脂肽衍生物，它們的制備方法及用途的制作方法

專利名稱：脂肽衍生物，它們的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及脂肽配合物A1437的抗菌素衍生物，它們的制備方法以及它們作為藥物的用途。
歐洲專利申請號0629636公開了一類脂肽，它們有十分類似的氨基酸序列但有不同的脂肪酸殘基(脂類部分)，它們于發酵期間通過游動放線菌屬.SP.被合成并釋放到培養基中，該專利還公開了從培養基中游離脂肽的方法以及提純方法及這種脂肽作為藥理學活性物質的用途，制別是用于抗革蘭氏陽性菌。
本發明的目的是尋找比天然的A1437脂肽毒性低的脂肽配合物A1437的衍生物。
本發明的上述目的通過式Ⅰ化合物的衍生物可達到。
因之本發明涉及1.以式Ⅰ表示的脂肽A1437衍生物及其藥學上可接受的鹽
其中R1是OH或NH2R2是直鏈或支鏈，飽和或不飽和脂肪族C8-C22酰基，它可以被苯基或環烷基或被氧隔開。
2.制備式Ⅰ化合物的方法，該方法包括使式Ⅱ化合物 其中R1和上述定義相同，R3是肽化學中公知的氨基保護基，優選叔丁氧羰基(BOC)，芐氧羰基(Z，CbZ)，藥基甲氧羰基(Fmoc)或烯丙氧羰基(AllOC)保護基，和式Ⅲ的羧酸其中R2和上述定義相同，或者和羰基被活化的上述羧酸的衍生物進行反應;
3.含式Ⅰ脂肽衍生物及藥物賦形劑的藥劑，4.式Ⅰ的脂肽衍生物在制備抗細菌感染藥物方面的用途。
本發明通過下文，特別是其優選的實施方案被詳細地說明，本發明通過專利權利要求書的內容被進一步確定。
原料化合物(式Ⅱ化合物)從保護的發酵產品中獲得，例如從A 1437 B(I，R1＝OH，R2＝(CH3)2CH(CH2)7CH＝CHCH2CO)和9-芴基甲基氯代甲酸酯得到，形成 的相應化合物，并隨后通過用游動放線菌utabensisNRRL12052酶解消除脂肪酸殘基(J.Antibiotics，1988，1093)。
假如使用式Ⅲ的羧酸本身作為酰化劑的話，存在縮合劑例如碳化二亞胺如N，N’-二環己基碳化二亞胺是方便的。式Ⅲ的羧酸可通過在肽化學中常規的方法，例如在“ChemieinunsererZeit”27-274-286(1993)中所述的方法使其活化。自然，合適的活化衍生物是酰鹵如酰氯，酸酐或混合酸酐例如和甲酸酯形成的酸酐，疊氮化物，活性酯例如對硝基苯基酯，五氟苯酯，4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基酯，或者和N-羥基琥珀酰亞胺或1-羥基苯并三唑形成的酯，它們可通過碳化二亞胺作偶合劑來得到，也可以是硫代酯例如和2-巰基苯并三唑形成的硫代酯。另一些合適的偶合劑是N，N’-羰基二咪唑或基于磷鹽或脲鹽的那些化合物，例如BOP，HBTU，PyBOP，TBTU或TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亞甲基氨基-1，1，3，3-四甲基]脲四氟硼酸鹽。
式Ⅱ化合物和式Ⅲ的羧酸或其活性衍生物的反應通常在惰性溶劑中例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺中進行，優選在叔堿如吡啶或乙基二異丙基胺存在下進行。當使用取代的苯甲酰氯時，可以存在水并且加入堿如吡啶或碳酸鈉。反應發生于-20°-+50℃范圍內，優選-10°-+30℃之間。
消除保護基R3并形成式Ⅰ化合物是用文獻中公知的方法完成的。例如BOC基團用三氟乙酸除去，Z基團用HBr/冰醋酸或催化氫化法除去，烯丙氧羰基用親核試劑加pd催化劑除去，Fmoc基團用仲胺如哌啶除去。
