一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，采用以下步驟：1）將魚肌肉溶于10mMTris-Hcl溶液中，組織搗碎后，離心取上清液；2）將上清液于沸水浴中加熱，4℃離心取上清液；3）往上清液中加入10mMCacl2及100mMPMSF，4℃離心兩次，取上清液；4）往上清液中緩慢加入TCA溶液；5）將溶液在4℃緩慢攪拌，加NaOH溶液調PH；6）將溶液在4℃緩慢攪拌，上清液離心，得沉淀物；7）重復步驟4-6得純化后的小清蛋白。本發明采用沸水浴加熱，兩次TCA提取方法純化魚類的小清蛋白，純化工藝簡單、過程快速、設備要求較低、易操作，可得較純的小清蛋白，可操作性強，便于推廣應用。
【專利說明】一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法。【背景技術】 [0002]小清蛋白(parvalbumin)是一種常見的魚類過敏蛋白。免疫學及分子生物學研究發現，PV廣泛存在于各種魚類中，小清蛋白的分子量為10~14kD，等電點為3.9~5.5，主要存在于魚肉的肌漿蛋白部分。魚類是最容易引起過敏的食物之一。魚類過敏可導致患者出現皮膚紅腫、哮喘、鼻炎等過敏性癥狀，嚴重時還伴隨著虛脫、休克，甚至危及生命，嚴重影響著過敏人群的身體健康和生活質量。國外關于食物過敏及食物過敏原的研究報道較多，但是，我國的食物過敏問題沒有得到足夠重視，尤其是作為世界上最大的水產品生產國和人口大國，迫切需要系統研究水產品過敏及水產品過敏原，從而為研發低致敏或無致敏的水產品提供技術依據。以往純化過敏蛋白的方法較繁瑣復雜，本方法則較為簡單，容易操作，得到的小清蛋白較純。在對魚類過敏原的研究日益重視的今天，快速純化過敏蛋白無疑是將魚類過敏蛋白的研究邁上了新的臺階。無論對制備高特異性的單克隆抗體還是對進一步的小清蛋白的檢測以及診斷方法都提供了更為有利的保障。
【發明內容】
[0003]針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的是提供一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法。
[0004]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于采用以下步驟:
1)將魚肌肉溶于lOmMTris-Hcl溶液中，組織搗碎后，4°C離心取上清液；該步驟為組織勻漿，將肌肉中的蛋白質溶解，棄去雜質，便于后續操作；
2)將所得的上清液于沸水浴中加熱15min，4°C離心后取上清液；沸水浴煮沸可除去雜蛋白質，以便制得純度更聞的小清蛋白；
3)往步驟2)所得的上清液中加入10mMCacl2& lOOmM PMSF，4°C離心兩次，取上清液；加Cacl2能使促進蛋白溶解，加PMSF可保持蛋白活性；
4)往步驟3)制得的上清液中緩慢加入TCA溶液，得TCA混合溶液；加入TCA可使上清液中的蛋白沉淀；
5)將步驟4)制得的TCA混合溶液在4°C緩慢攪拌，邊攪拌邊加入NaOH溶液調節PH=5.2 ;該步驟可使溶液的PH值維持在蛋白質的等電點附近，有利于蛋白質的沉淀；TCA是極酸物質，殘留會對后續電泳分析造成影響，本步驟也可以調節PH在適宜范圍；
6)將步驟5)制得的溶液在4°C緩慢攪拌，得到的上清液于4°C離心，棄去上清液，得小清蛋白沉淀物；
7)將小清蛋白沉淀物加少量蒸餾水完全溶解后，往蒸餾水溶液中緩慢添加TCA溶液混勻得TCA混合溶液，然后在4°C緩慢攪拌lOmin，邊攪拌邊加入NaOH溶液調節PH=5.2，得混合溶液，在溫度不變的條件下攪拌混合溶液lh后離心，在轉速為8000r/min離心20min,棄去上清液，將得到的沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，可知是純度較高的小清蛋白。
[0005]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟I)中所述魚肉和Tris-HCL溶液質量體積比為1:5。
[0006]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟I)離心轉速為8000r/min,時間為 15min。
[0007]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟I)所述Tris-HCL 溶液的 PH 為 7.5。
[0008]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟2)中離心的轉速為 12000r/min，時間為 20min。
[0009]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟3)離心轉速為10000r/min,時間為 20min。
