本發明屬于生物醫藥和試劑檢測領域，涉及一種人類白細胞抗原基因檢測試劑盒，具體而言，涉及人類白細胞抗原基因——HLA-B*39:01基因檢測試劑盒,及其用于篩選甲硝唑所致皮膚藥物不良反應的用途。
背景技術：
皮膚藥物不良反應即藥疹，指藥物通過各種途徑進入人體后引起的皮膚黏膜炎癥反應。通常臨床實踐中根據發病的嚴重程度，將藥疹分為普通型藥疹和重癥藥疹；其中，普通型藥疹主要包括：發疹型藥疹、固定型藥疹及蕁麻疹型藥疹等(Roujeau JC.Clinical heterogeneity of drug hypersensitivity.Toxicology 209(2),123–129(2005))。藥疹發病急，皮疹分布較廣泛，嚴重影響患者的生活質量。
已知甲硝唑主要用于治療滴蟲性陰道炎細菌性陰道病、阿米巴病、酒渣鼻厭氧菌或混合型感染賈第蟲病腸賈第蟲等(Mehta DK,Martin J,Costello I,Jordan B et al editors.BNF 50；；London:BMJ publishing group,September 2005)，其引起的藥疹疹型最常見為固定型藥疹、蕁麻疹型藥疹、發疹型藥疹；除了引起普通型藥疹外，甲硝唑還可引起致命的重癥藥疹(LittJZ.Litt’s Drug Eruption Reference Manual,12th edition.London,Taylor&Francis Group,2006.)。
研究公開了人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)基因的表達產物為人類白細胞抗原，后者在免疫反應中擔任至關重要的角色。有研究發現包括卡馬西平、阿巴卡韋、別嘌呤醇等在內的數種藥物引起的藥疹與HLA等位基因相關(Bharadwaj,M.,et al.,Drug hypersensitivity and human leukocyte antigens of the major histocompatibility complex.Annu Rev Pharmacol Toxicol,2012.52:p.401-31.
Cao,Z.H.,et al.,HLA-B*58:01allele is associated with augmented risk for both mild and severe cutaneous adverse reactions induced by allopurinol in Han Chinese.Pharmacogenomics,2012.13(10):p.1193-201.Roujeau,J.C.,et al.,Genetic susceptibility to toxic epidermal necrolysis.Arch Dermatol,1987.123(9):p.1171-3.)。美國FDA早在2008年推薦亞洲人群在使用卡馬西平前進行HLA-B*15：02基因的篩查(Ferrell PB Jr,Mcleod HL.Carbamazepine,HLA-B*15:02and risk of Stevens-Johnson Syndrome and toxic epidermal necrolysis:US FDA recommendations[J].Pharmacogenomics,2008,9(10):1543-1546)，以指導臨床用藥。經過大規模的前瞻性研究，目前已有證據表明，用藥前篩查藥疹的風險基因可有效減少藥疹的發病率(Chen P,Lin JJ,Lu CS et al.Carbamazepine-induced toxic effects and HLA-B*1502screening in Taiwan.N Engl J Med.2011Mar 24；364(12):1126-33.)。
經對現有技術文獻的檢索發現，至今未見關于HLA-B*39:01基因與甲硝唑引起的藥疹發病相關以及作為基因標記用于篩選該藥物所致藥疹的相關報道；也未見相關試劑盒的報道。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種人類白細胞抗原基因—HLA-B*39:01基因檢測試劑盒及其使用方法。
本發明的進一步目的是提供上述試劑盒的應用，尤其涉及所述試劑盒用于篩選甲硝唑所致皮膚藥物不良反應的用途及其檢測方法。
本發明的試劑盒通過檢測所述人類白細胞抗原基因HLA-B*39:01基因，為患者服用甲硝唑后是存在有患藥疹的潛在可能提供有參考價值的數據；同時為指導臨床用藥提供有參考價值的數據，從而有助于減少甲硝唑致藥疹的發生。
本發明基于所述基因與甲硝唑所致的皮膚藥物不良反應發病的相關關系將有助于建立新的篩查甲硝唑致藥疹的方法。
具體而言，本發明提供了一種人類白細胞抗原基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有檢測人類白細胞抗原基因的核酸或者蛋白的試劑，和人類白細胞抗原基因的擴增引物；或者標記探針，或含有人類白細胞抗原基因的特異性抗體。
本發明所述的人類白細胞抗原基因為HLA-B*39:01基因；
本發明所述甲硝唑所致藥疹的相關HLA等位基因-HLA-B*39:01基因的核酸序列如SEQ NO.1所示：
(a)序列特征：
*長度：3155堿基對
*類型：核酸
*鏈型：雙鏈
*拓撲結構：線形
(b)分子類型：基因組DNA(gDNA文庫)
(c)假設：否
(d)反義：否
(e)最初來源：人