式Ⅰ的優選化合物是其中R2是下述基團的那些式Ⅰ化合物;即R2是飽和脂族酰基CH3(CH2)nCO，支鏈飽和脂族酰基，優選(CH3)2CH(CH2)nCO或CH3CH2CH(CH3)nCO，不飽和脂族酰基，其中含一個或多個雙鍵且其中一個雙鍵可能是反式或是順式的，優選H2C＝CH(CH2)nCO，(CH3)2CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2CH＝CH)n(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CHCO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO.或H(CH2CCCH3)＝CHCH2)nCO，有一個或多個三鍵的不飽和脂族基，優選HC≡C-(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C-C≡C(CH2)nCO，被苯基或環烷基隔開的脂族酰基，優選 被氧隔開的酰基，優選 并且其中的n是0-20之間的整數特別優選的化合物是下述化合物它們有直鏈或支鏈C12-C15酰基例如十四烷酰基，十三烷酰基，12-甲基十三烷酰基，有一個或多個雙鍵或叁鍵的不飽和C12-C18酰基例如順-10-十五烯酰基，反-9-十六烯酰基，或H(CH2C(CH3)＝CHCH2)3CO，被1-3個苯基和/或又被氧隔開的脂肪酰基例如 其中n是0-8之間的整數。
更為特別優選的化合物是其中含被3個苯基隔開的脂族酰基如
的那些化合物，其中n是0-2之間的整數。
本發明還包括制備式Ⅰ化合物的方法，該方法包括使式Ⅱ化合物 其中R1有上述定義，以及R2是肽化學中公知的氨基保護基，例如是叔丁氧羰基(BOC)，芐氧羰基(Z，CbZ)，芴基甲氧羰基(Fmoc)，或烯丙氧羰基(Alloc)保護基，和式Ⅲ的羧酸進行反應，
其中R2有上述定義。
式Ⅰ化合物的特別有用的藥學上可接受的鹽是和無機或有機酸形成的鹽，例如和鹽酸，硫酸，乙酸，檸檬酸，對甲苯磺酸形成的鹽，以及和無機或有機堿如NaOH，KOH，Mg(OH)2，二乙醇胺，亞乙基二胺，形成的鹽，或是和氨基酸例如如精氨酸，賴氨酸，谷氨酸形成的鹽，它們可通過標準方法制備。
本發明的一個或多個脂肽或其鹽由于它們可貴的藥理學性質因而可用作藥物使用。
本發明的物質有藥理學活性，特別是作為抗革蘭氏陽性菌的抗菌劑，尤其特別是對于MRSA和抗糖肽類菌株。
經常僅僅糖肽類如萬古霉素或teicoplanin對能進一步產生抗菌素抗性的抗青霉素或抗甲氧苯青霉素菌株(MRSA株)具有足夠的治療效果，但對這些抗菌素有抗性的菌株不斷出現(FEMSMicrobiol.Lett.98(1992)109-116)。本發明的一個或多個脂肽類化合物對于有上述問題的菌類具有優異的效果。
本發明還涉及本發明的一個或多個脂肽類化合物或其鹽的藥物組合物。
本發明的一個或多個脂肽類化合物，優選其中酰基R2中有三個苯基的一個或多個化合物原則上不同稀釋即可給藥，但較好的用藥方法是和助劑，載體或稀釋劑混合使用。在用作獸藥時可以用食品混合物作為載體，在用作藥劑情況下，可以使用所有藥理學上可接受的載體和/或助劑。
本發明的藥物通常可口服或非腸道給藥，但原則上講也可以直腸給藥。合適的固體或液體藥劑的實例是顆粒劑，粉劑，片劑，包衣片劑，(微)膠囊，栓劑，糖漿，乳劑，懸浮劑，氣霧劑，滴劑，安瓶形式的注射溶液以及活性物質可以緩釋的產品。在其制備過程中通常可以使用賦形劑，添加劑和/或各種助劑，如崩解劑，或粘合劑，涂敷劑和膨脹劑，滑動劑或潤滑劑，調味劑或甜味劑或增溶劑。可以提出的經常使用的賦形劑或助劑的實例是碳酸鎂，二氧化鈦，乳糖，甘露醇及其它糖，滑石粉，乳白蛋白，明膠，淀粉，維他命，纖維素及其衍生物，動物油或植物油，聚乙二醇和溶劑如無菌水，醇類，甘油及多羥基醇。
可以提出的稀釋劑的實例是聚乙二醇，乙醇和水。緩沖物的實例是有機物如N，N’-二芐基亞乙基二胺，二乙醇胺，亞乙基二胺，N-甲基葡糖胺，N-芐基苯乙胺，二乙胺，三(羥甲基)氨基甲烷，或者是無機化合物如磷酸鹽緩沖劑，碳酸氫鈉，碳酸鈉等。以及無賦形劑或稀釋劑的合適形式的活性物質給藥也是可以的。工Ⅰ化合物或其藥學上可接受的鹽的合適的劑量對每個體體重約75kg的成人每天約為0.4g，優選0.5g到最大20g。通常也可以單劑或多次劑給藥，單劑可含約50-1000mg活性物質。