[0010]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟4)和步驟7)所述TCA溶液濃度為100%，TCA混合溶液中TCA濃度為3%。
[0011]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟5)和步驟7)中攪拌時間為lOmin，NaOH的濃度為6mol/L。
[0012]所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟6)中攪拌時間為Ih,離心轉 速為8000r/min,時間為20min。
[0013]本發明的有益效果是:
本發明一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，采用沸水浴加熱，并兩次TCA提取的方法純化魚類的小清蛋白，純化工藝簡單、純化過程快速、設備要求較低、易于操作，可得到較純的小清蛋白，可操作性強，便于推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為鯉魚小清蛋白純化后的電泳條帶。
【具體實施方式】
[0015]本發明下面結合實施例予以進一步詳述。
[0016]實施例1
一種快速純化鯉魚小清蛋白的方法，依次包括以下步驟:
取2g鯉魚的白色肌肉溶于10ml PH=7.5的IOmM Tris-HCL溶液中，組織搗碎后，在4°C，離心機轉速8000r/min的條件下離心15min，取上清液；將上清液于沸水浴加熱20min后，在離心機轉速12000r/min，在4°C溫度條件下離心20min，取上清液；將上清液加入IlmgCacl2, Iml IOOmM PMSF溶液,在8000r/min, 4°C,離心兩次每次20min,取上清液；往上清液中加入300ulTCA溶液得TCA混合溶液；將得到的TCA混合溶液在4°C溫度條件下，緩慢攪拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH調節溶液PH至5.2，最后將PH=5.2的溶液于4°C溫度條件下緩慢攪拌Ih,得到的上清液在8000r/min的條件下離心20min,棄去上清液,得小清蛋白沉淀物；將小清蛋白沉淀物用少量蒸餾水全部溶解后，往蒸餾水溶液中緩慢添加TCA溶液得TCA混合溶液；TCA添加量為最后制得的溶液中含有3%的TCA，將得到的TCA混合溶液在4°C溫度條件下，緩慢攪拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH調節溶液PH至5.2，最后將PH=5.2的溶液于4°C溫度條件下緩慢攪拌lh，得到的上清液在8000r/min的條件下離心20min，棄去上清液，最后將得到的沉淀進行SDS-PAGE分析，可知得到的是純度較高的小
清蛋白；
m(Cacl2 )=c (Cacl2) XV (Tris-HCL) X 110.98
IOOmM PMSF溶液的配置:用異丙醇溶解PMSF成17.4mg/ml (100mmol/L),分裝成小份貯存于-20°C。
[0017]實施例2
一種快速純化鱈魚小清蛋白的方法，依次包括以下步驟:
取2g鱈魚的白色肌肉溶于IOml PH=7.5的IOmM Tris-HCL溶液中，組織搗碎后，在4°C，離心機轉速8000r/min的條件下離心15min，取上清液；將上清液于沸水浴加熱20min后，在離心機轉速12000r/min，溫度4°C條件下離心20min，取上清液；將上清液加入IlmgCacl2, Iml IOOmM PMSF溶液,在8000r/min, 4°C,離心兩次每次20min,取上清液；往上清液中加入300ulTCA溶液得TCA混合溶液；將得到的TCA混合溶液在4°C溫度條件下，緩慢攪拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH調節溶液PH至5.2，最后將PH=5.2的溶液于4°C溫度條件下緩慢攪拌Ih,得到的上清液在8000r/min的條件下離心20min,棄去上清液,得小清蛋白沉淀物；將小清蛋白沉淀物用少量蒸餾水全部溶解后，往蒸餾水溶液中緩慢添加TCA溶液得TCA混合溶液；TCA添加量為最后制得的溶液中含有3%的TCA，將得到的TCA混合溶液在4°C溫度條件下，緩慢攪拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH調節溶液PH至5.2，最后將PH=5.2的溶液于4°C溫度條件下緩慢攪拌lh，得到的上清液在8000r/min的條件下離心20min，棄去上清液，最后將得到的沉淀進行SDS-PAGE分析，可知得到的是純度較高的小清蛋白；`
m(Cacl2 )=c (Cacl2) XV (Tris-HCL) X 110.98
IOOmM PMSF溶液的配置同實施例1。