(f)SEQ NO.1核酸序列描述如下：
進一步，本發明提供了上述檢測試劑盒的應用，尤其所述試劑盒用于篩選甲硝唑所致皮膚藥物不良反應的用途及其檢測方法。
本發明中，采用所述的試劑盒對甲硝唑所致皮膚藥物不良反應的待測樣本的HLA-B*39:01基因進行分型，如本發明的實施例中，采用PCR-SSO法進行HLA-B*39:01基因進行分型；
其包括步驟：
(1)提取待測樣本的DNA；
(2)對HLA的多態區域進行擴增；
(3)擴增過程中對PCR產物進行同位素或非同位素標記；
(4)將PCR產物與膜上的探針雜交、放射自顯影，根據信號判斷結果；
其中，所述的探針針對PCR擴增產物設計并且固定在膜上；
所述的待測樣本可以是RNA、蛋白、細胞或者血清樣本；最常見的情況下，所述樣本是甲硝唑所致皮膚藥物不良反應患者的離體的外周血。
本發明的實驗結果表明，甲硝唑所致藥疹的臨床特點及HLA分型如表1所示；所述HLA-B*39:01基因可作為預測甲硝唑所致藥疹的標記基因；
試驗結果顯示，甲硝唑所致藥疹患者中HLA-B*39:01陽性比例相比于正常對照組之間差異有統計學意義(如表2所示)。
表1 甲硝唑所致藥疹的臨床特點及HLA分型
表2 甲硝唑所致藥疹組與數據庫中健康對照組HLA-B*39:01陽性攜帶比例
*差異有統計學意義(P<0.05)。
本發明中可利用所述的HLA-B*39:01基因作為預測甲硝唑所致藥疹的標記基因；進一步利用所述的HLA-B*39:01基因制備甲硝唑使用前篩查或評價試劑盒；以及利用所述的HLA-B*39:01分子制備或評價甲硝唑所致藥疹的靶向藥物。
本發明具有如下優點
涉及的人類白細胞抗原基因——HLA-B*39:01基因，其與甲硝唑引起的藥疹發病相關；
所述HLA-B*39:01基因可作為預測甲硝唑所致藥疹的標記基因；從患者的外周血中抽取DNA后，用現行的方法檢測HLA-B*39:01基因，如PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸探針)方法；
利用本發明提供的HLA-B*39:01基因檢測試劑盒可進一步用于制備或評價甲硝唑所致藥疹篩查試劑盒，該篩查試劑盒，可為指導臨床用藥提供有價值的參考數據，從而減少甲硝唑所致藥疹的發生；或可用于制備或評價甲硝唑所致藥疹的治療藥物，所述的評價甲硝唑所致藥疹的治療藥物，主要靶向作用于HLA-B*39：01分子，從而阻斷其在發病中與甲硝唑或其代謝產物之間的相互作用。
具體實施方式
以下結合具體實施例，以進一步說明本發明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1：基因的收集和抽提
甲硝唑所致藥疹患者來自于中國上海復旦大學附屬華山醫院。其中，蕁麻疹型藥疹的診斷需臨床滿足風團樣皮疹，24小時不能完全消退，可伴或不伴喉嚨梗阻或陣發性腹痛；發疹型藥疹為全身泛發的對稱分布的紅色斑片，且無粘膜累及；固定型藥疹為單發或多發的靶型損害，皮疹好轉后遺留色素沉著(Roujeau JC.Clinical heterogeneity of drug hypersensitivity.Toxicology 209(2),123–129(2005).Bastuji-Garin S,Rzany B,Stern RS,Shear NH,Naldi L,Roujeau JC.Clinical classification of cases of toxic epidermal necrolysis,Stevens–Johnson syndrome,and erythema multiforme.Arch.Dermatol.129(1),92–96(1993))；在知情同意的前提下，簽署知情同意書，進行采集血液樣本，所有入組患者均通過病史及皮膚病理檢查排除病毒疹、毒性紅斑、成人Still病等其他診斷；所有患者均在發疹前2個月內首次口服甲硝唑； 本實驗設對照組，為來自human MHC database(dbMHC)的283位健康人群；取樣本血液300ul，按試劑盒說明書提取DNA，用紫外分光光度儀檢測DNA濃度和純度。
實施例2：檢測HLA基因分型
本發明采用PCR-SSO法(推薦試劑盒-One Lambda,CA,USA)進行HLA基因的分型；其原理是先對HLA的多態區域進行擴增,在擴增過程中對PCR產物進行同位素或非同位素標記,然后針對PCR擴增產物根據堿基配對原則設計系列寡核苷酸探針固定在膜上,最后將PCR產物與膜上的探針雜交、放射自顯影根據信號判斷結果；根據試劑盒標準步驟進行HLA基因分型：將DNA樣本、底物、Taq酶、引物混合后混勻，加入擴增板中，按試劑盒說明書中條件擴增，擴增產物進行雜交、染色和讀板；通過HLA Fusion軟件(One lambda,CA,USA,HLA Fusion 3.0)進行結果分析。
實施例3：HLA-B*39:01與甲硝唑所致藥疹相關
利用SPSS16.0計算Odds Ratio(OR)及其95％的可信區間，必要時使用Haldane’s校正，選用卡方檢驗進行統計學分析，統計學的顯著性水平設定為P小于0.05；
結果顯示：搜集到甲硝唑藥疹患者9例，其甲硝唑所致藥疹的臨床特點及HLA分型如表1所示；
表1
甲硝唑所致藥疹患者中HLA-B*39:01陽性比例相比于正常對照組的陽性攜帶比例如表2所示；之間差異有統計學意義。
表2
*差異有統計學意義(P<0.05)。
SEQUENCE LISTING
<110> 復旦大學，復旦大學附屬華山醫院
<120> 一種人類白細胞抗原基因檢測試劑盒及用途
