一種利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法

一種利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，屬于生物法合成及提純【技術領域】。針對發酵液中目標提取物與雜質分子量的分布特性，結合現代膜分離技術，對不同分子量的γ-PGA進行有效分離，主要步驟為：降低粘度后硅藻土過濾除菌，加熱結合超濾除雜蛋白及大分子活性有機物，陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質，脫色后納濾除小分子氨基酸、離子雜質，超濾分級提取，得到不同分子量的精制γ-PGA。提取收率穩定在92%以上，高于文獻報道最高收率90.6%，超濾納濾結合技術精制不同分子量的γ-PGA，市場針對性更強，可以做到按需生產，以專業化提高了經濟效益。
【專利說明】一種利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于生物法合成及提純【技術領域】，特別涉及一種分離提純生物發酵液中不同分子量生物可降解高分子材料一聚谷氨酸的方法。
【背景技術】:[0002]在環境日益惡劣、資源日益匱乏的今天，尋找一種用途廣泛且可以降解的生物高分子材料就顯得尤為重要。Y-聚谷酸(Y-Polyglutamicacid)簡寫Y-PGA是某些芽孢桿菌(Bacillus)合成的一種細胞外高分子聚合化合物，它以谷氨酸為唯一單體，是由L 一谷氨酸(L一Glu)、D —谷氨酸(D — Glu)通過酰胺鍵結合形成的一種多肽分子，Y-PGA在體內被酶分解為谷氨酸，進入三羧酸循環，無毒副作用，在自然環境中，Y-PGA徹底分解或燃燒后，生成二氧化碳和水，對環境沒有任何污染。因此，Y-PGA是一種極具潛力的高分子材料，利用Y -PGA制成的水凝膠不僅保留了普通水凝膠材料的基本特性，還具有結構可控性、高吸水性、較高機械強度、生物可降解性等特性。特別是通過芽孢桿菌發酵生產獲得的Y-PGA，其分子鏈上有大量活性較高的側鏈羧基，具有良好的高吸水性(1:3500, m/v)、生物相容性、生物降解性、無毒無害等優點，可作為化妝品添加劑、保水劑、高吸水樹脂、重金屬吸附劑、食品添加劑、醫藥載體、組織工程材料等廣泛應用于化妝品、食品、農業、醫藥、合成纖維和涂膜等領域。
[0003]20世紀90年代以來，日本、美國等一些發達國家對Y-PGA的制備和應用的研究十分活躍，微生物發酵法生產Y-PGA的技術也處在世界的前列，以味之素株式會社、明治制果公司和廣崎大學為代表的國外單位對Y-PGA的性能，合成和應用做了較深入地研究，Y-PGA已有商業產品，我國在這方面研究的相對較少，中國臺灣在Y-PGA發酵生產研究也有很大進展，中國大陸對Y-PGA大量投產生產的研究還欠缺，尤其是在黏稠的發酵液中，對分子量在一定范圍內的Y-PGA來說，提取Y-PGA的效率只有40~50%，造成大量Y-PGA浪費和損失。
[0004]Y-PGA作為一種全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子產品，相對分子質量(Mw)在IO4-1O6的范圍內，可以制成不同相對分子質量的產品應用于各種不同領域。如化妝品級、食品級的Y-PGA分子量為70萬；藥品級的分子量是100萬；污水處理級的分子量是100萬；土壤、植物調節劑級的分子量20萬以下等。
[0005]采用酸堿滴定法測定游離型Y -PGA的pKa值，得到Y -PGA的pKa=2.23，該值與谷氨酸的α-羧基的pKa值大體一致。利用TGA和DSC進行熱性質的分析，得出其熱分解溫度為235.90C，熔點為223.5°C。Y -PGA酸水解后用GITC做衍生化試劑，HPLC測得、-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值穩定在D:L=3:2。一般而言，由芽孢桿菌產生的Y-PGA的平均分子量(Mw)在IO4-1O6之間，本專利中，用實驗室生物發酵法產出Y-PGA的分子量(Mw)分布在5 X IO4-1O6之間。
[0006]膜分離技術利用膜對混合物中各組分的選擇透過性來分離、提取、和濃縮目的產物，膜分離過程在常溫下進行，無相變，能耗低，設備簡單，操作控制方便，已在化工、醫藥、輕工、食品、紡織、電子、冶金等多個領域得到應用。適用于發酵液處理的膜分離技術有微濾、超濾、納濾和反滲透。微濾截留0.01~10um以上的粒子，如菌體、細胞、不溶物等，常用超濾預處理過程；超濾膜截留分子量5000~500000，膜孔徑1~20nm，可以截留病毒、蛋白質、酶、多糖等大分子物質；反滲透只允許溶劑分子通過，鹽、氨基酸等小分子物質也被截留；納濾膜平均孔徑2nm，截留組分可小到抗生素、合成藥、染料、二糖等，允許水、無機鹽、有機物等小分子物質通過，截留性能介于超濾和反滲透之間。膜材料可分為高分子膜、無機膜和液體膜，常用的是高分子膜，其次是無機膜。膜結構可分為對稱膜和非對稱膜，超濾通常為非對稱膜，非對稱膜中起截留作用的是致密的表面皮層，其厚度僅0.1~15um，在皮下有多孔網狀結構和支撐層，支撐層厚度在50~250um，這樣既保證對大分子物質的有效截留，又降低分離操作時膜對阻力。提高了膜通量，也具有了一定的機械強度。
[0007]y -PGA是一種胞外產物，其發酵液很黏，用一般的離心法去除菌體很難，且不適用于工業大規模應用。為了降低去除菌體的能量消耗和節省用于沉淀的有機溶劑用量，D0.J.H等對原工藝進行優化，提出了一種高效分離Y-PGA的方法。該方法由兩步組成:首先調PH至3.0使粘度降低，再離心除菌體，這樣使得離心能量降為原來的17% ;然后對去菌液回調至PH5.0，用中空纖維膜進行過濾，使得發酵液上清由原來的20g/L，濃縮至60g/L，提取所需的乙醇用量減少為原來的1/4，降低了提取Y-PGA的成本。但是這種方法，因為沒有除去其他雜質，所以截留過程對纖維膜的要求較高，而且離心除菌難以放大工業生產。專利《從發酵液中分離提取Y-聚谷氨酸的方法》，申請號201010188232.6中提到，用超濾膜除去小分子色素和雜質，但提取工藝中多次調節PH，會引入大量離子，用蛋白酶酶解少量蛋白質方法也同樣引入雜質，沒有綜合利用膜進行提取，不適合放大生產。專利《Y -聚谷氨酸的一種分離純化方法》，申請號201210396366.6中提到，活性炭和硅藻土抽濾后，直接用來超濾濃縮，這種處理方式在工業上放大很容易造成堵膜現象，而洗膜程序使提取步驟繁瑣，該工藝不宜放大工業生產。專利《一種Y-聚谷氨酸的提取方法》，申請號201010177020.8中提到，酶解蛋白后用2~3倍乙醇進行醇沉，在用超濾濃縮法進行除雜，最后凍干，此工藝中，用到大量乙醇，增加工業應用的危險性，也并沒有提到根據Y-PGA分子量不同而進行有效提取。