致性或上下文中兩個核酸或多肽序列的一致性指的是兩個序列中的殘基，當在指定比較窗口(specified comparison window)最大化對應對齊時，二者相同。當序列一致性的百分比用于涉及蛋白質時，人們認識到不相同的且經常由于保守性氨基酸取代而不同的殘基位置不會改變分子的功能性質，其中氨基酸殘基被具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基取代。當序列在保守替換不同時，序列一致性百分比可能被向上調整，以矯正替代的保守性性能。通過這種保守性替換而不同的序列稱為具有序列相似性或相似性。用于進行這種調整的方法在本領域是公知的。通常這涉及將保守性替換評分為部分不匹配，而不是完全不匹配，從而提高序列一致性百分比。因此，例如，當具有一致性的氨基酸被評分為1，非保守性替換評分為0，那么保守性替換評分為O和I之間。計算非保守性替換的評分，例如，在程序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.)中執行。
[0108]除了上面所述的序列一致性的百分比，另一個兩種核酸序列或多肽基本相同的標志在于由第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽的抗體進行免疫交叉反應，如下所述。因此，多肽通常大致與第二多肽是一致的，例如，當該兩個肽僅僅保守性取代不同時。兩個核酸序列基本一致的另一個標志是兩個分子或它們的補體(complement)在嚴格條件下彼此雜交，如下所述。兩種核酸序列基本一致的另一個標志是使用相同的引物擴增該序列。
[0109]包含具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的組合物
[0110]本發明還提供包含具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的組合物。一方面，提供具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽。一 方面，提供含有一種或多種具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的宿主細胞。
[0111]具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽
[0112]在一些方面，提供具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽。在一些方面，具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽包括釀酒酵母多肽GAL10/YBR019C，YHR210C,和YNR071C，粗糙脈孢菌多肽NCU09705 (SEQ ID NO: 23)，及其變體，如上所述。在一些方面，具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽包括含有一種或兩種SEQ ID NO:28和29的氨基酸的多肽。
[0113]具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽可通過標準分子生物學技術制備，例如Sambrook, J.et al.2000Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Third Edition)中所描述的那些。重組多肽可在轉基因表達系統中表達和純化。轉基因表達系統可以是原核或真核的。轉基因宿主細胞可以包括酵母和大腸桿菌(E.coli)。在一些方面，轉基因宿主細胞可以在該宿主細胞外分泌該多肽。在一些方面，轉基因宿主細胞可以在宿主細胞內保留該表達的多肽。
[0114]在一些方面，具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽被從宿主細胞中分離出。在一些方面，利用蛋白質“標簽”制備具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽，以便于蛋白質純化，例如GST-標簽或聚-His標簽。在一些方面，具有葡萄糖變旋酶活性的重組多肽可以純化至高純度(例如>99%純度，>98%純度，>95%純度，>90%純度，等)。可以通過本領域已知的各種技術純化重組多肽，這些技術包括例如，離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、和親和色譜法。
[0115]本發明的宿主細胞
[0116]本發明涉及含有編碼具有葡萄糖變旋酶活性的多肽的重組多核苷酸的宿主細胞。
[0117]“宿主細胞”和“宿主微生物”在本文中交替地用于指生物細胞，該生物細胞可以通過重組DNA或RNA的插入進行轉化。這種重組DNA或RNA可以在表達載體中。因此，本文中描述的宿主微生物或細胞可以是原核生物(例如真細菌界生物)或真核細胞。本領域技術人員可以理解，原核細胞缺乏膜結合的核，而真核細胞具有膜結合的核。
[0118]任何原核或真核宿主細胞可用于本發明，只要它在核酸序列轉化后能存活。優選地，該宿主細胞不會受到必要的核酸序列轉導，隨后的蛋白質(轉運子)的表達，或所得中間體的不利影響。合適的真核細胞包括，但不限于，真菌，植物，昆蟲或哺乳動物細胞。
[0119]在某些實施例中，該宿主為真菌菌株。本文中使用的“真菌”包括子囊菌門、接合菌門、壺菌門、擔子菌門(如 Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionaryof The Fungi, 8th edition，1995，CAB International, University Press, Cambridge, UK定義的)、卵菌門(如Hawksworth et al.，1995，如上，第171頁中所引用的)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth et al.，1995，如上)。
[0120]在一些實施例中，真菌宿主為酵母菌株。本文使用的“酵母”包括產子囊酵母(Endomycetales)、產擔抱子酵母(basidiosporogenous yeast),和屬于不完全菌(Blastomycetes)的酵母。因為未來酵母的分類可能發生變化，對于本發明，酵母可根據酵母的生物學和活性中描述的定義(Skinner，F.A.，Passmore, S.Μ.，and Davenport, R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series N0.9，1980)。
[0121]在一些實施例中，該酵母宿主是假絲酵母(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母(Pichia)、接合酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或羅維亞酵母(Yarrowia strain)。
