一種發酵與膜分離耦合實現連續批次發酵木質纖維素水解液生產乳酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種發酵與膜分離耦合，實現連續批次發酵木質纖維素水解液生產乳酸的方法。該方法是以凝結芽孢桿菌（Bacillus?coagulans）CGMCCC?No.7635為發酵菌種，以木質纖維素水解液中混合糖為碳源。本發明針對發酵過程中微生物對己糖和戊糖利用不同步，導致發酵周期延長，產率低等缺點，提出利用膜分離單元與發酵耦合進行細胞回收連續批次發酵，其步驟包括菌種活化，種子培養，發酵培養，超濾膜過濾，細胞回用，批次發酵。采用此方法可以有效縮短發酵周期，提高菌體對己糖和戊糖混合碳源的利用效率。該方法操作條件溫和、穩定性好，對微生物利用木質纖維素水解液中混合糖發酵生產生物化工產品具有普遍的指導意義，具有廣闊的工業應用前景。
【專利說明】一種發酵與膜分離耦合實現連續批次發酵木質纖維素水解液生產乳酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，尤其是涉及一種發酵與膜分離耦合實現連續批次發酵木質纖維素水解液生產乳酸的方法。
【背景技術】
[0002]乳酸是一種重要的有機酸，廣泛應用于食品、醫藥、化工、釀造及紡織等領域，其分子結構中含有一個不對稱碳原子，有0和I兩種光學異構體。近年來，以乳酸為單體合成的聚乳酸塑料因具有可生物降解特性，被認為是石化塑料的最佳替代品之一。
[0003]目前，乳酸主要是由發酵法生產，發酵方式為批次發酵，即每一次發酵都需要培養一級甚至多級種子，種子培養不僅延長了發酵周期，還增加了種子罐等發酵設備的投入。而在大規模發酵過程中，單罐發酵體積越來越大，種子培養體積也相應增大，種子培養過程中的能量消耗不容忽視。為了避免每一批次都要進行的多級種子培養，可將批次發酵得到的菌體細胞作為下一批次發酵的種子，也稱之為細胞回收循環發酵。中國專利⑶201010148026.2采用離心法進行細胞分離實現細胞回收循環發酵葡萄糖生產乳酸，但是離心法回收細胞存在操作不連續，不能截留發酵液中蛋白質等營養組分等缺點。而膜技術具有高效率、低能耗、過程簡單、條件溫和、操作方便等特點，并且易于和其他技術集成、便于工業放大，并且能夠截留色素、蛋白質，有利于產品的后續分離純化，與離心等傳統分離相比，膜技術應用于細胞循環發酵更具競爭力。中國專利⑶200910272524.5報道了一種“間歇式回流細胞高生產率發酵生產有機酸的方法”，但其使用中溫菌發酵，整個生產過程需要嚴格的無菌操作，增加了生產成本，不利于工業放大。
[0004]為降低生產成本，利用可再生的木質纖維素資源生產乳酸成為研究熱點。木質纖維素的主要成分是纖維素、木質素、半纖維素。木質纖維素中，富含戊糖(木糖、阿拉伯糖為主)的半纖維素組分占到原料干重的20-50%，因此戊糖的利用不同忽視。乳酸桿菌(1^0^0111118)是工業應用的乳酸生產菌，然而，其對戊糖的利用能力十分有限。凝結芽孢桿菌(83(3111118⑶￡181113118)是一種乳酸發酵新菌種，該菌株不但具備發酵葡萄糖生產乳酸能力，而且戍糖發酵能力也十分突出。凝結芽孢桿菌通過磷酸戍糖(^6111:086-^11081)1181:6
