專利名稱：一種高產肽聚糖的工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵工程技術領域，具體涉及一種耐氧、耐高溫、高產肽聚糖的工程菌及其應用。
背景技術：
在發酵工藝過程中，發酵溫度由于受外界環境、細胞代謝等因素影響，造成發酵體系溫度升高，引起菌體內的脂肪酸、蛋白質等成分變化，影響細胞正常生理活動。然而提高發酵溫度可大大減少工廠生產中冷卻水的消耗，降低發酵成本；同時，發酵溫度的提高可以減少雜菌污染的機會，減少倒灌幾率，所以如何提聞菌株的聞溫耐受:性引起了許多國內外研究者的關注。申請號為200910204295. 3的中國發明專利公開了一株耐高溫釀酒酵母菌及其應用，該發明的釀酒酵母菌是從米酒酒曲中篩選出來并通過高溫馴化得到，該菌株耐受溫度 高達36 44°C、乙醇產率高、可發酵糖范圍廣；申請為201110419568. 3的中國發明專利公開了一株耐高溫、耐高糖的乳酸菌，該發明通過高溫馴化、硫酸二乙酯(DES)誘變和亞硝基弧(NTG)誘變相結合的方法處理原始出發菌種，篩選得到在55°C下生長良好，耐受250g/L葡萄糖的工程菌；申請號為201110360406. 7的中國發明專利公開了一株耐高溫檸檬酸生產菌株，通過離子束注入誘變處理出發菌株及高溫篩選，得到的菌株可耐受42°C的高溫，且在高溫條件下遺傳性狀穩定，產酸水平較高。嗜酸乳桿菌是一類革蘭氏陽性桿菌，其細胞形態呈多樣性，一般形成鏈桿狀或球桿狀，無鞭毛、不運動、無芽孢。該菌屬厭氧或兼性厭氧菌，最適生長溫度為35 38°C，最高生長溫度43 48°C，耐熱性差，在微氧或無氧環境中生長良好，但在有氧條件下生長較緩慢。肽聚糖(peptidoglycan,PG),又稱為粘肽(Mucopeptide)、糖肽(glycopeptide)是細菌尤其是G+菌細胞壁的主要組成成分。它是一種強免疫增強劑(Immunostimulants),能通過誘導各種免疫調控物質的釋放或表達來刺激免疫系統，提高機體免疫功能，發揮自穩調節和抗感染、抗腫瘤效應。Sekine等(1995)曾報道雙歧桿菌完整PG能激活小鼠腹腔巨噬細胞，使其IL-I、IL-6及TNF- α的mRNA表達增強，他認為PG成分在雙歧桿菌提高機體免疫監視功能方面可能起重要作用。馬西藝等(2003)研究認為乳酸桿菌PG能激活NK細胞、腹腔巨噬細胞產生，IFN-Y、TNF和NO，其可能部分街道了它的抗腫瘤作用。而關于嗜酸乳桿菌細胞壁中PG的研究還鮮見報道，且肽聚糖作為功能性食品、新型藥物或飼料添加齊U，在國內研究與開發較少，目前尚無產品上市，更無廠家生產。
發明內容
本發明提供了一種耐氧、耐高溫、高產肽聚糖的工程菌，以解決現有菌株肽聚糖產量不高、菌株生長緩慢和發酵成本過高的問題。一種高產肽聚糖的工程菌，命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)hz sb，保藏號為 CGMCC NO. 6199。
該菌株已于2012年06月08日保藏在位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 6199。該菌株具有良好的耐氧、耐高溫特性，在37 62°C條件下均具有較高的活性，使用MRS液體培養基有氧培養24h，37°C條件下，活菌數達到8. 17 X 109cfu/mL,為原始菌株LA。的6. 92倍；62°C條件下， 活菌數可達5. 89X 109cfu/mL ;同時，該菌株每IOOOmL發酵液，可得肽聚糖25. 89g，為原始菌株LAtl的4. 53倍。本發明還提供了一種利用所述工程菌生產肽聚糖的方法，包括(I)將所述嗜酸乳桿菌hzsb活化后接種至發酵培養基中進行發酵培養；(2)取發酵液，離心收集菌體；(3)從所述菌體中提取肽聚糖。所述發酵培養基以MRS培養基為基礎培養基，通過正交設計等方法分別進行初始pH、碳源、氮源、碳氮比例以及增值因子的優化。以體積IL計,優化后的發酵培養基包含葡萄糖4 16g、乳糖4 6g、蛋白胨14 16g、酵母粉9 llg、番茄汁145 155ml、胡蘿卜汁115 125ml、啤酒55 65ml、吐溫-80 O. 9 I. 1ml、乙酸鈉 4 6g、K2HP04 ·3Η20 2· 6 2. 7g、檸檬酸二胺 I. 8 2. 2g、MgSO4 · 7H20 0. 18 0. 22g、MnSO4 · H2O 0. 045 0. 055g。更優選為，以體積IL計,所述發酵培養基含有葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番茄汁150ml、胡蘿卜汁120ml、啤酒60ml、吐溫_801ml、乙酸鈉5g、K2HP04 ·3Η20
