使用側鏈錨接賴氨酸的胰島素的固相肽合成的制作方法
【專利摘要】本申請公開了使用用于固相和液相肽合成的有效方法來制備包括胰島素和胰島素衍生物在內的肽。
【專利說明】使用側鏈錨接賴氨酸的胰島素的固相肽合成
【背景技術】
[0001] 胰島素以及胰島素的衍生物和類似物是通過A-鏈和B-鏈的固相合成以及雙氧化 的A-鏈與線性B-鏈的隨機氧化而高效地合成的。賴氨酸與含賴氨酸的肽通過賴氨酸側鏈 而附著在酸不穩定的樹脂和熱不穩定的樹脂上。這種方法允許進行多種肽和修飾肽的固相 合成。
[0002] 胰島素是小型蛋白質，其由2條肽鏈（A-鏈和B-鏈）組成，這2條肽鏈通過2個分 子間二硫鍵連接在一起。此外，A-鏈包含其他的分子內二硫鍵。胰島素及其衍生物是用于 治療糖尿病的最重要的藥品。胰島素的藥物性質可以通過2條肽鏈的微小修飾而被改變。 因此，已經研發多種胰島素衍生物（圖1)，并商業化，例如地特胰島素（Levemir)、甘精胰島 素（Lantus)、門冬胰島素（Novolog)、賴脯胰島素（Humalog)和賴谷胰島素（Apidra)。
[0003] 使用仿生方法制備胰島素是本領域已知的。13』.〇5^1'，5.〇1〇，]\0.?6七6^〇11，0· F.Steiner,J.Biol.Chem. 1971, 246, 1375-1386；ff.Kemmler,J.D.Peterson,D. F.Steiner,J.Biol.Chem. 1971, 246, 6786-6791。這些方法通過重組DNA技術來制備胰島 素，并且線性的胰島素原（proinsulin)產物通過氧化而折疊。最終，使用酶除去胰島素原 的中間C-肽，并釋放最終的胰島素。
[0004]到目前為止，盡管Zahn,Katsogiannis,Kisho,Kent,theShanghai Institute，CibaGeigy，EliLilly，NovoNordisc，Sanofi_Aventis等的研究作了很多努 力，但是對于胰島素而言，仍未研發出化學的經濟可行的途徑。這些努力均不能以合理的產 率和成本生產合成的胰島素。
[0005]目前使用的4種方法為：1)將線性A和B鏈隨機混合，并將它們空氣氧化；2)將 在半胱氨酸殘基的巰基位置處包含磺酸基的A鏈與磺化的B-鏈混合；3)在A鏈和B鏈之 間定點構建3個二硫鍵；以及4)其中胰島素原中束縛C肽的功能被Glu(A14)和Thr(B30) 的側鏈之間的酯鍵置換的合成方法。該方法需要使用液體氟化氫進行2次反應，以及9次 層析純化，但是該方法是目前被認為最有效的化學合成方法。
[0006] 在胰島素及其類似物的化學合成中遭遇的主要困難是：a)A-鏈和中間保護肽的 不溶性，這阻礙了有效的逐步固相合成和純化；b)使用Fmoc-氨基酸難以合成胰島素B-鏈 與位置His(BlO)、Leu(Bll)和Val(B12)處難以進行偶聯反應有關[B.DueLarsen和A.Holm J.P印tideRes. 1998, 52, 470-476];以及c)在鏈的結合時獲得的產率低。例如方法2(上 述）僅得到產率為7%的結合的A和B鏈。
【發明內容】
[0007] 在一個實施方案中，本申請公開了有效方法來克服上述問題，由此能夠化學合成 胰島素、其衍生物和其類似物。本申請公開了 ：1)A鏈的合成；2)B鏈的合成；以及3)雙氧 化的A鏈與B鏈的結合。
[0008] 在一個實施方案中，提供了式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物，其包含樹脂和賴氨酸 或賴氨酸衍生物，其中：
[0009]
【權利要求】
1. 一種式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物，包含樹脂和賴氨酸或賴氨酸衍生物，其中：
W為對于賴氨酸或賴氨酸衍生物由樹脂上的切割，酸敏感或熱敏感的樹脂或對于酸和 熱均敏感的樹脂； R選自由W下構成的組；-0H ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Pr 1)、-T虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0H、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0-C2_e 帰基、 -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、-I'虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Pr 1) -〇-Ci_e 焼基、虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基；包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿基的 氨基酸的膚殘基；W及選自由 SEQ ID N0:l、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 