訪冊7，沖)途徑代謝木糖，乳酸理論收率為100%。凝結芽孢桿菌具有高溫(45~601 )發酵特性，設備及培養基無需滅菌，生產過程為開放式，極大地降低生產成本。與中溫乳酸生產菌種相比，凝結芽孢桿菌更適合于細胞回收循環發酵，因為高溫發酵染菌幾率低，可保證該工藝長期穩定運行，易于工業放大。然而，凝結芽孢桿菌以己糖戊糖混合液發酵時，存在碳分解代謝物阻遏081:8130111:6 16^6881011,(1?)現象，即先利用葡萄糖，代謝結束后再利用戊糖。因此，菌體不能同步利用木質纖維素水解液中存在的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，導致發酵周期延長，乳酸產率不高。已有報道，使用多級反應器串聯發酵，可以提高菌體濃度，能夠提高混合糖利用效率。因此，將具有嗜熱特性的凝結芽孢桿菌應用于發酵膜分離耦合的細胞回收循環發 酵，通過提高生物量的方法提高菌體對混合糖利用效率。同時，高溫發酵過程中設備不需滅菌，極大簡化了操作工藝，降低了生產成本，這對于細胞循環發酵技術的工業放大具有重大意義。
【發明內容】
[0005]為解決利用木質纖維素水解液中混合糖發酵生產乳酸過程中周期長、產率低等問題，本發明利用發酵與膜分離耦合技術，批次發酵結束后回收細胞循環利用，并補充新鮮培養基，連續批次發酵，達到提高碳源利用速度，提高乳酸產率目的。實現本發明的步驟是:
[0006]( 1)木質纖維素的糖化:將木質纖維素原料預處理、酶解，并將預處理得到的液體與酶解得到的液體合并，經納濾技術濃縮，得到木質纖維素水解液；；
[0007](2)以嗜熱乳酸生產菌為菌種，以木質纖維素水解液為碳源在一定發酵條件下生產乳酸，培養基無需滅菌，且發酵過程也不需無菌操作；
[0008](3)第一批次發酵結束后，啟動與發酵罐耦合的膜分離組件，發酵液經泵輸送到超濾膜組件中，得到含有乳酸的透過液，截留的菌體細胞返回發酵罐中，最終將發酵液體積濃縮，其中濃縮液主要為具有發酵能力的菌體細胞；
[0009](4)濃縮液再作為種子培養物接入下一批次發酵培養基中，以與上一批次完全相同的發酵條件繼續發酵，然后再對發酵液再次進行超濾操作，獲得含有乳酸的透過液及用作下一批次發酵種子培養的濃縮液。如此循環多次，實現木質纖維素水解液的膜耦合連續批次發酵生產乳酸。
[0010]本發明所述木質纖維素是玉米秸桿、稻草秸桿、小麥秸桿、甘蔗渣、草類以及闊葉樹或針葉樹的木屑；木質纖維素預處理方法是稀堿液、稀酸液或者蒸汽爆破方法；納濾膜組件為卷式、管式或平板式，納濾膜組件的材料為醋酸纖維素、磺化聚砜、聚酰胺、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚哌嗪或聚乙烯醇，納濾組件的截留分子量為90到400道爾頓之間；最終得到的木質纖維素水解液為己糖(葡萄糖，甘露糖或半乳糖等六碳糖)和戊糖(木糖、阿拉伯糖等五碳糖)的混合物。
[0011]本發明使用的嗜熱乳酸生產菌為凝結芽孢桿菌(8210111118 0088111^118) 06100^0.7635，該菌種于2013年5月23日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，該菌種保藏號為^0.7635。發酵條件為:溫度45~551，批次發酵時間20~40卜，攪拌轉速100~15011)111，使用氫氧化鈉、氨水或者碳酸鈉控制邱值在6.0~6.5之間。
[0012]本發明中超濾膜材料為聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或無機陶瓷膜。膜組件為平板式、管式、卷式或中空纖維式。超濾膜截留分子量在1萬到10萬道爾頓之間。
[0013]本發明發酵及超濾過程為開放式操作，不需無菌操作。每批次發酵結束后，使用超濾膜組件將發酵液濃縮為原始體積的5%~20%，連續發酵批次為5次以上。
[0014]本發明具有以下優點:
[0015](1)以木質纖維素為主要原料制備乳酸，顯著降低乳酸生產成本，具有廣闊的工業應用前景。
[0016](2)采用凝結芽孢桿菌(851(:111118 008^1118118) 06100 ^0.7635,一次接種增值，菌體多次重復利用，減 少了種子液的制備，同時還實現了菌種馴化效果，使混合糖的利用效率得到顯著提高。