2.62g、檸檬酸二胺 2g、MgSO4 · 7Η200· 2g、MnSO4 · H2O 0. 05g。使用該最優化的培養基在37°C培養嗜酸乳桿菌hzsb菌株，IOh達到對數生長期末期，pH值為4. 01，活菌數達到6. 24X1010cfu/mLo所述胡蘿卜汁和番茄汁的濃度均為I I. 5g/ml，優選為lg/ml。優選地，所述發酵培養基的初始pH值為6. 2 6. 6，更優選為6. 4，在該初始pH值條件下，按4%接種量，37°C培養24h，活菌數均在8. OX 109cfu/mL左右。優選地，所述發酵培養的溫度為37 62°C，更優選為37°C ;所述發酵培養的時間為10 14h，更優選為12h ;所述嗜酸乳桿菌hzsb在所述發酵培養基中的接種量為4%。本發明的嗜酸乳桿菌hzsb在上述優化后的發酵培養基中發酵培養，當發酵培養基的初始pH值為6. 4、培養溫度為37°C、培養時間為12h時，每1000ml發酵液中，可得25. 89g肽聚糖，為原始菌株的4. 53倍。就肽聚糖的提取方法而言，可以是現有技術中的提取方法，本發明所采用的提取肽聚糖的方法為(I)將所述菌體裂解，去除胞內物，得到破碎的菌體；(2)對破碎的菌體進行脫脂、蛋白酶酶解處理，制得所述肽聚糖。所述菌體裂解，去除胞內物的方法為將所述菌體懸浮于三氯乙酸溶液，水浴加熱裂解菌體，完成后離心收集沉淀；菌體與三氯乙酸的體積比一般在I : 10，三氯乙酸濃度達到10%，水浴溫度選擇為70°C，2h以上就可以完成裂解，離心轉速為8000r/min，離心收集的沉淀最好有生理鹽水清洗三次以上。
所述脫脂是指將沉淀溶于有機溶劑中，攪拌一定時間后離心分離，脫脂采用的有機溶劑選用乙酸鈉、氯仿和甲醇混合液，體積比優選為4 5 10，沉淀與有機溶劑的重量體積比為I : 20,離心轉速同樣為8000r/min。所述酶解為將沉淀溶于含胰酶和堿性蛋白酶的磷酸緩沖液，37°C水浴振蕩反應10h。酶解完成后肽聚糖處于溶液狀態，可以將酶解液離心，收集沉淀，沉淀經無菌水清洗后進行真空冷凍干燥，制得固態狀的肽聚糖；離心轉速選擇為12000r/min，磷酸緩沖液的pH值一般為8.0。本發明的有益效果本發明綜合應用了傳統的馴化育種、誘變育種及基因重組等手段構建一株具有明顯的耐氧、耐高溫性、生長周期短、遺傳形狀較穩定的高產肽聚糖工程菌株，并提供了實用性強、操作簡單、周期短、步驟簡便合理的肽聚糖提取方法，解決了嗜酸乳桿菌在有氧條件 下生長緩慢的問題，有效提高了肽聚糖的產量，同時大大減少大規模發酵生產中冷卻水的消耗,顯著降低發酵成本,具有成本低、產率高、適宜規模化生產等優點。
圖I是不同碳源對hzsb菌株生長情況的影響圖。圖2是不同氮源對hzsb菌株生長情況的影響圖。
具體實施例方式以下實施例所使用的培養基組分及其濃度如下MRS培養基葡萄糖20g、酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、吐溫-80lml、乙酸鈉5g、K2HPO4 · 3H20 2. 62g、檸檬酸二胺 2g、MgSO4 · 7Η200· 2g、MnSO4 · H2O 0. 05g，加蒸餾水至1000ml，調pH6. 4，固體培養基加入15g瓊脂，120°C滅菌30min。發酵培養基葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番爺汁150ml、胡蘿卜汁120ml、啤酒60ml、吐溫-801ml,乙酸鈉5g、K2HPO4 · 3H20 2. 62g、檸檬酸二胺2g、MgSO4 · 7H20 O. 2g、MnSO4 · H2OO. 05g，加蒸餾水至 1000ml，調 ρΗ6· 4，120°C滅菌 30min。再生培養基基礎培養基MRS (不含吐溫-80)、明膠25. 0g、MgCl25. 0g、CaCl22. 8g、蔗糖 171. 2g、胎牛血清(BSA) 5. OmL、瓊脂 15 18g，調 ρΗ6· 4，121°C 滅菌 20min。