和 36 構成的組中的膚殘基； 其中Prl為-0H保護基，Pr2和PR3各自獨立地為氨或脈保護基；W及 P為氨；氨基保護基；N-末端膚殘基，該N-末端膚殘基包含1至200個具有任選地保護 的側鏈和任選地保護的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端膚殘基包含C-末端和N-末 端；W及選自由沈Q ID N0:l、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35和36構成的組中的膚殘基； 前提條件是當R選自由-0H ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Prl)、-T虹(Prl)-Arg (Pr2)-Arg (Pr3)-0H、-!'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、-T虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、 -I"虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-〔2-6 帰基、 -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、-I'虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Prl) -〇-Ci_e 焼基、-T虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基；W及包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿 基的氨基酸的膚殘基時，則P并非為氨或氨基保護基。
2. 權利要求1所述的賴氨酸-樹脂綴合物，其中所述的樹脂W-具有式IIla、IIIb、IIIC 或 nid，
其中：
n 為 0、1、2 或 3 ; Ri和R3各自獨立地選自H，或者獨立地選自由2-C1、2-Ci_3焼基、2-Ci_3焼氧基、4-Ci_3焼 基和4-Ci_3焼氧基構成的組中，前體條件是在式Ib、Ic和Id的每個式中，Ri和R3中僅一者 為2-C1，并且Ri和R 3中僅一者為H ; R2為所述的樹脂的固相；并且 Z為鍵或-C( = 0)-。
3. 權利要求1或2所述的賴氨酸-樹脂綴合物，其中P選自由W下構成的組；叔下 氧基撰基炬〇c)、9-巧甲氧基撰基（Fmoc)、予氧基-撰基（駿基予基或幻、^(4,4-二 甲基-2, 6-二氧環己-^亞基）-己基值de)、2-硝基苯基硫基（化S)和帰丙氧基撰基 (alloc)。
4. 一種用于固相合成保護的、部分保護的或未保護的包含1至200個氨基酸的膚殘基 的方法，該方法包括： a)制備式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物，其包含樹脂和賴氨酸或賴氨酸衍生物，其中：
W為對于賴氨酸或賴氨酸衍生物由樹脂上的切割，酸敏感或熱敏感的樹脂或對酸和熱 均敏感的樹脂； R選自由W下構成的組；-0H ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Pr 1)、-T虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0H、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、 -I"虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-〔2-6 帰基、 -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、-I'虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Pr 1) -〇-Ci_e 焼基、-T虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基；包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿基的 氨基酸的膚殘基；W及選自由 SEQ ID N0:l、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 和 36 構成的組中的膚殘基； 其中Prl為-0H保護基，Pr2和PR3各自獨立地為氨或脈保護基；W及 P為氨；氨基保護基；N-末端膚殘基，該N-末端膚殘基包含1至200個具有任選地保護 的側鏈和任選地保護的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端膚殘基包含C-末端和N-末 端；W及選自由沈Q ID N0:l、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35和36構成的組中的膚殘基； 前提條件是當R選自由-0H ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Prl)、-T虹(Prl)-Arg (Pr2)-Arg (Pr3)-0H、-!'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、-T虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0-C2_e 帰基、