[0017](3)菌種經過連續循環批次發酵，得到更多的菌體量，
[0018](4)本發明實現了木質纖維素水解液連續發酵生產乳酸的目的，碳源代謝速度提高，發酵周期明顯縮短，乳酸發酵強度顯著提高。本過程不需無菌操作，為開放式生產，工藝簡單，適合工業放大生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是發酵與膜分離耦合設備示意圖。
[0020]附圖標記
[0021]1.堿液罐2.料液罐3.發酵罐4.超濾膜組件5.乳酸粗產品儲罐6.進料泵7.閥門
[0022]圖2是實施例1中開放式細胞循環回收利用小麥秸桿水解液中混合糖發酵生產乳酸的過程圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例對本發明做進一步說明。本發明所涉及的主題保護范圍并非僅限于這些實際例。
[0024]實施例1
[0025]開放式細胞循環回收利用小麥秸桿水解液中混合糖發酵生產乳酸的方法。
[0026]本實施例中所使用的各培養基的組成如下:
[0027]謝3培養基(蛋白胨108/1，牛肉粉108/1，酵母粉0.58凡，無水乙酸鈉0.58凡，檸檬酸氫二胺0.28/1，磷酸氫二鉀0.2^/1).183培養基中添加108/1葡萄糖即為種子培養基。
[0028]本實施例具體方法包括以下步驟:
[0029]1.小麥秸桿水解液的制備:使用2% (^)硫酸1211處理小麥秸桿粉末90-11,固液比1:10，獲得的預處理混合物經過濾后得到的液體即為小麥秸桿稀酸水解液。使用纖維素酶酶解稀酸預處理后得到的固體物質(主要組分為纖維素),每克纖維素添加20？？口纖維素酶。酶解條件:501、邱5.0、20011)111，酶解時間48卜。將小麥秸桿稀酸水解液和酶解液混合，使用截留分子量約為150道爾頓的平板式聚酰胺納濾膜濃縮，得到含有59.558/1混合糖(葡萄糖29.728/1、木糖24.698凡、阿拉伯糖5.14^/1)的小麥秸桿水解液。
[0030]2.種子培養:將凝結芽孢桿菌008^18118)06100如.7635接種于種子培養基，搖床振蕩培養(10011)111) 12小時，培養溫度501。
[0031]3.發酵培養(第1次發酵):發酵時，向步驟1得到的小麥秸桿水解液中添加2(^/I酵母粉得到發酵培養基，發酵培養基不用滅菌。將步驟2得到的種子培養基以5% “八)的接種量接種于81發酵培養基中，發酵罐自動控制發酵條件:521，攪拌轉速10011)111，培養時間20~40卜，結束發酵。培 養過程使用40%氫氧化鈉自動調節邱值6.0，發酵過程不需要無菌操作。
[0032]4.重復批次發酵:第1次發酵結束，啟動與發酵罐耦合的膜分離設備，膜組件使用聚丙烯腈燦0材料超濾膜，截留分子量為2萬道爾頓。待發酵液濃縮至原來體積10%時，即0.81時超濾操作結束。將超濾濃縮液作為種子培養物，發酵罐中再次加入發酵培養基到81，繼續開始下一批次發酵培養基中，以與第一次發酵完全相同條件進行發酵培養，培養結束后再次啟動膜組件，共發酵6批次。
[0033]使用高效液相色譜分析發酵液中的糖含量和乳酸產量。分析方法為:使用810-1^(1！！？父-87！1型色譜柱，柱溫501，流動相為5禮硫酸，流速0.601/111111,檢測器為島津810-10八示差折光檢測器檢測。
[0034]發酵培養基和設備不需要滅菌，操作過程為開放式。發酵過程和結果見圖2和表1，由于細胞循環利用，生物量明顯提高，葡萄糖代謝速率明顯提高，從而也提高了五碳糖利用速率，葡萄糖抑制效應得到緩解。使用膜耦合細胞循環連續批次發酵工藝后，發酵時間由第一批次的50匕縮短為24小時，與第1批次發酵相比，乳酸產率提高了 2.14倍。由此可知，發酵與膜分離耦合利用小麥秸桿水解液中混合糖連續批次發酵生產乳酸高效可行，發酵過程穩定，此工藝具有廣闊的工業應用前景。