[0122]在本發明的一些實施例中，該宿主細胞是釀酒菌屬(Saccharomyces sp.)，釀酒酵母，摩納酵母(Saccharomyces monacensis),貝酵母，巴氏酵母，卡氏酵母，裂殖酵母(Saccharomyces pombe)，克魯維酵母(Kluyveromyces sp.)，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxiamus)，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)，胞壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)，樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)，嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile),休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)，熱帶假絲酵母(Candida tropical is)，粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)，運動發酵單抱菌(Zymomonasmobilis)。在另一些實施例中，該酵母宿主可以是解脂耶羅維亞酵母，卡斯酒香酵母，或魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces roux)。
[0123]釀酒菌屬可以包括釀酒菌株。Argueso等公開了通常用于生物乙醇生產的工業釀酒酵母菌株的基因組結構，以及對生物乙醇生產很重要的特定的基因多態性(Argueso etal.，Genome Research, 19:2258-2270，2009)。
[0124]在另一個實施例中，該真菌宿主是絲狀真菌菌株。“絲狀真菌”包括真菌門亞門和卵菌門(如Hawksworth et al.，1995，所定義的，如上)的所有的絲狀形式。該絲狀真菌通常特征是幾丁質，纖維素，葡聚糖，脫乙酰殼多糖，甘露聚糖，和其它復雜的多糖構成的菌絲體壁。通過菌絲伸長進行營養生長，碳的代謝是耗氧的。相反，通過酵母，如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的出芽進行，碳的代謝可以是發酵。
[0125]在某些實施例中，該絲狀真菌宿主為，但不限于，枝頂孢霉(Acremonium)，曲霉(Aspergillus)，鏈孢霉(Fusarium)，腐質霉(Humicola)，毛霉(Mucor)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，脈抱菌(Neurospora)，青霉菌(Penicillium)，節格抱(Scytalidium)j 梭抱殼(Thielavia)，彎頸霉(Tolypocladium)，或木霉菌株(Trichodermastrain)。
[0126]在某些實施例中，絲狀真菌宿主是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，構巢曲霉，黑曲霉，或者米曲霉菌株。在一些實施例中，該絲狀真菌宿主是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)，禾谷德抱(Fusarium cerealis)，克地德刀菌(Fusariumcrookwellense),大刀德抱(Fusarium culmorum)，禾谷德刀菌(Fusarium graminearum)，禾赤德抱(Fusarium graminum)，異抱德抱(Fusarium heterosporum)，合歡木德抱(Fusarium negundi )，尖德抱(Fusarium oxysporum)，多枝德抱(Fusarium reticulatum)，粉紅德抱(Fusarium roseum)，接骨木德刀菌(Fusarium sambucinum)，膚色德抱(Fusariumsarcochroum)，擬枝抱德刀菌(Fusarium sporotrichioides),硫色德抱(Fusariumsulphureum)，Fusarium torulosum，擬絲抱德刀菌(Fusarium trichothecioides)，或粗糙脈胞菌菌株(Fusarium venenatum strain)。在另一些實施例中，該絲狀真菌宿主是特異腐質霉(Humicola insolens),柔毛腐質霉(Humicola lanuginosa),米黑毛霉(Mucormiehei)，嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)，粗糖脈胞菌(Neurospora crassa),產紫青霉(Penicillium purpurogenum)，嗜熱革節抱(Scytalidium thermophilum)，嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)，或斯梭抱殼霉菌屬(Thielavia terrestrisstrain)。在另一個實施例中，該絲狀真菌宿主是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，康寧木霉(Trichoderma koningii )，長梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum),里氏木霉(Trichoderma reesei )，或者綠色木霉菌屬(Trichoderma viride strain)。
[0127]在其他實施例中，該宿主細胞是原核的，在某些實施例中，該原核生物是大腸桿菌(E.coli)，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)，運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis),梭狀芽抱桿菌(Clostridium sp.)，梭狀芽抱桿菌 phytofermentans (Clostridiumphytofermentans),嗜熱梭狀芽抱桿菌(Clostridium thermocellum)，拜氏梭狀芽抱桿菌(Clostridium bei jerinckii),丙酮丁醇梭狀芽抱桿菌(Moorella thermoacetica)，嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)，或者產酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。在其他實施例中，該原核宿主細胞為Carboxydocella sp.