-I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Prl) -〇-Ci_e 焼基、虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基；W及包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿 基的氨基酸的膚殘基時，則P并非為氨或氨基保護基； b)將式I所示的其中R為-0H的賴氨酸-樹脂綴合物與包含1至200個具有任選地保 護的側鏈和任選地保護的末端駿基的氨基酸的C-末端膚偶聯，從而形成式la所示的綴合 物：
其中 Ri 選自由 W下構成的組；-Pro-OH，-Pro-NHs，-Pr〇-0-Ci_e 焼基，-Pr〇-0-C2_e 帰 基，-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基，T虹(Pr 1)，-T虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -OH， -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2， -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基， -I"虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-〔2-6 帰基， -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基，-I'虹(Pr 1) -OH, -I'虹(Prl) -畑2, -I'虹(Prl) -〇-Ci_e 焼基，虹(Prl) -0-C2_e 帰基和-T虹(Prl) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基， 或者包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿基的氨基酸的膚殘基； 或者 b'）將下列式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物與包含1至200個具有任選地保護的側鏈 和任選地保護的末端氨基的氨基酸的N-末端膚偶聯，從而形成式la所示的綴合物，在所述 式I中，P為H并且Ri為駿基保護基或包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保 護的駿基的氨基酸的C-末端膚殘基，其中該膚殘基在賴氨酸或賴氨酸殘基的a -氨基包含 C-末端和N-末端，其中所述的N-末端膚包含C-末端和N-末端，
其中Ri和P如上文所定義；W及 C)任選地除去保護基Prl、Pr2或Pr3,或者所述的C-末端膚殘基處的保護基，從而形 成其中Prl、Pr2和Pr3為氨，或者其中所述的C-末端為游離的駿基的式la所示的脫保護 的綴合物；W及 d)任選地由所述的樹脂W上切割膚殘基。
5.權利要求4所述的方法，其中所述的樹脂W-具有式Ilia、mb、IIIc或Hid，
其中：
n 為 0、1、2 或 3 ; Ri和R3各自獨立地選自H，或者獨立地選自由2-C1、2-Ci_3焼基、2-Ci_3焼氧基、4-Ci_3焼 基和4-Ci_3焼氧基構成的組，前體條件是在式IIIb、IIIc和Hid的每個式中，Ri和R3中僅 一者為2-C1，并且Ri和R 3中僅一者為H ; R2為所述的樹脂的固相；并且 Z為鍵或-C( = 0)-。
6. 權利要求4或5所述的方法，其中所述的賴氨酸或賴氨酸衍生物選自由W下構成 的組；SEQ ID N0:l、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35 和 36。