高滲溶液0.01mol/L Tris_HCl、20mmol/L MgCl2、0. 5mol/L 鹿糖,去離子水配制，調ρΗ7· 0,121°C滅菌20min，4°C保存備用。35% PEG溶液PEG_600035g，用高滲溶液溶解，配成IOOmL PEG溶液。溶菌酶酶溶液稱取Ig溶菌酶(酶活> 20000U/mg)溶解在IOOmL高滲溶液中，配成終濃度為10mg/mL的酶溶液，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C保存備用。實施例I :耐氧嗜酸乳桿菌的篩選(I)菌株的活化與培養嗜酸乳桿菌原始菌株(CGMCC I. 1878)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，接種于10%脫脂乳中，于37°C、24h活化2次，然后按4%接種量接入MRS液體培養基中進行繼代培養24h后，備用。
(2)嗜酸乳桿菌的逐級有氧馴化取活化的嗜酸乳桿菌LA。為出發菌株，于MRS液體培養基中(C0217% )，37°C增菌培養24h，制得增菌液涂布于MRS瓊脂平板，置CO217%厭氧培養箱中培養；挑取單菌落接種于MRS液體培養基中，進行微厭氧培養(CO215 % +O2 2% ),制得菌液涂布于MRS瓊脂平板，置C0215% +025%環境中培養；重復以上步驟，逐漸使CO2和O2的含量接近于大氣，篩選得到兩株具有耐氧能力的嗜酸乳桿菌LAn-I和LAn-2。將LAn-I和LAn_2接種于MRS培養基，37°C培養48h，可見菌落呈圓形、隆起、乳白色、光滑、直徑I 2_，與馴化前的菌落形態無差別。通過革蘭氏染色驗證為革蘭氏陽性菌，電鏡掃描觀察細胞為鏈桿狀或球桿狀，約(O. 6 O. 9) X (I. 5 6) μ m,無鞭毛，不運動。 實施例2 :耐高溫嗜酸乳桿菌突變株的篩選(I)60Co-Y射線誘變育種取生長至對數生長中后期的耐氧嗜乳酸桿菌LAn-I菌液，6000r/min離心lOmin，用無菌生理鹽水洗滌沉淀2次，收集菌體并懸浮于無菌生理鹽水中，配成濃度為IO8個/mL菌液用于誘變，誘變劑量1400Gy。(2)化學誘變育種用O. lmol/L磷酸緩沖液(pH7. O)制備新鮮的耐氧嗜乳酸桿菌LAn_2菌懸液，細胞濃度控制在IO8個/mL左右，加入I. 0% (v/v)硫酸二乙酯(DES)，混勻后在37°C下水浴40min,加入等體積的終止劑2%的硫代硫酸鈉,終止誘變,6000r/min離心IOmin,再用磷酸緩沖液洗滌沉淀2次，最后用生理鹽水將菌體稀釋。(3)突變株的篩選經過6tlCo- Y射線和DES誘變處理后的菌液涂布于MRS瓊脂平板上，以出發菌為對照，于45、50、55、60、65、70°C條件下培養48h。將其中生長較快、菌落較大的菌株挑出，進行搖瓶復篩。最終篩選得到5株在55°C條件下生長周期較短、耐溫性較好的突變菌株。(4)基因組重組及篩選將步驟(3)獲得的5株突變菌株在55°C、MRS培養基中培養到對數生長中后期，各取5mL菌液混合后離心，用高滲溶液洗滌2次，重新收集菌體懸浮于8mL溶菌酶溶液中，37°C水浴處理45min制備原生質體。酶解結束后以5000r/min離心lOmin，高滲溶液洗滌沉淀2次,然后加入8mL 35% PEG溶液,37°C水浴保溫2min, 5000r/min離心lOmin,棄上清液，用2mL高滲溶液充分懸浮，然后涂布于再生培養基平板上，置于55 70°C條件下培養48h，將其中生長較快、菌落較大的菌株挑出，進行搖瓶復篩。篩選得到生長速度快、耐溫性好的重組菌作為第一輪菌株Fl，進行下一輪的原生質體制備、融合與篩選，所得重組菌株作為第二輪菌株F2，依次類推進行5輪改組。(5)遺傳穩定性檢測將步驟(4)中經過5輪改組后篩選得到的重組菌株，接種MRS液體培養基，連續傳代10次，最終獲得一株生長周期短、具有明顯的耐高溫性、遺傳形狀較穩定的重組菌株。該菌株在37 62 °C條件下均具有較高的活性，其在MRS液體培養基中，37 °C條件下培養24h，活菌數達到8. 17X109cfu/mL，為原始菌株LAtl的6. 92倍；62°C條件下培養24h，活菌數達到5. 89X 109cfu/mL。