文獻報道，提取不同分子量的Y-PGA大多是改變發酵條件來盡量生產分子量接近的Y-PGA，但實際生產工藝中，Y-PGA分子量較大，很難在生產中精確控制Y-PGA分子量，往往產出Y-PGA是在一定的分子量范圍內分布，而傳統提取工藝中，未有涉及在同一批發酵液中根據分子量不同而精確提取Y-PGA，因此，在提取工藝中，發酵液粘度的降低，同時后續分離中如何根據分子量不同而高效提取Y-PGA、降低成本一直是困擾地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)發酵制備Y -PGA的主要問題，需高度重視。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種從Y-PGA發酵液中高效提取Y-PGA的方法，所用菌種為地衣芽孢桿菌，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC3336。具體見天津北洋百川生物技術有限公司申請號為200910228297的發明專利《惰性載體固態發酵法生產Y-聚谷氨酸的方法》，采用的發酵方法為該公司發明的一種高效低耗的發酵方法，具體見申請號201110216717.6的發明專利《一種大量生產Y _聚谷氨酸的方法》。發酵液中主要雜質是大分子蛋白(且多屬熱變性蛋白)、多糖、色素以及一些小分子氨基酸、鹽類和其他小分子有機雜質等，產生Y-聚谷氨酸的分子量(Mw)分布在5X 104-5X IO5之間。本發明針對發酵液中目標提取物與雜質分子量的分布特性，結合現代膜分離技術，提供一種高效提取Y -PGA的方法，使Y -PGA總收率大于92%，高于目前文獻公布最高水平90.6%，并且對不同分子量的Y-PGA進行有效分離，根據分子量不同應用在不同領域。傳統提取方法中，醇沉步驟乙醇的使用量一般為物料的4~6倍，本發明降低為2~3倍，，大大減少了有機溶劑的使用，使成本降低了 30%以上，同時也降低了危險度。
[0009]一種利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，包括如下步驟:
[0010]一、發酵液制備:將編號CGMCC3336的地衣芽孢桿菌發酵培養，得發酵液；
[0011]二、發酵液提取
[0012](1)除菌體
[0013]將發酵液PH調至3.0，粘度降低至原來的1/6，加入2%_3%(m:v)硅藻土，800目濾布，板框過濾除菌體，0.22MPa壓力，流速30~50ml/min。
[0014](2)除雜蛋白及大分子活性有機物
[0015]去除菌體的發酵液調PH6~7，加熱升溫至90°C保溫20min，使蛋白變性，除去熱變性蛋白，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白。
[0016](3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質
[0017]按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，能去除大部分金屬離子和帶正電荷雜質，離子交換結束后，回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除。
[0018](4)脫色
[0019]加入1%~2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色90~120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著。
[0020](5)除小分子氨基酸、離子雜質
[0021]發酵液稀釋2~3倍后過納濾膜，經檢測，能去除大部分氨基酸、多肽、寡糖、鹽離子等小分子雜質。
[0022](6)超濾分級提取
[0023]采用5萬~50萬超濾膜對上述處理過的清液進行加壓循環超濾濃縮，0.1um中空纖維膜分尚分子量15萬上下的Y-PGA, 500kDa超濾膜分尚分子量35萬上下的y-PGA。分別得到分子量不同的清液:分子量〈15萬的Y-PGA清液；分子量在15萬~35萬的Y-PGA清液，分子量大于35萬的Y-PGA清液。分子量小于15萬的Y-PGA進行5kDa超濾濃縮進一步除去小分子雜質；分子量大于15萬的Y -PGA清液進行2~3體積倍醇沉，沉淀物溶解于原體積1~2倍的水中。將上述溶液分別噴霧干燥，得到精制Y-PGA。
[0024]作為上述技術方案的優選方案，本發明利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，包括如下步驟:
[0025]一、菌種活化:
[0026]將編號CGMCC3336的菌種在固體培養基斜面上于37°C培養16個小時，制備成熟的斜面種子。
[0027]二、種子培養:
[0028]將活化后的斜面種子接入一環裝有50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，37°C，220rpm，培養16個小時到對數生長期。
[0029]三、發酵培養:
[0030]將種子培養液接入發酵培養液中，接種量為10%，220rpm下培養72h，發酵罐為10L，裝液量為60%，當殘糖降至5g/L時補加流加培養基至發酵結束前4小時，流加速度為lml/min。下罐 Y -PGA 產量為 30g/L ~45g/L。
[0031]四、發酵液提取
[0032](I)除菌體
[0033]將發酵液PH調至3.0，粘度降低至原來的1/6，加入2%_3%(m:v)硅藻土，800目濾布，板框過濾除菌體，0.22MPa壓力，流速30~50ml/min。
[0034](2)除雜蛋白及大分子活性有機物
[0035]去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH6~7，加熱升溫至90°C保溫20min，使蛋白變性，除去熱變性蛋白，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白。
[0036](3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質
[0037]按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，能去除大部分金屬離子和帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除。
[0038](4)脫色
[0039]加入1%~2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色90~120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著。