7. 權利要求4、5或6中任意一項所述的方法，其中 對于其中式I的R為-0H的步驟b)而言，通過活化所述的C-末端游離的駿基并將所 述的活化的駿基與C-末端膚縮合將式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物與包含1至200個氨 基酸的C-末端膚偶聯，從而形成所述的式la所示的綴合物，其中Ri為包含1至200個具 有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿基的氨基酸的C-末端膚殘基；或者 對于其中將所述的賴氨酸或賴氨酸衍生物的a-氨基偶聯的步驟b'）而言，通過使用 下列活化基團來活化N-末端游離的駿基從而形成活化的駿基，并縮合N-末端膚的活化駿 基將式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物與包含1至200個氨基酸的N-末端膚殘基偶聯，從而 形成所述的式la所示的綴合物，其中P為包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地 保護的末端駿基的氨基酸的N-末端膚殘基，其中所述活化基團選自由DCC、PFP0H、DMAP、 PFP- H氣己酸醋、化巧、PFP0H、EDC、DMA、EDC、HOBt、FDPP、DIEA、DMF、EDC、HOAt、皿TU、HATU、 HATU、冊A t、Ac 20、DMAP、Ac2〇、化巧、DPPA、抑PP、DCC、冊A t、DCC、冊B t、DIC、冊化和邸 C-肥 1 構成的組。
8. 權利要求7所述的方法，其中在所述的步驟b)或b'）之后，所述的方法還包括： d) 通過下列步驟將所述的膚殘基由所述的樹脂W上切下；使用有機酸和溶劑的混合物 在弱酸性條件下與式la所示的樹脂結合的膚綴合物接觸，或者將所述的樹脂結合的膚加 熱至升高的溫度，或者既使用所述的有機酸與溶劑的混合物又將所述的樹脂結合的膚在升 高的溫度下加熱足W將包含具有游離氨基的賴氨酸的膚由所述的樹脂W上切下的時間； e) 使用R' C0-X將所述的包含賴氨酸的膚的游離氨基醜化，從而形成N-醜化的膚衍生 物，其中X為C1、化、CH3CO-，并且R'選自C&CO-或包含1至200個氨基酸的C-末端駿基 活化的膚殘基；W及 h)分離式II所示的N-醜化的膚衍生物：
9. 權利要求8所述的方法，其中所述的醜基（R'CO-)衍生自：肉豆證酸的團化物或酸 酢、編碼或非編碼的氨基酸團化物、Fmoc-Glu-OtBu和巧u〇-C〇-(CH2) 14-CO-NH-GIu-O巧U。
10. 權利要求4所述的方法，其中通過下列步驟將包含C-末端游離駿基的式la所示的 賴氨酸-樹脂綴合物進一步轉化成相應的焼基駿基醋：在堿存在的條件下將所述的駿基與 選自由二苯基甲基氯化物、4-甲氧基二苯基甲基氯化物、4-甲基二苯基甲基氯化物、H苯
甲基氯化物、2-氯H苯甲基氯化物、4-甲基H苯甲基氯化物、H甲基甲娃焼基氯化物和H 己基甲娃焼基氯化物構成的組中的焼基團化物接觸，或者活化所述的C-末端駿基并與選 自Rink-醜胺MBHA或Rink-醜胺AM樹脂中的氨基樹脂反應。
11. 權利要求4至10中任意一項所述的方法，其中所述的包含1至200個氨基酸的 C-末端膚或所述的包含1至200個氨基酸的N-末端膚殘基選自保護的、部分保護的或未 保護的膜島素B-鏈或膜島素B-鏈衍生物，或者為選自SEQ ID NO:l、3、4、5、6、7、8、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 和 36 中的膚殘基。
12. 權利要求11所述的方法，還包括： 同時氧化所述的膚W及由SEQ ID NO:9所示的A-鏈膚-樹脂的樹脂上切割所述的膚， 然后脫保護，從而形成SEQ ID NO: 14所示的雙氧化的脫保護的雙氧化膜島素A-鏈；W及 將SEQ ID NO: 14所示的雙氧化的膜島素A-鏈與SEQ ID NO: 27所示的B-鏈結合，從 而形成SEQ ID N0:6所示的膜島素類似物；或者 將所述的SEQ ID NO: 14所示的雙氧化的膜島素A-鏈與SEQ ID NO: 29所示的B-鏈結 合，從而形成SEQ ID N0:8所示的膜島素類似物；或者 將所述的SEQ ID NO: 36所示的雙氧化的膜島素A-鏈與SEQ ID NO: 23所示的B-鏈結 合，從而形成SEQ ID N0:4所示的膜島素類似物。
13. -種固相合成保護的、部分保護的或未保護的膜島素B-鏈或膜島素B-鏈衍生物的 方法，該方法包括： 制備包含樹脂和賴氨酸或賴氨酸衍生物的式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物，其中：
W為式Ilia、mb、IIIc或Hid所示的樹脂：
其中： n 為 0、1、2 或 3 ; Ri和R3各自獨立地選自H，或者獨立地選自由2-C1、2-Ci_3焼基、2-Ci_3焼氧基、4-Ci_3焼 基和4-Ci_3焼氧基構成的組，前體條件是在式mb、IIIc和Hid的每個式中，Ri和R3中僅 一者為2-C1，并且Ri和R 3中僅一者為H ; R2為所述的樹脂的固相；并且Z為鍵或-C( = 0)-; R選自由W下構成的組；-OH ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Pr 1)、-T虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0H、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、
