專利名稱：一種新型穿膜肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種新型穿膜肽及其應用。
背景技術：
隨著生物工程學，基因組學，生物和有機化學的發展，各種類型的新型藥物分子，如:短肽(peptides),單克隆抗體蛋白(monoclonal antibodies),反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides),核酶(ribozymes),催化 DNA (catalytic DNA)等紛紛被開發出來。這些具有極大生物學和醫學意義的分子(當然也包括傳統的質粒和融合蛋白)往往由于其過大的分子量和本身的親水性質，限制了他們的在體應用。由于生物膜系統的阻礙，這些分子很難進入到靶向器官和組織的細胞中去發揮作用。針對這些問題，不同的技術被開發出來，他們都有各自的優缺點。也有人采用物理透膜方式如電穿孔、微管注射、穿孔蛋白法等。這些方式雖然各有優勢，但是也存在一些缺點:導入率低、對細胞刺激大甚至可能導致細胞死亡、靶向性不強。因此很多研究者致力于尋求更具高效的透膜方式。20世紀中期人們開始認識到的一類具特殊功能的多肽分子，這些肽能夠穿透細胞膜進入細胞內，而且多種運載物分子(如蛋白、多肽、核苷酸)也可以與這些肽連接并易位進入細胞內。這些肽載體構成一種新的很有潛力的物質運輸載體，即細胞穿膜肽(cellpenetrating peptides, CPP)。它是一大類由30個以下氨基酸殘基組成的短肽。這種多肽介導的生物活性分子透膜技術，在許多方面優于常用的透膜方式。另外在合成上多肽具有高產率，對細胞毒性低，而且肽骨架能夠進行不同的修飾，這樣的多肽在未來的給藥平臺具有很大潛在的利用價值。細胞穿膜 肽均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，具有正電性或者兩親性。穿膜肽不僅可以轉導多肽和蛋白質，也可以將與穿膜肽偶聯的小分子有機化合物、寡核苷酸、DNA、噬菌體、脂質體、納米級的鐵珠等多種不同大小的其他物質導人細胞，并且大部分多肽和蛋白導入后依然保持其生物活性。但是穿膜肽應用依然存在一些問題:I)細胞毒性:穿膜肽富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，帶正電荷，容易引起細胞毒性。2)免疫原性:隨著肽鏈的增長，免疫原性也隨之增加。大部分的穿膜肽都在10-30個氨基酸殘基之間，對身體造成免疫反應的可能性大。3)穿膜效率:大部分穿膜肽具有長的肽鏈，主要通過內吞作用介導載物進入細胞膜，其穿膜效率受pH、離子濃度等影響。4)穿膜后載物活性:大部分的穿膜肽通過共價鍵與載物連接，進入細胞膜后無法分離，影響載物進入細胞后的活性。因此，本領域中需要細胞毒性低、免疫原性小、穿膜效率高并且對穿膜后載物活性影響較小的穿膜肽。
發明內容
本發明的目的在于提供一種含有6-9個氨基酸殘的穿膜肽及其應用。在第一方面，本發明提供了一種穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽具有如下結構特征，其序列如下:NH2-X-Y-COOH其中，XSn個精氨酸殘基(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，Y由m個色氨酸(Trp)殘基和/或組氨酸(His)殘基組成，且4 < n < 6，2 < m < 4，6 < m+n < 9。本發明的穿膜肽中，X可以由n個精氨酸殘基組成，優選地可以由5個精氨酸殘基組成。本發明的穿膜肽中，Y可以由m個色氨酸殘基組成，優選地可以由3個色氨酸殘基組成。