，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，腸桿菌科細菌(Enterobacteriaceae)，菊歐氏桿菌(Erwinia chrysanthemi)，乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)，乳鏈球菌(Streptococcus lactis),弗氏弧菌(Vibrio furnissii)，弗氏弧菌Ml (Vibrio furnissiiM1)，熱解纖維素抱芽抱桿菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)，或者野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)。在其他實施例中，該原核宿主細胞為藍藻。細菌宿主細胞的其他例子包括，但不限于，大腸桿菌(Escherichia)，腸桿菌(Enterobacter)，固氮菌(Azotobacter)，歐文菌(Erwinia)，桿菌屬(Bacillus)，假單胞菌(Pseudomonas)，克雷白氏桿菌(Klebsiella)，變形桿菌(Proteus)，沙門氏菌(Salmonella)，沙雷氏菌(Serratia),志賀菌(Shigella)，根瘤菌(Rhizobia)，透明顫菌(Vitreoscilla)，聚球藻細菌(Synechococcus),集包藍細菌(Synechocystis),和副球菌(Paracoccustaxonomical)的這些種類。
[0128]本發明的宿主細胞可以在已經引入該宿主細胞中的重組核酸內轉基因，且這種轉基因宿主細胞不存在于自然界。合適的宿主細胞是一種能夠表達一種或多種核酸構筑物，該核酸構筑物編碼用于不同功能的一種或多種蛋白質。
[0129]文中使用的“重組核酸”或“異源核酸”或“重組多核苷酸”，“重組核苷酸”或“重組DNA”指的是核酸的聚合物，其中至少以下之一是正確的:(a)核酸序列與給定宿主細胞無關(即不能自然發現)；(b)該序列可在給定宿主細胞內自然發現，但是具有非天然的含量(例如大于預期)；或((3)核酸序列包括兩種或多種子序列，該子序列在自然界中未發現彼此的相同的關系。例如，關于例子(C)，重組核酸序列將具有來自設置為制備新功能核酸的無關基因的兩種或多種序列。具體地，本發明描述了向向宿主細胞引入表達載體，其中表達載體含有用于編碼不常在宿主細胞內發現的蛋白質的核酸序列，或者含有編碼常在細胞中發現、但是受不同調控序列控制的蛋白質的核酸。參照宿主細胞的基因組，編碼蛋白質的核酸序列為重組的。如本文中所使用的，術語“重組多肽”指的是由上述“重組核酸”或“異源核酸”或“重組多核苷酸”，“重組核苷酸”或“重組DNA”產生的多肽。
[0130]在一些實施例中，宿主細胞自然產生由本發明的多核苷酸編碼的蛋白質。編碼所需蛋白質的基因可以與宿主細胞異源，或者該基因與宿主細胞具有內源性，但是可操作地連接至異源啟動子和/或控制區，其導致在宿主細胞內基因的更高的表達。在其他實施例中，該宿主細胞沒有自然產生理想蛋白質，且包括能夠表達產生那些分子的所需的一種或多種基因的異源核酸構筑物。
[0131]宿主細胞的成分
[0132]一方面，本發明的宿主細胞包括編碼本文公開的具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA。一方面，本發明`的宿主細胞過表達具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽(即該宿主細胞比缺乏編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞表達更多的具有變旋酶活性的多肽)。一方面，本發明的宿主細胞包括編碼釀酒酵母GAL10/YBR019C多肽的重組DNA。另一方面，本發明的宿主細胞包括編碼釀酒酵母YHR210C多肽的重組DNA。另一方面，本發明的宿主細胞包括編碼釀酒酵母YNR071C多肽的重組DNA。另一方面，本發明的宿主細胞包括編碼粗糙脈孢菌NCU09705多肽的重組DNA。另一方面，本發明的宿主細胞包括編碼釀酒酵母GAL10/YBR019C，YHR210C,或者YNR071C多肽，或粗糙脈孢菌NCU09705多肽的變體或截短形式的重組DNA。另一方面，本發明的宿主細胞包括編碼含SEQ ID N0:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列的一種或兩種的多肽的重組DNA。
[0133]在某些方面，該多肽與GAL10/YBR019C, YHR210C, YNR071C,或 NCU09705 多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。
[0134]纖維糊精轉運子[0135]在某些實施例中，該宿主細胞還包括編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA。纖維糊精轉運子是將纖維糊精分子從細胞外運輸至細胞內和/或從細胞內運輸至細胞外的任意的跨膜蛋白。在某些實施例中，該纖維糊精轉運子為功能性片段，該功能性片段保持將纖維糊精分子從細胞外運輸至細胞內和/或從細胞內運輸至細胞外的能力。
[0136]本發明的重組纖維糊精轉運子可被Supplemental Data, Dataset SI, page3inTian et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.106 (52): 22157-22162，2009 中的表 10 ；以及下表1和2所列的基因編碼。
[0137]表1:編碼纖維糊精轉運子的序列的列表[0138]
【權利要求】
1.一種宿主細胞，包括: a)編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA； b)編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA； 其中，當在含纖維二糖的培養基中生長時，所述宿主細胞比缺乏所述編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子。
2.根據權利要求1所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的重組DNA。
3.根據權利要求1或2所述的宿主細胞，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21和23的氨基酸序列的多肽。
4.根據權利要求1或2所述的宿主細胞，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
5.含纖維二糖的混合物的發酵方法，該方法包括: a)將所述含纖維二糖的混合物與權利要求1至4中任意一項所述的宿主細胞接觸，和 b)在支持發酵的條件下，孵化該宿主細胞。