-I"虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-〔2-6 帰基、 -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、-I'虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Pr 1) -〇-Ci_e 焼基、-T虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基；包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿基的 氨基酸的膚殘基； 其中Prl為氨或-0H保護基，并且Pr2和Pr3各自獨立地為脈或脈保護基； P為氨；氨基保護基；N-末端膚殘基，該N-末端膚殘基包含1至200個具有任選地保護 的側鏈和任選地保護的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端膚殘基包含C-末端和N-末 玉山 綱； 前提條件是當R選自由-0H ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Prl)、-T虹(Prl)-Arg (Pr2)-Arg (Pr3)-0H、-!'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、-T虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0-C2_e 帰基、 -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、-I'虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Prl) -〇-Ci_e 焼基、虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基構成的組時，則P并非為氨或氨基保護基； 將式I所示的賴氨酸-樹脂綴合物與保護的、部分保護的或未保護的膚殘基Ib偶聯， 從而形成所述的保護的、部分保護的或未保護的膜島素B-鏈或膜島素B-鏈衍生物，其中在 式I中，R選自-0H、駿基保護基和包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的 末端駿基的氨基酸的膚殘基，并且其中包含1至200個氨基酸的膚殘基與所述的膚殘基Ib 一起包含膜島素B-鏈或膜島素B-鏈衍生物。
14. 權利要求13所述的方法，其中所述的樹脂為2-氯H苯甲基樹脂。
15. 權利要求13-14中任意一項所述的方法，其中P選自由W下構成的組；叔下氧基撰 基炬OC)、9-巧甲氧基撰基（Fmoc)、予氧基-撰基（駿基予基或幻、1-(4, 4-二甲基-2, 6-二 氧環己-1-亞基）-己基值de)、2-硝基苯基硫基（化S)和帰丙氧基撰基（alloc)。
16. 權利要求13-15中任意一項所述的方法，其中所述的部分保護的、未保護的膜島素 B-鏈或膜島素B-鏈衍生物選自由SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7和8、W及它們的類似物或衍生物構 成的組；并且 通過W下步驟進一步切割樹脂結合的膜島素B-鏈或膜島素B-鏈衍生物；使用有機酸 和醇溶劑的混合物在弱酸性條件下與所述的樹脂結合的膚接觸，或者將所述的樹脂結合的 膚加熱至升高的溫度，或者既使用有機酸與醇溶劑的混合物又將所述的樹脂結合的膚在升 高的溫度下加熱足W將所述的膜島素B-鏈或膜島素B-鏈衍生物由所述的樹脂上切下的時 間。
17. 權利要求16所述的方法，其中所述的有機酸選自由H氣己酸、己酸和它們的混合 物構成的組，所述的醇溶劑選自由H氣己醇、六氣異丙醇、甲醇和它們的混合物構成的組， 并使用微波來加熱所述的樹脂結合的膚。
18. 權利要求16所述的方法，其中所述的部分保護的或未保護的膜島素B-鏈或膜島 素B-鏈衍生物選自由W下構成的組；N-醜化的衍生物、聚己二醇化的衍生物、生物素化的 衍生物、包含發色團的衍生物、w及包含天然氨基酸殘基、非天然氨基酸殘基和它們的混合 物的膚殘基。
19. 一種固相合成保護的、部分保護的或未保護的膜島素A-鏈或膜島素A-鏈衍生物的 方法，該方法包括： 制備包含樹脂和賴氨酸或賴氨酸衍生物的賴氨酸-樹脂綴合物，其中所述的膚-樹脂 綴合物具有下式I，其中：