[0040](5)除小分子氨基酸、離子雜質
[0041]發酵液稀釋2~3倍后過納濾膜，經檢測，能去除大部分氨基酸、多肽、寡糖、鹽離子等小分子雜質。
[0042](6)超濾分級提取
[0043]采用5萬~50萬超濾膜對上述處理過的清液進行加壓循環超濾濃縮，0.1um中空纖維膜分尚分子量15萬上下的Y-PGA, 500kDa超濾膜分尚分子量35萬上下的y-PGA。分別得到分子量不同的清液:分子量〈15萬的Y-PGA清液；分子量在15萬~35萬的Y-PGA清液，分子量大于35萬的Y -PGA清液。分子量小于15萬的Y -PGA進行5kDa超濾濃縮進一步除去小分子雜質；分子量大于15萬的Y -PGA清液進行2~3體積倍醇沉，沉淀物溶解于原體積I~2倍的水中。將上述溶液分別噴霧干燥，得到精制Y-PGA。
[0044]培養基配制方法如下:
[0045](I)斜面培養基:酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaC15.0，瓊脂20，上述組分單位為g/L, pH7.0±0.1。121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
[0046](2)種子培養基:酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4.H2O0.5，MgSO4.6Η200.5，上述組分單位為g/L, ρΗ7.0±0.I。121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0047](3)發酵培養基:葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH4N034.1、NaCllO,MgSO4.6Η200.5、CaCl2.6Η201.0、FeCl3.6Η200.01，上述組分單位為 g/L, PH7.0。121。。高壓蒸汽滅菌20min。
[0048]流加培養基成分:葡萄糖900、NH4N0360、CaCl2.6H2020、FeCl3.7H200.15，上述組分單位為g/L, PH7.0,12111C高壓蒸汽滅菌20min。[0049]有益效果:
[0050]本發明與現有技術相比:第一，采用板框過濾方法除菌，克服了傳統離心法去除菌體困難的問題，有效降低了發酵法生產Y-PGA過程中，在除菌方面的成本，大大提高了除菌效果，可有效應用于工業化大生產中；第二，在提取過程中，根據發酵液物質分子不同的特性，進行離子交換除雜和膜過濾除雜，大大提高提取效果，節能降耗，利于工業化大生產的實現；第三，超濾納濾結合技術精制不同分子量的Y-PGA，市場針對性更強，可以做到按需生產，以專業化提高了經 濟效益；第四，大大減少了有機溶劑的使用，使成本降低了 30%以上，同時也降低了危險度；第五，采用噴霧干燥技術，得到的Y-PGA為白色粉末，比凍干容易實現，節省能源，且更高效，外觀形態也更好；第六，提取收率穩定在92%以上，高于文獻報道最高收率90.6%。
【具體實施方式】
[0051]實施例1
[0052]一、培養基配制:
[0053](I)斜面培養基:酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaC15.0，瓊脂20，上述組分單位為g/L, pH7.0±0.1。121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
[0054](2)種子培養基:酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4.H2O0.5，MgSO4.6Η200.5，上述組分單位為g/L, ρΗ7.0±0.I。121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0055](3)發酵培養基:葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH4N034.1、NaCllO,MgSO4.6Η200.5、CaCl2.6Η201.0、FeCl3.6Η200.01，上述組分單位為 g/L, PH7.0。121。。高壓蒸汽滅菌20min。
[0056]流加培養基成分:葡萄糖900、NH4N0360、CaCl2.6H2020、FeCl3.7H200.15，上述組分單位為g/L, PH7.0,12111C高壓蒸汽滅菌20min。
[0057]二、菌種活化:
[0058]將編號CGMCC3336的菌種在固體培養基斜面上于37°C培養16個小時，制備成熟的斜面種子。
[0059]三、種子培養:
[0060]將活化后的斜面種子接入一環至50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37°C，220rpm，培養16個小時到對數生長期。
[0061]四、發酵培養:
[0062]將長好的種子培養液接入發酵培養液中，接種量為10%，轉速220rpm，培養72h，發酵罐為10L，裝液量為6L，當發酵過程中殘糖降至5g/L時補加流加培養基至發酵結束前4小時，流加速度為lml/min。下罐體積為5.9L，Y-PGA產量為45g/L。
[0063]五、發酵液提取
[0064](I)除菌體:將發酵液PH調至3.2，粘度由83.4mPa.s降低至16.9mPa.S，加入2%質量體積百分比的硅藻土，800目濾布，0.22MP壓力，板框過濾除菌體，流速36ml/min。
[0065](2)除雜蛋白及大分子活性有機物
[0066]去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH6.7，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白。[0067](3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質[0068]按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至9%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除。
[0069](4)脫色
[0070]加入1%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色90min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4.5L。
[0071](5)除小分子氨基酸、離子雜質