通過形態學及生化特性鑒定表明，該菌株為革蘭氏陽性桿菌，與原始菌株LAtl相t匕，菌落形態及菌體形態特征基本一致，但更為纖細，生化特性未發生改變，屬嗜酸乳桿菌。將該菌株于2012年06月08日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中，命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb,保藏編號CGMCC NO. 6199。實施例3 :發酵培養基(增菌培養基)的優化(I)培養pH條件的確定考慮到生產工藝要求培養基必須基于菌體產量高、容易分離收獲細胞，因此選用易分離菌體的MRS培養基為基礎發酵培養基，并在此基礎上進行優化改良。用無菌的HCl或NaOH溶液調節培養基的初始pH，得到一系列pH不同的培養基，按4%接種量，37°C培養24h，檢測活菌數，最終確定培養基初始pH值為6. 4。(見表I) 表I初始pH值對hzsb菌株活菌數的影響
權利要求
1.一種高產肽聚糖的工程菌，其特征在于，命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)hzsb，保藏號為 CGMCC NO. 6199。
2.一種利用如權利要求I所述工程菌生產肽聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將所述嗜酸乳桿菌hzsb活化后接種至發酵培養基中進行發酵培養； (2)取發酵液，離心收集菌體； (3)從所述菌體中提取肽聚糖。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，以IL計，所述發酵培養基包含葡萄糖4 16g、乳糖4 6g、蛋白胨14 16g、酵母粉9 llg、番爺汁145 155ml、胡蘿卜汁115 125ml、啤酒 55 65ml、吐溫-800. 9 I. 1ml、乙酸鈉 4 6g、K2HPO4 · 3Η20 2· 6 ·2.7g、檸檬酸二胺 I. 8 2. 2g、MgSO4 · 7Η200· 18 O. 22g、MnSO4 · H2O O. 045 O. 055g。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的初始pH值為6.2 6.6。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養的溫度為37 62°C。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養的時間為10 14h。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取肽聚糖的方法為 (1)將所述菌體裂解，去除胞內物，得到破碎的菌體； (2)對破碎的菌體進行脫脂、蛋白酶酶解處理，制得所述肽聚糖。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌體裂解的方法為將所述菌體懸浮于三氯乙酸溶液，水浴加熱裂解菌體，完成后離心收集沉淀。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述脫脂采用的溶劑為乙酸鈉、氯仿和甲醇的混合液。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶為胰酶和堿性蛋白酶的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種高產肽聚糖的工程菌及其應用，高產肽聚糖的工程菌命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb，保藏號為CGMCCNO.6199；該菌株通過菌種馴化、誘變育種及基因重組技術手段構建；將所述嗜酸乳桿菌hzsb活化后接種至發酵培養基上進行發酵培養；取發酵液離心收集菌體；從菌體中提取肽聚糖，每1000ml發酵液中，可得25.89g肽聚糖，為原始菌株的4.53倍。
文檔編號C08B37/00GK102876606SQ20121035956
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者胡向東, 葉茂, 胡偉卿, 朱靜, 許美芳 申請人:杭州世博生物技術開發研究所有限公司