[0018]實施例3
一種快速純化鯽魚小清蛋白的方法，依次包括以下步驟:
取2g鯽魚的白色肌肉溶于10ml PH=7.5的IOmM Tris-HCL溶液中，組織搗碎后，在4°C，離心機轉速8000r/min的條件下離心15min，取上清液；將上清液于沸水浴加熱20min后，在離心機轉速12000r/min，溫度4°C條件下離心20min，取上清液；將上清液加入IlmgCacl2, Iml IOOmM PMSF溶液,在8000r/min, 4°C,離心兩次每次20min,取上清液；往上清液中加入300ulTCA溶液得TCA混合溶液；將得到的TCA混合溶液在4°C溫度條件下，緩慢攪拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH調節溶液PH至5.2，最后將PH=5.2的溶液于4°C溫度條件下緩慢攪拌Ih,得到的上清液在8000r/min的條件下離心20min,棄去上清液,得小清蛋白沉淀物；將小清蛋白沉淀物用少量蒸餾水全部溶解后，往蒸餾水溶液中緩慢添加TCA溶液得TCA混合溶液；TCA添加量為最后制得的溶液中含有3%的TCA，將得到的TCA混合溶液在4°C溫度條件下，緩慢攪拌lOmin，然后加入6mol/L的NaOH調節溶液PH至5.2，最后將PH=5.2的溶液于4°C溫度條件下緩慢攪拌lh，得到的上清液在8000r/min的條件下離心20min，棄去上清液，最后將得到的沉淀進行SDS-PAGE分析，可知得到的是純度較高的小清蛋白；
m(Cacl2 )=c (Cacl2) XV (Tris-HCL) X 110.98lOOmM PMSF溶液的配置同實施例1。
[0019]以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是 本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于采用以下步驟: 1)將魚肌肉加入IOmMTriS-Hcl溶液中，組織搗碎后，4°C離心取上清液； 2)將所得的上清液于沸水浴中加熱15min，4°C離心后取上清液； 3)往步驟2)所得的上清液中加入IOmMCacl2及IOOmM PMSF，4°C離心兩次，取上清液； 4)往步驟3)制得的上清液中緩慢加入TCA溶液，得TCA混合溶液； 5)將步驟4)制得的TCA混合溶液在4°C緩慢攪拌，邊攪拌邊加入NaOH溶液調節PH=5.2 ； 6)將步驟5)制得的溶液在4°C緩慢攪拌，得到的上清液于4°C離心，棄去上清液，得小清蛋白沉淀物； 7)將小清蛋白沉淀物加少量蒸餾水完全溶解后，往蒸餾水溶液中緩慢添加TCA溶液混勻得TCA混合溶液，然后在4°C緩慢攪拌lOmin，邊攪拌邊加入NaOH溶液調節PH=5.2，得混合溶液，在溫度不變的條件下攪拌混合溶液Ih后離心，在轉速為8000r/min離心20min,棄去上清液，將得到的沉淀經真空干燥機干燥后于_80°C冷凍，得到純化的小清蛋白。
2.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟O中所述魚肉和Tris-HCL溶液質量體積比為1:5。
3.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟I)離心轉速為8000r/min,時間為15min。
4.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟1)所述Tris-HCL溶液的PH為7.5。
5.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟2)中離心的轉速為12000r/min，時間為20min。
6.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟3)離心轉速為10000r/min，時間為20min。
7.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟4)和步驟7)所述TCA溶液濃度為100%，TCA混合溶液中TCA濃度為3%。
8.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟5)和步驟7)中攪拌時間為lOmin，NaOH的濃度為6mol/L。
9.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的快速純化方法，其特征在于步驟6)中攬拌時間為Ih,離心轉速為8000r/min,時間為20min。
【文檔編號】C07K14/46GK103694331SQ201310677468
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】于瀅, 關榮發 申請人:中國計量學院