[0035]表1膜分離耦合連續批次發酵小麥秸桿水解液
[0036]
【權利要求】
1.一種發酵與膜分離耦合實現連續批次發酵木質纖維素水解液生產乳酸的方法，其特征在于，該工藝包括以下步驟: (1)木質纖維素的糖化:將木質纖維素原料預處理、酶解，并將預處理得到的液體與酶解得到的液體合并，經納濾技術濃縮，得到木質纖維素水解液； (2)以嗜熱乳酸生產菌為菌種，利用木質纖維素水解液在一定發酵條件下生產乳酸，培養基無需滅菌，且發酵過程也不需無菌操作； (3)第一批次發酵結束后，啟動與發酵罐耦合的膜分離組件，發酵液經泵輸送到超濾膜組件中，得到含有乳酸的透過液，截留的菌體細胞返回發酵罐中，最終將發酵液體積濃縮，其中濃縮液主要為具有發酵能力的菌體細胞； (4)濃縮液再作為種子培養物接入下一批次發酵培養基中，以與上一批次完全相同的發酵條件繼續發酵，然后再對發酵液再次進行超濾操作，獲得含有乳酸的透過液及用作下一批次發酵種子培養的濃縮液。如此循環多次，實現木質纖維素水解液的膜耦合連續批次發酵生產乳酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述木質纖維素是玉米秸桿、稻草秸桿、小麥秸桿、甘蔗渣、草類以及闊葉樹或針葉樹的木屑，木質纖維素預處理方法是稀堿液、稀酸液或者蒸汽爆破方法處理。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的納濾膜組件為卷式、管式或平板式，納濾膜組件的材料為醋酸纖維素、磺化聚砜、聚酰胺、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚哌嗪或聚乙烯醇，納濾組件的截留分子量為90到400道爾頓之間。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中使用的嗜熱乳酸生產菌為凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans) CGMCC No.7635，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中得到的木質纖維素水解液為己糖(葡萄糖，甘露糖或半乳糖等六碳糖)和戊糖(木糖、阿拉伯糖等五碳糖)的混合物。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中的發酵條件為:溫度45~55℃，批次發酵時間20~40匕攪拌轉速100~150rpm，使用氫氧化鈉、氨水或者碳酸鈉控制邱值在6.0~6.5之間。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)和(4)中超濾過程為開放式操作，不需無菌操作。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)和(4)中超濾膜材料為聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或無機陶瓷膜；膜組件為平板式、管式、寬流道卷式或外壓式中空纖維式；超濾膜截留分子量在1萬到10萬道爾頓之間。
9.根據權利1要求所示方法，其特征在于，步驟(3)中使用超濾膜組件將發酵液濃縮為原始體積的5%~20%。
10.根據權利1要求所示方法，其特征在于，步驟(4)中連續發酵批次在5次以上。
【文檔編號】C07C51/47GK103834696SQ201310502784
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】萬印華, 張玉明, 陳向榮, 齊本坤, 沈飛, 蘇儀 申請人:中國科學院過程工程研究所