一種新的具有抗心力衰竭作用的鈉尿肽嵌合體CNAAC的制造方法與工藝

本發明涉及應用新型鈉尿肽類藥物防治心力衰竭的基礎研究和臨床研究領域。

背景技術：
心腦血管疾病是世界公認的人類健康的“第一殺手”，其中心力衰竭是眾多器質性心臟病如心肌梗死、肺源性心臟病、肥厚型心肌病等幾乎不可避免的結局，嚴重威脅人類健康。鈉尿肽家族因其具有顯著的利鈉、利尿、舒血管和抑制增殖等多樣化作用，目前已被廣泛應用于心力衰竭的基礎和臨床研究。鈉尿肽家族是一組結構相似的內源性肽的家族，其成員包括心房鈉尿肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、腦鈉尿肽(brainnatriureticpeptide，BNP)、C-型鈉尿肽(C-typenatriureticpeptide，CNP)及D型鈉尿肽(D-typenatriureticpeptide，DNP)等，是由氨基端、環狀結構和羧基端組成的多肽結構。人工合成的ANP和BNP類似物已經在HF治療中得到了廣泛應用，但由于化學合成效率低、成本昂貴、易被機體降解等問題，其應用受到了一定限制。新出現的NPs嵌合體分子有望為以上問題提供新的解決途徑。研究發現，ANP的羧基端的5個氨基酸殘基在利尿方面起到重要作用，而環狀結構可能與受體結合及產生舒血管等作用有關。因此我們對ANP分子進行改造：保留ANP分子的環狀結構和羧基端，與CNP的氨基端進行組合，獲得一種新型鈉尿肽嵌合體CNAAc。改造后的鈉尿肽嵌合體具有顯著地舒張血管、利尿、保護心肌作用。這種新型鈉尿肽嵌合體可用于學術研究，也可為臨床應用鈉尿肽嵌合體防治心力衰竭提供可能的新藥，因此具有良好的科學研究價值和應用前景。

技術實現要素：
CNAAc的命名以其結構組成而來：即CNP的氨基端(CN)加ANP的環狀結構(A)和ANP的羧基端(Ac)。CNAAc理論分子量為2837.1g/mol，氨基酸序列為GLSKGCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY，兩個半胱氨酸殘基之間以二硫鍵相連(圖1)。我們委托上海吉爾生化有限公司進行CNAAc的合成，合成產物呈白色粉末狀。通過高效液相色譜-質譜聯用檢測純度在95％以上，所測分子量與理論值相一致。為了檢測CNAAc的作用，我們做了以下幾方面的實驗研究。詳細的實驗方法、步驟見具體實施方式。一、CNAAc舒血管作用的研究CNAAc舒血管效應的研究是通過分離大鼠腹主動脈后，應用離體血管環灌流實驗來實現的。(一)CNAAc與ANP、CNP舒血管作用的比較首先將灌流浴槽中血管的基礎張力定為1g，將去甲腎上腺素加入10ml的浴槽中，使其終濃度為10-6M，其可引起顯著的血管收縮作用。將CNAAc按濃度梯度加入浴槽，使浴槽中CNAAc的終濃度依次為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6M。實驗結果表明：CNAAc可以劑量依賴性地舒張大鼠的離體腹主動脈(圖2A)，且其最大舒張效應遠高于其“母體”CNP或ANP(圖2B)，在保留內皮和去內皮組其舒張效應沒有顯著性差異(圖2C)。(二)CNAAc舒血管機制的研究應用鈉尿肽受體A阻斷劑ab14356(1∶1000)、鳥苷酸環化酶(guanylatecyclase，GC)抑制劑鎂藍(methyleneblue，MB，10-5M)可以部分阻斷CNAAc的舒張作用(圖3A，3B)，應用cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)抑制劑KT5823(10-6M)可將CNAAc的舒張作用完全阻斷(圖3C)，說明CNAAc可能通過NPR/cGMP/PKG信號通路發揮舒張血管的作用。上述結果表明：新合成的鈉尿肽嵌合體CNAAc具有顯著地不依賴于內皮的舒張動脈的作用，且可能是通過NPR/cGMP/PKG信號通路發揮作用的。二、CNAAc利尿作用的研究按照圖4所述步驟，Sham組大鼠在經頸靜脈給予CNAAc后，尿量較基礎期增加了約10倍，與Sham+NS組相比有非常顯著性差異(P<0.01)；HF組給予CNAAc后，尿量較基礎期增加了約5倍，與HF組給予生理鹽水后尿量的增加有非常顯著性差異(P<0.01)(圖5)。三、CNAAc對心力衰竭大鼠心臟的保護作用CNAAc對心力衰竭大鼠心臟的保護作用的實驗研究，是通過結扎大鼠的冠狀動脈左前降支建立大鼠心力衰竭模型來實現的。(一)CNAAc對大鼠心肌肥厚的影響心肌肥厚是多種心血管病的共同病理過程，也是心力衰竭發生的結果。HF及HF+CNAAc組在術后4周時BW均顯著性降低(P<0.01)，HF組的HW/BW、LVW/BW與對照組相比均顯著增加，表明心肌肥厚的發生，經過4周的給藥后，HF+CNAAc組的HW/BW、LVW/BW與HF組相比顯著降低(P<0.01)(表1)。表1CNAAc對大鼠心肌肥厚指數的影響BW：體重；HW：心臟重量；LVW：左心室重量**P<0.01vs.Sham；#P<0.05，##P<0.01vs.HF.(二)CNAAc對大鼠心臟功能的影響心臟超聲心動圖顯示HF組的左室前壁搏動幅度減弱，心室容積增大(圖6A)；與對照組相比，HF組的各項指標均有非常顯著性改變(P<0.01)(圖6B，6C，6D，6E，6F，6G)；與HF組相比，HF+CNAAc組大鼠的EF、FS...