根據本發明的穿膜肽的序列可以為SEQ ID NO:1_20:RRRRffffff (SEQ ID NO:1)、KKKKffffff (SEQ ID NO:2)、KRRKHHW (SEQ ID NO:3)、RKKKffffff (SEQ ID NO:4),KRRRHWff (SEQ ID NO:5)、RRRRHHH (SEQ ID NO:6)、KKKKHHH (SEQID NO:7),RRRRffHW (SEQ ID NO:8),KRKRffHH (SEQ ID NO:9), =RRKKffHH (SEQ ID N0:10)、KRKRffffH (SEQ ID NO: 11), KRKRffHW (SEQ ID NO: 12), RRKKffHW (SEQ ID NO: 13), RKKKffHW(SEQ ID NO:14), KRRKffHW (SEQ ID NO: 15)、KRRKffffH (SEQ ID NO: 16)、RKKKffffH (SEQ IDNO:17),RRKKffHW (SEQ ID NO: 18),KRRKffHH (SEQ ID NO:19)和 RKKKWHH (SEQ ID NO:20)。根據本發明的穿膜 肽可以是藥學上可接受的鹽形式。本發明的穿膜肽中，所述穿膜肽可以與生物小分子非共價作用相互結合，并攜帶生物小分子穿過細胞膜進入細胞。本發明的穿膜肽中，所述的穿膜肽在C端共價或非共價連接標記物或載物分子，并攜帶標記物或貨物分子穿過細胞膜進入細胞，優選地所述標記物選自由熒光素、生物素、特定的親和基團所組成的組；優選地所述貨物分子選自由糖類、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子、納米微球所組成的組。在第二方面，本發明提供了一種藥物組合物，其特征在于，包含根據第一方面所述的穿膜肽。在第三方面，本發明提供了根據第一方面所述的穿膜肽在用于需要進入細胞內完成診斷和/或治療的藥物的制備中的應用。本發明與現有技術相比，具有以下優點和有益效果:I)低毒安全:該穿膜肽分子量小，氨基酸殘基個數控制在10個以內，免疫原性低；含有4-6個堿性氨基酸殘基，1-3個酸性氨基酸殘基，陽離子性低；其殘基序列取自20種必
需氨基酸，安全無毒。2)經濟:該穿膜肽由固相合成而得，成本較低且便于質量管控。3)高效:該穿膜肽區別于以往的穿膜肽的最大特點在于，其能夠攜帶糖類等小分子生物物質高效的進入細胞。
圖1為本發明穿膜肽MEF細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)毒性試驗結果顯示圖；圖2為本發明中的穿膜肽FITC熒光標記后，孵育MEF細胞，熒光顯微實驗成像圖。
具體實施例方式實施例1:穿膜肽合成I)活化樹脂:稱取 IOOOmg Fmoc-Trp wang Resin 或 Fmoc-His wang Resin,加入10-15ml (浸沒全部樹脂)DMF浸泡30min，使其充分溶脹。2)脫保護:浸泡樹脂的DMF壓濾除去，加入IOml含有20%哌啶的DMF溶液，氮氣吹沸反應15min，然后壓濾除去，脫除氨基的FMOC基團，用IOml異丙醇洗滌樹脂三次，再用IOml DMF洗滌三次，而后用茚三酮法檢測樹脂應成黑色或紫色。3)縮合反應:連接下一個氨基酸，稱取FMOC-氨基酸的用量是1.4mm0l/g樹脂，91Omg TBTU,加入IOml DMF和0.45g HOBt混和均勻后，加入0.52mlDIEA配成反應液，室溫下氮氣吹沸反應2h。反應完畢后，用異丙醇洗滌樹脂三次，然后用DMF洗滌樹脂三次。檢測氨基。4)重復步驟2)-3)過程:按多肽的順序自C端向N端延伸多肽。重復脫保護.洗滌.縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。5)多肽切割:用氮氣將多肽-樹脂復合物吹干，按TFA/phenol/IEO/thioanisole/EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割試劑。將肽樹脂置于圓底燒瓶中，加入切割液磁力攪拌3小時，用200目砂芯過濾器除去樹脂，濾液直接抽入冷凍乙醚中，3000r/min離心使粗肽沉淀，凍干至恒重即得粗肽，干燥稱重。