合適的話，口服給藥的劑型可以是微囊，這樣可以緩慢釋放或延遲較長時間，例如在聚合物，蠟等中以合特定的形式涂或包進活性物質。
藥用產品優選以劑型形式生產和給藥，每個劑型含一定劑量的一個或多個本發明的脂肽化合物作為活性成份。在如片劑，膠囊和檢劑的固體劑型中，劑量每天可以到約200mg，但優選0.1-100mg，在安瓶形式的注射溶液中，劑量每天可以到約200mg，但優選0.5～100mg。
每日給藥劑量依賴于哺乳動物的體重，性別，年齡和其它狀況。但在某些情況下較多或較低的日劑量也是可以的。日劑量可以一劑型形式一次給藥，也可以以許多較小的劑型給藥，以及可以間隔一定時間分劑量多次給藥。
本發明的藥物是通過將本發明的一個或多個脂肽化合物和常規的賦形劑及合適的話還有添加劑和/或助劑一起較變成合適的給藥形式制備出來的。
酰基R2中帶三個苯基的特別優選的式Ⅰ化合物(實施例55，56)具有十分好的毒理學性質。在標準的溶血試驗中，它們實際上未顯示出血細胞溶解的證據，而直鏈或支鏈脂族酰基的所有試驗化合物，包括天然物質均顯示出16-25%的極大活性(見表1)表1離體試驗中的溶血活性表1
1)發酵產物Ⅰ(R1＝OH，R2＝(CH3)2CH(CH2)9CH＝CHCH2CO)2)使用從恒河猴靜脈取出的新鮮血液測定溶血活性，將血液放進肝素化的試管里，每份取200μl放入12個聚乙烯的小管中，往其中一份中加200μl蒸餾水，它作為100%的標準，另一份加200μl生理食鹽水(0.9%NaCl)(作為0%標準)，往其余的小管中加入分別含1600，800，400，200，100，50，25，12.5，6.25和3.125mg/l試驗化合物的200μl生理食鹽水稀溶液。將所有小管小心旋動并于37℃下保溫3小時，然后往100%標準管中加5ml蒸餾水，其余各支管中各加5ml生理食鹽水，于700g下離心5分鐘。用分光光度計在波長為540nm處測定上清液的吸收來確定溶血情況，將完全溶血的標準吸收(加蒸餾水的)設定為100%，測定試驗產品稀溶液及0%標準的吸收，并以可歸納的最大血溶百分率記錄下來。
按照本發明制備的下述實施例的化合物可進一步說明本發明。
本發明進一步用以下實施例闡明，百分比均為重量百分數，除另有說明以外，在液體情況下的混合比都是體積比。
反應產品的純度用分析用HPLC測定(Merck，Darmstadl，Lichrospher(R)100RP-8，125×4mm，洗脫體系為水加三氟乙酸，pH2.5，0.1%辛基磺酸鈉/乙腈，用UV在220nm處檢測)，結構用電子撞擊質譜(BIO-Q-MS)確定。
為了簡便，以下用術語A 1437環肽表示R2＝H的式Ⅰ化合物。
實施例1A1437環肽的十三烷酰衍生物(式Ⅰ化合物，R1＝HO，R2＝CH3(CH2)nCO)TOTU偶聯法a)十三烷酸的活化113mg(0.527mmol)十三烷酸溶于3.75mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入172.5mg(0.526mmol)TOTU和乙基二異丙基胺(0.5mmol)在DMF中的1.25g溶液(0.4mmol/g)。將該溶液于室溫下放置1小時。
b)偶聯將348mg(0.264mmol)Fmoc衍生物Ⅱ(R1＝OH，R3＝芴基甲氧羰基;實施例69)懸浮于7.2ml無水DMF中，于冰浴上加入2.9g活性溶液a)(0.25mmol)，將形成的淡棕色溶液于室溫下攪拌1.5小時。
c)Fmoc保護基的消除將溶液b)冷卻至10°，加6ml哌啶，混合物于室溫下攪拌1小時，用250ml水稀釋并凍干。
d)提純凍干的殘留物懸浮于100ml水/乙腈(5∶1)中，用1.5ml 2N HCl調節pH至2.0，將澄清的溶液用90g RP18硅膠進行層析(Merck，Art.9303)，用水+0.01%(CF3COOH/乙腈洗脫，洗脫順序為500ml(3∶1的混合物)，500ml(2∶1的混合物)，600ml(1∶1的混合物)，標題化合物出現在1∶1的級份中(VV檢定，220nm)，產量267mg(理論量的78%)，純度為72%。