[0072]稀釋至IOL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至1/8，Glu含量降低至1/7，得清液9L。
[0073](6)超濾分級提取
[0074]上述9L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速15ml/min，得到44.4%透過液和50%—級截留液。將透過液經50kDa超濾膜，0.1MP壓力過濾，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液1.8L，經檢測，Y -PGA含量為40g/L，平均分子量在12萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末62.1g0
[0075]大分子量的Y-PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液經500kDa超濾膜進行超濾，流速4ml/min，收集50%透過液和44%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為45g/L和43g/L，平均分子量約為28萬和45萬，分別加入2.5倍體積乙醇進行醇沉，將絮凝部分分別復溶至2.5L，分別進行噴霧干燥，得到平均分子量分別為28萬和45萬的
Y-PGA白色粉末，分別是99.2g和90.4g。總收率為92.4%。
[0076]實施例2
[0077]—、培養基配制:
[0078](I)斜面培養基:酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaC15.0，瓊脂20，上述組分單位為g/L, pH7.0±0.1。121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
[0079](2)種子培養基:酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4.H2O0.5，MgSO4.6Η200.5，上述組分單位為g/L, ρΗ7.0±0.I。121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0080](3)發酵培養基:葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH4N034.1、NaCllO,MgSO4.6Η200.5、CaCl2.6Η201.0、FeCl3.6Η200.01，上述組分單位為 g/L, PH7.0。121。。高壓蒸汽滅菌20min。
[0081]流加培養基成分:葡萄糖900、NH4N0360、CaCl2.6H2020、FeCl3.7H200.15，上述組分單位為g/L, PH7.0,12111C高壓蒸汽滅菌20min。
[0082]二、菌種活化:
[0083]將編號CGMCC3336的菌種在固體培養基斜面上于37°C培養16個小時，制備成熟的斜面種子。
[0084]三、種子培養:
[0085]將活化后的斜面種子接入一環至50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37°C，轉速220rpm，培養16個小時到對數生長期。
[0086]四、發酵培養:[0087]將長好的種子培養液接入發酵培養液中，接種量為10%，轉速220rpm，培養72h，發酵罐為10L，裝液量為6L，當發酵過程中殘糖降至5g/L時補加流加培養基至發酵結束前4小時，流加速度為lml/min。下罐體積6L，Y-PGA產量為42g/L。
[0088]五、發酵液提取
[0089](I)除菌體:將發酵液PH調至3.0，粘度由76.4mPa.s降低至14.3mPa.S，加入
2.5%質量體積百分比的硅藻土，800目濾布，0.22MP壓力，板框過濾除菌體，流速34ml/min。
[0090](2)除雜蛋白及大分子活性有機物
[0091]去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH6.7，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白。
[0092](3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質
[0093]按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至14%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除。
[0094](4)脫色
[0095]加入1.5%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4L。
[0096](5)除小分子氨基酸、離子雜質
[0097]稀釋至IOL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至1/7，Glu含量降低至1/7，得清液9L。
[0098](6)超濾分級提取
[0099]上述9L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速18ml/min，得到49%透過液和44% —級截留液。將透過液過超濾膜(50kDa)，0.1MP壓力，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液2.7L，經檢測，Y -PGA含量為42g/L，平均分子量在11萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末102.4g。
[0100]大分子量的Y-PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液過500kDa超濾膜進行超濾，流速5ml/min，收集44%透過液和42%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為45g/L和40g/L，平均分子量約為28萬和40萬，分別加入3倍體積乙醇進行醇沉，將絮凝部分分別復溶至原體積，分別進行噴霧干燥，得到Y-PGA白色粉末，質量分別為80.3g和57.8g。總收率為92.7%。
[0101]實施例3
[0102]一、培養基配制:
[0103](1)斜面培養基:酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaC15.0，瓊脂20，上述組分單位為g/L, pH7.0±0.1。121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