R選自由W下構成的組；-0H ;駿基保護基；-畑2 ;-〇-Ci_e焼基；-0-C2_e帰 基；-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基；選自由-Pr〇-0H、-Pr〇-NH2、-Pr〇-0-Ci_e 焼基、-Pr〇-0-C2_e 帰 基、-Pro-0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、T虹(Pr 1)、-T虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0H、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3)-畑2、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -〇-Ci_e 焼基、 -I'虹(Prl) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0-C2_e 帰基、 -I'虹(Pr 1) -Arg (Pr2) -Arg (Pr3) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基、-I'虹(Pr 1) -OH、-I'b(Prl)-畑2、-Ilir (Pr 1) -〇-Ci_e 焼基、虹(Pr 1) -0-C2_e 帰基和-T虹(Pr 1) -0- H -Ci_3 焼基甲娃焼基 構成的組中的膚殘基；包含1至200個具有任選地保護的側鏈和任選地保護的末端駿基的 氨基酸的膚殘基； P為氨；氨基保護基；N-末端膚殘基，該N-末端膚殘基包含1至200個具有任選地保護 的側鏈和任選地保護的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端膚殘基包含C-末端和N-末 玉山 綱； 其中樹脂W具有式Ilia、mb、IIIc或Hid :
其中： n 為 0、1、2 或 3 ; Ri和R3各自獨立地選自H，或者獨立地選自由2-C1、2-Ci_3焼基、2-Ci_3焼氧基、4-Ci_3焼 基和4-Ci_3焼氧基構成的組，前體條件是在式mb、IIIc和Hid的每個式中，Ri和R3中僅 一者為2-C1，并且Ri和R 3中僅一者為H ; R2為所述的樹脂的固相；并且Z為鍵或-C ( = 0)-; W及 其中所述的膚殘基是保護的、部分保護的或未保護的膜島素A-鏈或膜島素A-鏈衍生 物，或者為選自SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15或它們的混合物中的膚殘基； 所述的方法包括：將所述的膚-樹脂綴合物與氧化劑接觸，從而同時氧化所述的膜島 素A-鏈并將所述的膚殘基由所述的樹脂上切割下來； 將保護的雙氧化膜島素A-鏈整體脫保護；W及
純化未保護的雙氧化膜島素A-鏈。
20. 權利要求19所述的方法，其還包括將所述的未保護的雙氧化膜島素A-鏈與選自 SEQ ID ^:3、23、27、29和34中的膜島素8-鏈膚接觸，從而形成動物或人的膜島素或膜島 素類似物。
21. 權利要求20所述的方法，其中所述的動物或人的膜島素或膜島素類似物選自；SEQ ID NO:l、4、5、6、7 和 8，W及賴谷膜島素（Adipra)。
22. -種用于制備選自SEQ ID ^:3、23、27、29和34中的膜島素8-鏈膚的方法，包括： 通過下列步驟由式IV所示的膚-樹脂綴合物上切割膚： W-AA1-AAm IV 將所述膚-樹脂綴合物與有機酸和溶劑的混合物接觸；或者將所述的膚-樹脂加熱至 升高的溫度；或者既使用有機酸和溶劑的混合物又將所述的樹脂結合的膚在升高的溫度下 加熱至足W將膚殘基由樹脂W上切下的時間， 其中： W為式Ilia、mb、IIIc或Hid所示的樹脂，
其中： n 為 0、1、2 或 3 ; Ri和R3各自獨立地選自H，或者獨立地選自由2-C1、2-Ci_3焼基、2-Ci_3焼氧基、4-Ci_3焼 基和4-Ci_3焼氧基構成的組，前體條件是在式mb、IIIc和Hid的每個式中，Ri和R3中僅 一者為2-C1，并且Ri和R 3中僅一者為H ; R2為所述的樹脂的固相；并且Z為鍵或-C ( = 0)-; W及 AA1 為： A) 通過下列基團附著在W上的包含賴氨酸殘基或其衍生物的第一膚殘基： i) 賴氨酸或賴氨酸衍生物的氨基側鏈； ii) 賴氨酸或賴氨酸衍生物的駿基；或 iii) N-末端氨基；或者 B) 通過下列基團附著在W上的非賴氨酸膚殘基： i) 非賴氨酸膚殘基的駿基； ii) 非賴氨酸膚殘基的N-末端氨基；并且 AAm為第二至第m殘基，其中m為1-200的整數。
23. 權利要求22所述的方法，其中所述的膚-樹脂綴合物選自由SEQ ID NO:16、17、18、 20、22和24構成的組。
24. 權利要求23所述的方法，其中所述的膚-樹脂綴合物選自SEQ ID NO: 16或17,其 進一步脫保護從而形成SEQ ID NO: 3所示的人B-鏈。
25. 權利要求22-24中任意一項所述的方法，其中所述的有機酸選自由H氣己酸、己酸 和它們的混合物構成的組，所述的醇溶劑選自由H氣己醇、六氣異丙醇、甲醇和它們的混合
物構成的組，并在大約3(TC至5(TC下加熱所述的膚-樹脂綴合物。
【文檔編號】C07K14/62GK104428314SQ201380031205
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年4月19日 優先權日:2012年4月20日
【發明者】克列奧梅尼斯·K·巴羅斯 申請人:克列奧梅尼斯·K·巴羅斯