6)粗肽用HPLC純化至95%以上，質譜鑒定。根據上文方法共合成SEQ ID NO:1_10的共10種穿膜肽。實施例2:細胞毒性實驗I)接種細胞:取96孔板，每孔加入含有7X IO3個細胞培養液，37°C，5% 二氧化碳培養箱24小時，使細胞貼壁。2)培養細胞:配置不同濃度的穿膜肽SEQ ID NO:1，同時設三個陰性對照孔，37°C，5% 二氧化碳培養l_5h。3)顯色:貼壁細胞每孔加入20 ii I MTT，繼續孵育4_6h之后棄掉培養液，每孔加入150 u I DMSO (二甲基亞砜)，震蕩 lOmin。4)比色:選擇490nm或570nm波長，在酶標儀免疫檢測儀上測定光吸收值，處理數據得到細胞存活率。結果見圖1。實施例3:細胞穿膜實驗I)加入含有一定濃度FITC熒光標記的穿膜肽的培養基孵育細胞，以含有FITC的培養基作為空白對照，孵育30min-4h后小心吸去培養基，并PBS洗滌貼壁細胞三次。2)加入固定液，10min-20min,固定細胞后PBS洗滌細胞2_3次。3)加入DAPI染色液染色5min-10min后PBS洗滌2-3次。4)分別在488nm和543nm的激發光下用熒光顯微鏡觀察，結果見圖2。實施例4 =MEF細胞負載海藻糖實驗I)培養基中加入一定量的海藻糖和肽(SEQ ID N0:l_10，使得培養基中海藻糖的終濃度為8mM，加入肽的終濃度為ImM。2)細胞貼壁后，加入上述培養基，培養30min_4h。孵育后小心吸去培養基，并PBS洗滌貼壁細胞三次。3)細胞經胰酶消化后，500-1500r/min離心5min，棄去培養液。PBS洗滌I次。4)在收集的洗滌后細胞中加入3倍于其體積的0.5mol/L三氯乙酸或甲醇，室溫放置30-60min，離心后重復提取I次，取2次上清。5)取純蒽酮0.2g加稀釋后硫酸溶液(體積分數80%) IOOml使之溶解，臨用前配制。6)取待測提取液適量 ，加入4倍體積的硫酸-蒽酮溶液，搖勻冷卻，沸水浴精確煮沸2-10min，冷水冷卻后置室溫lOmin。7)同樣方法以水為空白，通過紫外吸收法計算海藻糖導入量。結果如表I (以未與肽連接時的導入效率為I)。表權利要求
1.一種穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽具有如下結構特征，其序列如下:NH2-X-Y-COOH 其中，X由n個精氨酸殘基(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，Y由m個色氨酸(Trp)殘基和/或組氨酸(His)殘基組成，且4彡n彡6，2彡m彡4，6彡m+n彡9。
2.根據權利要求1所述的穿膜肽，其特征在于，XSn個精氨基酸殘基組成，優選地4個精氨基殘基組成。
3.根據權利要求1或2所述的穿膜肽，其特征在于，Y由m個色氨酸殘基組成，優選地3個色氨酸殘基組成。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的穿膜肽，其特征在于，其序列為SEQID NO:1-20。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽是藥學上可接受的鹽形式。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽與糖生物小分子非共價作用相互結合，并攜帶生物小分子穿過細胞膜進入細胞。
7.根據權利要求 1至5中任一項所述的穿膜肽，其特征在于，所述的穿膜肽在C端共價或非共價連接標記物或載物分子，并攜帶標記物或貨物分子穿過細胞膜進入細胞，優選地所述標記物選自由熒光素、生物素、特定的親和基團所組成的組；優選地所述貨物分子選自由糖類、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子、納米微球所組成的組。
8.—種藥物組合物，其特征在于，包含根據權利要求1至7中任一項所述的穿膜肽。
9.根據權利要求1至7中任一項所述的穿膜肽在用于需要進入細胞內完成診斷和/或治療的藥物的制備中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新型穿膜肽及其應用，所述穿膜肽細胞毒性低、免疫原性小、穿膜效率高并且對穿膜后載物活性影響較小。
文檔編號C07K7/06GK103172701SQ201310085250
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者徐霞, 李春龍, 韋宇平, 張良 申請人:中國科學院過程工程研究所