[0104](2)種子培養基:酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4.H2O0.5，MgSO4.6Η200.5，上述組分單位為g/L，ρΗ7.0±0.I。121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0105](3)發酵培養基:葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH4N034.1、NaCllO,MgSO4.6Η200.5、CaCl2.6Η201.0、FeCl3.6Η200.01，上述組分單位為 g/L, PH7.0。121。。高壓蒸汽滅菌20min。
[0106]流加培養基成分:葡萄糖900、NH4N0360、CaCl2.6H2020、FeCl3.7H200.15，上述組分單位為g/L, PH7.0,12111C高壓蒸汽滅菌20min。
[0107]二、菌種活化:
[0108]將編號CGMCC3336的菌種在固體培養基斜面上于37°C培養16個小時，制備成熟的斜面種子。[0109]三、種子培養:
[0110]將活化后的斜面種子接入一環至50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37°C，轉速220rpm，培養16個小時到對數生長期。
[0111]四、發酵培養:
[0112]將長好的種子培養液接入發酵培養液中，接種量為10%，轉速220rpm，培養72h，發酵罐為10L，裝液量為6L，當發酵過程中殘糖降至5g/L時補加流加培養基至發酵結束前4小時，流加速度為lml/min。下罐體積為5.9L，Y-PGA產量為38g/L。
[0113]五、發酵液提取
[0114](I)除菌體:將發酵液PH調至3.0，粘度由77.2mPa.s降低至15.2mPa.S，加入質量體積百分比為2.5%的硅藻土，800目濾布，0.22MP壓力，板框過濾除菌體，流速36ml/min0
[0115](2)除雜蛋白及大分子活性有機物
[0116]去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH7.0，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白。
[0117](3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質
[0118]按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至12%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除。
[0119](4)脫色
[0120]加入1.2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4L。
[0121](5)除小分子氨基酸、離子雜質
[0122]稀釋至IOL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至1/7，Glu含量降低至1/7，得清液9.2L。
[0123](6)超濾分級提取
[0124]上述9.2L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速20ml/min，得到58%透過液和41%—級截留液。將透過液過超濾膜(50kDa)，0.1MP壓力，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液2.9L，經檢測，Y -PGA含量為40g/L，平均分子量在12萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末108.2g。
[0125]大分子量的Y-PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液過500kDa超濾膜進行超濾，流速5ml/min，收集42%透過液和55%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為36g/L和35.5g/L，平均分子量約為25萬和45萬，分別加入3倍體積乙醇進行醇沉，透過液中絮凝部分復溶至原體積，未透過液醇沉絮凝部分復溶至原體積1.5倍，分別進行噴霧干燥，得到Y -PGA白色粉末。質量分別為70.9g和35.0g。總收率為92.1%。
[0126]實施例4[0127]一、培養基配制:
[0128](I)斜面培養基:酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaC15.0，瓊脂20，上述組分單位為g/L, pH7.0±0.1。121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
[0129](2)種子培養基:酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4.H2O0.5，MgSO4.6Η200.5，上述組分單位為g/L, ρΗ7.0±0.I。121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0130](3)發酵培養基:葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH4N034.1、NaCllO,MgSO4.6Η200.5、CaCl2.6Η201.0、FeCl3.6Η200.01，上述組分單位為 g/L, PH7.0。121。。高壓蒸汽滅菌20min。
[0131]流加培養基成分:葡萄糖900、NH4N0360、CaCl2.6H2020、FeCl3.7H200.15，上述組分單位為g/L, PH7.0,12111C高壓蒸汽滅菌20min。
[0132]二、菌種活化:
[0133]將編號CGMCC3336的菌種在固體培養基斜面上于37°C培養16個小時，制備成熟的斜面種子。
[0134]三、種子培養:
[0135]將活化后的斜面種子接入一環至50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37°C，轉速220rpm，培養16個小時到對數生長期。
[0136]四、發酵培養:
[0137]將長好的種子培養液接入發酵培養液中，接種量為10%，轉速220rpm，培養72h，發酵罐為10L，裝液量為6L，當發酵過程中殘糖降至5g/L時補加流加培養基至發酵結束前4小時，流加速度為lml/min。下罐體積為5.9L，Y-PGA產量為35g/L。
[0138]五、發酵液提取
[0139](I)除菌體:將發酵液PH調至3.2，粘度由78.3mPa.s降低至18.1mPa.S，加入質量體積百分比為3%的硅藻土，800目濾布，0.22MP壓力，板框過濾除菌體，流速32ml/min。
[0140](2)除雜蛋白及大分子活性有機物
[0141]去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH7.2，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白。
[0142](3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質
[0143]按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至7%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除。
[0144](4)脫色 [0145]加入1.2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4.7L。
[0146](5)除小分子氨基酸、離子雜質
[0147]稀釋至IOL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至1/7，Glu含量降低至1/7，得清液9.5L。
[0148](6)超濾分級提取
[0149]將上述9.5L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速21ml/min，得到61%透過液和35%—級截留液。將透過液過超濾膜(50kDa)，0.1MP壓力，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液3.2L，經檢測，濃縮透過液中Y -PGA含量為32g/L，平均分子量在10萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末94.lg。
[0150]大分子量的Y-PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液過500kDa超濾膜進行超濾，流速6ml/min，收集67%透過液和28%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為38g/L和40g/L，平均分子量分別為23萬和38萬，分別加入3倍體積乙醇進行醇沉，將絮凝部分分別復溶至原體積，分別進行噴霧干燥，得到Y-PGA白色粉末，質量分別為75.3g 和 35.8g。總收率為 94. 3%。
【權利要求】
1.一種利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，包括如下步驟: 發酵液制備: 將編號CGMCC3336的地衣芽孢桿菌發酵培養，得發酵液； 發酵液提取: Cl)除菌體 將發酵液PH調至3.0，粘度降低至原來的1/6，加入發酵液體積2%-3%的硅藻土，上述為質量體積百分比；800目濾布，板框過濾除菌體，0.22MPa壓力，流速30~50ml/min ； (2)除雜蛋白及大分子活性有機物 去除菌體的發酵液調PH6~7，加熱升溫至90°C保溫20min，使蛋白變性，除去熱變性蛋白，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白； (3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質 按發酵液體積30%的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min,離子交換結束后，回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除； (4)脫色 加入1%~2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色90~120min，抽濾，至液體基本澄清無色； (5)除小分子氨基酸、離子雜質 發酵液稀釋2~3倍后過納濾膜； (6)超濾分級提取 采用5萬~50萬超濾膜對上述處理過的清液進行加壓循環超濾濃縮，0.1um中空纖維膜分尚分子量15萬上下的Y-PGA, 500kDa超濾膜分尚分子量35萬上下的Y-PGA ;分別得到分子量不同的清液:分子量〈15萬的Y-PGA清液；分子量在15萬~35萬的Y-PGA清液，分子量大于35萬的Y -PGA清液；分子量小于15萬的Y -PGA進行5kDa超濾濃縮進一步除去小分子雜質；分子量大于15萬的Y -PGA清液進行2~3體積倍醇沉，沉淀物溶解于原體積I~2倍的水中；將上述溶液分別噴霧干燥，得到精制Y-PGA。
2.根據權利要求1所述利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，包括如下步驟: 菌種活化: 將編號CGMCC3336的地衣芽孢桿菌在固體培養基斜面上于37°C培養16個小時，制備成熟的斜面種子； 種子培養: 將活化后的斜面種子接入一環裝有50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，37 °C，220rpm，培養16個小時到對數生長期； 發酵培養: 將種子培養液接入發酵培養液中，接種量為10%，220rpm下培養72h，發酵罐為10L，裝液量為60%，當殘糖降至5g/L時補加流加培養基至發酵結束前4小時，流加速度為Iml/min ;下罐 Y -PGA 產量為 30g/L ~45g/L ； 發酵液提取: (I)除菌體將發酵液PH調至3.0，粘度降低至原來的1/6，加入2%-3%質量體積百分比的硅藻土，800目濾布，板框過濾除菌體，0.22MPa壓力，流速30~50ml/min ； (2)除雜蛋白及大分子活性有機物 去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH6~7，加熱升溫至90°C保溫20min，使蛋白變性，除去熱變性蛋白，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白； (3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質 