6.含纖維二糖的混合物的發酵方法，該方法包括: a)提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括: i)編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA； ii)編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA;和 b)在培養基中培養宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致:與缺乏該編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，細胞對纖維二糖的消耗增加。
7.一種用于增加化學品產量的方法，該方法包括: a)提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括: i)編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA； ii)編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA;和 b)在培養基中培養宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致:與缺乏該編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，由該細胞生產的化學品的產量增加。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學品為醇。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述醇選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學品為萜類化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有機酸。
11.用于增加細胞的生長率的方法，該方法包括: a)提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括: i)編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA； ii)編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA;和b)在培養基中培養宿主細胞，以使編碼該一種或多種纖維糊精轉運子的和編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致:與缺乏編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，細胞的生長率增加。
12.根據權利要求6至11中任一項所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的重組DNA。
13.根據權利要求6至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21和23的氨基酸序列的多肽。
14.根據權利要求6至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
15.含β-D-葡萄糖的混合物的發酵方法，該方法包括: a)將含β-D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸； b)將含β-D-葡萄糖的混合物與細胞接觸，其中含β-D-葡萄糖的混合物與細胞的接觸在含β -D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽的接觸之后進行，或者兩種接觸同時進行；以及 c)在支持發酵的條件下孵化該細胞和含β-D-葡萄糖的混合物；且 其中，含β -D-葡萄糖的混合物與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽的接觸導致:同未與具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種重組多肽接觸的含β-D-葡萄糖的混合物的消耗情況相比，細胞在發酵過程中對含β -D-葡萄糖的混合物的消耗增加。
16.含β-D-葡萄糖的混合物的發酵方法，該方法包括: a)提供宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA ;和 b)在培養基中培養該宿主細胞，以使編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA表達出來，其中編碼該具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的表達導致:與缺乏該編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞相比，該細胞對含β -D-葡萄糖的混合物的消耗增加。
17.根據權利要求15至16中任一項所述的方法，其特征在于，所述含β-D-葡萄糖的混合物通過纖維素的水解獲得。
18.根據權利要求15至17中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs: 17, 19，21和23的氨基酸序列的多肽。
19.根據權利要求15至17中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽為含有選自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。
20.一種宿主細胞，包括: a)編碼一種或多種纖維糊精轉運子的重組DNA； b)編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA； 其中，當在含纖維二糖的培養基中生長時，所述宿主細胞比缺乏所述編碼具有葡萄糖變旋酶活性的一種或多種多肽的重組DNA的相應宿主細胞消耗更多的纖維二糖分子，其中該具有葡萄糖變旋酶活性的多肽含有選自SEQ ID NO:28和29的一種或兩種氨基酸序列。
21.根據權利要求20所述的宿主細胞，其特征在于，所述具有葡萄糖變旋酶活性的多肽包含SEQ ID NOs:28和29的氨基酸序列。
22.根據權利要求20或21所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞還包括編碼一種或多種β -葡萄糖苷酶的`重組DNA。
【文檔編號】C07K14/37GK103562216SQ201280014458
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年1月20日 優先權日:2011年1月21日
【發明者】詹姆斯·H.·多德納-凱特, 威廉·T.·畢森, 喬納森·M.·加拉茲卡, 趙慧敏, 李思進, 陳勇秀, 河析辰 申請人:伊利諾伊大學董事會, 加利福尼亞大學董事會