粗產品用Biichi中壓柱再一次層析(250g RP18，用水+0.01%CF3COOH/乙腈(3∶2)洗脫)將，含產品的級份冷凍干燥。
產量130mg，純度96%C58H93N13O20[1292.5]MS1293實施例2A1437環肽的4-辛基苯甲酰基衍生物化合物 I，R1＝HO， 酰氯法a)偶聯6.6mg(0.005mmol)Fmoc衍生物Ⅱ(實施例69)被溶于200mg吡啶/水(9∶1)中，并于-20℃加入25mg(0.1mmol)4-辛基苯甲酰氯，于室溫將該溶液攪拌4小時，加2ml二噁烷之后于真空下除去溶劑，將殘留物溶在0.2mlDMF中。
b)Fmoc保護基的消除將0.2ml哌啶加到溶液a)中，將混合物于室溫下放置1小時，溶液用5ml水稀釋并凍干。
c)提純凍干的殘留物用10g RP18硅膠進行層析，用水+0.01% CF3COOH/乙腈洗脫，洗脫順序為80ml(3∶1混合物)，80ml(2∶1混合物)，80ml(1∶1混合物)，將1∶1的產品級份凍干。
產量4.6mg(理論量的70%)，純度85%C60H80N13O20[1312.5]MS1313用類似于實施例1的方法得到列于其后的其中R1＝HO及取代基R2如表2指出的那些式Ⅰ化合物。產率為理論量的60-85%之間，純度在75-98%。
表2

用類似實施例2的方法得到下列其中R1＝HO及取代基R2如表3所指出的那些式Ⅰ化合物。產率在理論產率的70-85%之間、純度在80-98%之間表3
用類似于實施例1(化合物59-66)或實施例2(化合物67和68)的方法，得到下列其中R1＝NH2及取代基R2如表4指出的那些式Ⅰ化合物。產率是在理論量的75-85%之間，純度是80-98%。
表4
原料化合物制備實施例69A1437的9-芴基甲氧羰基衍生物 10g(7.67mmol)A 1437(式Ⅰ，R1＝HO，R2＝(CH3)2CH(CH2)7CH＝CHCH2CO)和3.24g(38.35mmol)碳酸氫鈉溶于920ml水和640ml丙酮的混合物中，然后邊監視PH，邊將2.97g(11.5mmol)9-芴甲基氯代甲酸酯在240ml丙酮的溶液于pH8.5下于100分鐘內滴加到上述混合物中，在此期間將反應溶液溫熱到27℃，然后于室溫攪拌1小時，真空下除去丙酮，將水溶液凍干，無色殘留物在攪拌下每次用500ml二氯甲烷萃取兩次，除去低分子量的雜質。
產量12.2g，MS1526.7實施例70A1437環肽的9-芴基甲氧羰基衍生物
10g實施例69的產物和300g的濕的Actinoplanes Utahensis mycelium于1升無菌磷酸鉀緩沖液·(100mmol，pH7.2，50mmol EPTA，0.02%疊氮化鈉)于32℃下攪拌48小時。離心除去生物體，溶液通過500g MCl膠(Mitsubishi制造)過濾，固定該產物，產物用水/甲醇(1∶1)洗脫，濃縮洗脫液以便除去甲醇，水相用500g RP18層析，用水+0.05%三氟乙酸/乙腈(2∶1)洗脫，真空中濃縮產品級份并凍干。
產量6g，MS1318.4實施例714-(2-(4-(2-苯乙基)苯基)乙基苯甲酸第一步33.9g三苯磷加到22.9g4-溴甲基苯甲酸甲酯在1000ml甲苯中的溶液中，回流下將混合物加熱，7小時后完成反應，冷后將產品吸濾。
產量47.6g第二步58.9g第一步得到的產物懸浮在500ml無水四氫呋喃中并冷至0℃，加入120ml1M的雙三甲基硅胺鋰的THF溶液，室溫放置1小時后再將混合物冷至0℃，加入19.3g芪-4-醛，將混合物于50℃下攪拌2.5小時，冷至0℃，沉出的固體被吸濾，殘留物用0.5升THF洗滌，有機相用750ml乙酸乙酯稀釋，用750ml飽和氯化銨溶液洗滌，水相用750ml乙酸乙酯萃取，有機相用硫酸鈉干燥，并濃縮，粗產品用于下一步驟。
產量49.9g第3步26.7g第2步得到的粗產品同5g載于活性炭上的鈀(10%Pd)一起懸浮于1000ml甲醇中，于室溫及大氣壓下氫化3小時，熱濾出催化劑真空濃縮溶液，產品通過硅膠層析提純，用庚烷/乙酸乙酯(10∶1)洗脫。