按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，能去除大部分金屬離子和帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除； (4)脫色 加入1%~2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色90~120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著； (5)除小分子氨基酸、離子雜質 發酵液稀釋2~3倍后過納濾膜，經檢測，能去除大部分氨基酸、多肽、寡糖、鹽離子等小分子雜質； (6)超濾分級提取 采用5萬~50萬超濾膜對上述處理過的清液進行加壓循環超濾濃縮，0.1um中空纖維膜分尚分子量15萬上下的Y-PGA, 500kDa超濾膜分尚分子量35萬上下的Y-PGA;分別得到分子量不同的清液:分子量〈15萬的Y-PGA清液；分子量在15萬~35萬的Y-PGA清液，分子量大于35萬的Y -PGA清液；分子量小于15萬的Y -PGA進行5kDa超濾濃縮進一步除去小分子雜質；分子量大于15萬的Y -PGA清液進行2~3體積倍醇沉，沉淀物溶解于原體積I~2倍的水中；將上述溶液分別噴霧干燥，得到精制Y-PGA。
3.根據權利要求1或2所述利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，其特征在于，發酵液提取步驟如下: (l)除菌體:將發酵液PH調至3.2，粘度由83.4mPa.s降低至16.9mPa.s，加入2%質量體積百分比的娃藻土，800目濾布,0.22MPa壓力，板框過濾除菌體,流速36ml/min ； (2)除雜蛋白及大分子活性有機物 去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH6.7，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過.0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白； (3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質 按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至9%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除； (4)脫色 加入1%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色90min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4.5L； (5)除小分子氨基酸、離子雜質 稀釋至1OL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至l/8，Glu含量降低至1/7，得清液9L ；(6)超濾分級提取 上述9L清液,采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾,流速15ml/min,得到44.4%透過液和50%—級截留液；將透過液經50kDa超濾膜，0.1MP壓力過濾，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液1.8L，經檢測，Y -PGA含量為40g/L，平均分子量在12萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末； 大分子量的Y-PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液經500kDa超濾膜進行超濾，流速4ml/min，收集50%透過液和44%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為45g/L和43g/L，平均分子量約為28萬和45萬，分別加入2.5倍體積乙醇進行醇沉，將絮凝部分分別復溶至2.5L，分別進行噴霧干燥，得到平均分子量分別為28萬和45萬的Y -PGA白色粉末。
4.根據權利要求1或2所述利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，其特征在于，發酵液提取步驟如下: Cl)除菌體:將發酵液PH調至3.0，粘度由76.4mPa.s降低至14.3mPa.s，加入2.5%質量體積百分比 的娃藻土，800目濾布,0.22MPa壓力，板框過濾除菌體,流速34ml/min ； (2)除雜蛋白及大分子活性有機物 去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH6.7，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白； (3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質 按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至14%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除； (4)脫色 加入1.5%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4L; (5)除小分子氨基酸、離子雜質 稀釋至IOL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至l/7，Glu含量降低至1/7，得清液9L ； (6)超濾分級提取 上述9L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速18ml/min，得到49%透過液和44%—級截留液；將透過液過超濾膜(50kDa)，0.1MP壓力，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液2.7L，經檢測，Y-PGA含量為42g/L，平均分子量在11萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末； 大分子量的Y -PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液過500kDa超濾膜進行超濾，流速5ml/min，收集44%透過液和42%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為45g/L和40g/L，平均分子量約為28萬和40萬，分別加入3倍體積乙醇進行醇沉，將絮凝部分分別復溶至原體積，分別進行噴霧干燥，得到Y-PGA白色粉末。
5.根據權利要求1或2所述利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，其特征在于，發酵液提取步驟如下: (!)除菌體:將發酵液PH調至3.0，粘度由77.2mPa.s降低至15.2mPa.s，加入質量體積百分比為2.5%的娃藻土,800目濾布,0.22MPa壓力，板框過濾除菌體,流速36ml/min ； (2)除雜蛋白及大分子活性有機物 去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH7.0，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過.0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白； (3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質 按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至12%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除； (4)脫色 加入1.2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4L; (5)除小分子氨基酸、離子雜質 稀釋至10L過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至l/7，Glu含量降低至1/7，得清液9.2L ； (6)超濾分級提取 上述9.2L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速20ml/min，得到58%透過液和41%—級截留液；將透過液過超濾膜(50kDa)，0.1MP壓力，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液2.9L，經檢測，Y-PGA含量為40g/L，平均分子量在12萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末； 大分子量的Y -PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液過500kDa超濾膜進行超濾，流速5ml/min，收集42%透過液和55%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為36g/L和35.5g/L，平均分子量約為25萬和45萬，分別加入3倍體積乙醇進行醇沉，透過液中絮凝部分復溶至原體積，未透過液醇沉絮凝部分復溶至原體積1.5倍，分別進行噴霧干燥，得到Y-PGA白色粉末。
6.根據權利要求1或2所述利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，其特征在于，發酵液提取步驟如下:Cl)除菌體:將發酵液PH調至3.2，粘度由78.3mPa.s降低至18.1mPa.S，加入質量體積百分比為3%的娃藻土,800目濾布,0.22MPa壓力，板框過濾除菌體,流速32ml/min ； (2)除雜蛋白及大分子活性有機物 去除菌體的發酵液用氫氧化鈉調PH7.2，加熱升溫至90°C保溫20min，冷卻至室溫，過.0.45um中空纖維膜進行超濾，除掉80%以上雜蛋白； (3)陽離子交換樹脂除金屬離子及一些帶正電荷雜質 按發酵液體積30% (V:v)的添加量加入陽離子交換樹脂，室溫下攪拌，進行靜態吸附雜質30min，經檢測，金屬離子降低至7%，同時去除部分帶正電荷雜質，離子交換結束后，用6M氫氧化鈉回調PH至7，引入少量離子后續納濾會進行去除； (4)脫色 加入1.2%活性炭，進行常溫慢速攪拌，脫色120min，抽濾，液體基本澄清無色，脫色效果顯著，得發酵液4.7L； (5)除小分子氨基酸、離子雜質稀釋至IOL過0.01um孔徑納濾膜，經檢測，離子濃度降低至l/7，Glu含量降低至1/7，得清液9.5L ； (6)超濾分級提取 將上述9.5L清液，采用孔徑0.1um中空纖維膜對其進行超濾，流速21ml/min，得到61%透過液和35%—級截留液；將透過液過超濾膜(50kDa)，0.1MP壓力，對透過液進行濃縮并同時再次去除離子和分子量較小的有機物，棄去二級截留液，得到濃縮透過液3.2L，經檢測，濃縮透過液中Y -PGA含量為32g/L，平均分子量在10萬左右，噴霧干燥得到Y -PGA白色粉末； 大分子量的Y-PGA被截留在中空纖維膜的一級截留液中，將一級截留液過500kDa超濾膜進行超濾，流速6ml/min，收集67%透過液和28%未透過液，檢測Y -PGA含量分別為38g/L和40g/L，平均分子量分別為23萬和38萬，分別加入3倍體積乙醇進行醇沉，將絮凝部分分別復溶至原體積，分別進行噴霧干燥，得到Y-PGA白色粉末。
7.根據權利要求1或2所述利用超濾納濾技術精制生物發酵液中聚谷氨酸的方法，其特征在于，培養基配制方法如下: Cl)斜面培養基:酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaC15.0，瓊脂20，上述組分單位為g/L，ρΗ7.0±0.I ;121°C高壓蒸汽滅菌 20min ； (2)種子培養基:酵母 膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4.Η200.5，MgSO4.6Η200.5，上述組分單位為g/L，pH7.0±0.1 ;121°C高壓蒸汽滅菌20min ； (3)發酵培養基:葡萄糖80、味精 80、酵母膏 20、ΝΗ4Ν034.1、NaCllO, MgSO4.6Η200.5、CaCl2.6Η201.0^FeCl3. 6Η200.01，上述組分單位為 g/L, PH7.0 ; 121 °C高壓蒸汽滅菌 20min ； 流加培養基成分:葡萄糖900、NH4N0360、CaCl2.6H2020、FeCl3.7H200.15，上述組分單位為g/L，PH7.0,121 °C高壓蒸汽滅菌20min。
【文檔編號】C08G69/10GK103665371SQ201310574779
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】喬長晟, 張苗苗, 劉艷麗, 李小鑫 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司