產量7.4g第4步1.98g步驟3得到的產物懸浮于60ml乙醇中，加入508mgKOH在10ml水中的溶液，于回流下加熱1.5小時，真空下除去乙醇，殘留物溶于500ml乙酸乙酯和200ml水中，用2NHCl調至pH為2將混合物攪拌0.5小時，分出水相，水相再用200ml乙酸乙酯萃取一次，合并有機相，用硫酸鈉干燥，真空濃縮。
標題化合物產量1.86g第5步酰氯1.23g第4步得到的產物懸浮于10ml二氯亞硫酰中，回流下加熱該混合物直至無氣體放出，冷后真空下濃縮，每次用5ml甲苯蒸發2次。
產量1.35g，淺灰色晶體化合物。
實施例724-(2-(4-聯苯基)乙基)苯甲酸第1步類似于實施例71的第2步，6.4g溴化物(實施例71第1步的產物)和1.82g聯苯基-4-醛反應。
產量5.8g第2步5.8g第1步得到的產物，按照和實施例71第3步相似的方法進行加氫，產物經層析提純。
產量970mg第3步950mg第2步得到的產物按照和實施例71第4步相同的方法進行水解。
產量880mg第4步850mg第3步得到的產品按照和實施例71第5步相同的方法和亞硫酰氯反應得到酰氯產量909mg
權利要求
1.式Ⅰ的脂肽A1437衍生物及其藥學上可接受的鹽 其中R1是OH或NH2，R2是直鏈或支鏈，飽和或不飽和脂族C8-C22酰基，它可被苯基或環烷基或氧隔開。
2.按照權利要求1的脂肽衍生物，其中R2是飽和脂族酰基CH3(CH2)nCO，支鏈飽和脂族酰基，優選(CH3)2CH(CH2)nCO或CH3CH2CH(CH3)(CH2)nCO，含一個或多個雙鍵的不飽和脂族酰基，其中的一個雙鍵可以是反式或順式，優選H2C＝CH(CH2)nCO，(CH3)2CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2CH＝CH)n(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CH-CO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO或H(CH2C(CH3)＝CH(CH2)nCO，有一個或多個叁鍵的不飽和脂族基，優選HC≡C-(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C-C≡C(CH2)nCO，被苯基，環烷基隔開的脂族酰基，優選 被氧隔開的酰基，優選 其中n是0-20的整數。
3.按照權利要求1的脂肽衍生物，其中R1是OH或NH2，R2是直鏈或支鏈C12-C15酰基，優選十四烷酰基，十三烷酰基，12-甲基十三烷酰基，有一個或多個雙鍵或叁鍵的不飽和C12-C18酰基，優選順-10-十五烯酰基，反-9-十六烯酰基或H(CH2-C(CH3)＝CHCH2)3CO或被1-3個苯基和/或又被氧隔開的脂族酰基，優選 并且其中n是0-8間的整數。
4.按照權利要求1的脂肽衍生物，其中R1是OH或NH2R2是被3個苯基隔開的脂族酰基，優選 其中n是0-2間的整數。
5.制備式Ⅰ化合物的方法，包括使式Ⅱ化合物 其中R1有上述定義，以及R3是肽化學中公知的氨基保護基;優選叔丁氧羰基(BOC)，芐氧羰基(Z，Cbz)，芴基甲氧羰基(Fmoc)或烯丙氧羰基(Alloc)保護基，和式Ⅲ的羧酸或其羰基被活化的衍生物反應其中R2定義如權利要求1。
6.式Ⅰ的脂肽衍生物作為藥物的用途。
7.含式Ⅰ脂肽衍生物及藥物賦形劑的藥物。
8.式Ⅰ的脂肽衍生物在制備抗細菌感染的藥物方面的用途。
全文摘要
公開了式I的脂肽衍生物，其制備方法和用途，該衍生物中R
文檔編號C07K14/41GK1111640SQ9510362
公開日1995年11月15日 申請日期1995年3月28日 優先權日1994年3月30日
發明者R·拉特利, T·沃爾曼, H·沃爾梅爾, P·海曼尼, D·艾思特 申請人:赫徹斯特股份公司