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3155
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
gatcaggacg aagtcccagg tcccggacgg ggctctcagg gtctcaggct ccgagggccg 60
cgtctgcaat ggggaggcgc agcgttgggg attccccact cccctgagtt tcacttcttc 120
tcccaacttg tgtcgggtcc ttcttccagg atactcgtga cgcatcccca cttcccactc 180
ccattgggtg tcggatatct agagaagcca atcagcgtcg ccggggtccc agttctaaag 240
tccccacgca cccacccgga ctcagagtct cctcagacgc cgagatgctg gtcatggcgc 300
cccgaaccgt cctcctgctg ctctcggcgg ccctggccct gaccgagacc tgggccggtg 360
agtgcgggtc gggagggaaa tggcctctgc cgggaggagc gaggggaccg caggcggggg 420
cgcaggacct gaggagccgc gccgggagga gggtcgggcg ggtctcagcc cctcctcgcc 480
cccaggctcc cactccatga ggtatttcta cacctccgtg tcccggcccg gccgcgggga 540
gccccgcttc atctcagtgg gctacgtgga cgacacgcag ttcgtgaggt tcgacagcga 600
cgccgcgagt ccgagagagg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg ggccggaata 660
ttgggaccgg aacacacaga tctgcaagac caacacacag actgaccgag agagcctgcg 720
gaacctgcgc ggctactaca accagagcga ggccggtgag tgaccccggc ccggggcgca 780
ggtcacgact ccccatcccc cacgtacggc ccgggtcgcc ccgagtctcc gggtccgaga 840
tccgcctccc tgaggccgcg ggacccgccc agaccctcga ccggcgagag ccccaggcgc 900
gtttacccgg tttcattttc agttgaggcc aaaatccccg cgggttggtc ggggcggggc 960
ggggctcggg gggacggggc tgaccgcggg gccggggcca gggtctcaca ccctccagag 1020
gatgtacggc tgcgacgtgg ggccggacgg gcgcctcctc cgcgggcata accagttcgc 1080
ctacgacggc aaggattaca tcgccctgaa cgaggacctg agctcctgga ccgcggcgga 1140
caccgcggct cagatcaccc agcgcaagtg ggaggcggcc cgtgtggcgg agcagctgag 1200
aacctacctg gagggcacgt gcgtggagtg gctccgcaga tacctggaga acgggaagga 1260
gacgctgcag cgcgcgggta ccaggggcag tggggagcct tccccatctc ctataggtcg 1320
ccggggatgg cctccaacga gaagaagagg aaaatgggat cagcgctaga atgtcgccct 1380
cccttgaatg gagaatggca tgagttttcc tgagtttcct ctgagggccc cctcttctct 1440
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tttccaatga atagattatc ccaggtgcct gcgtccaggc tggtgtctgg gttctgtgcc 1740
ccttccccac cccaggtgtc ctgtccattc tcaggctggt cacatgggtg gtcctagggt 1800
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acacatgtga cccaccaccc catctctgac catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg 1920
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gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg 2100
ccgaagcccc tcaccctgag atggggtaag gagggggatg aggggtcata tctcttctca 2160
gggaaagcag gagcccttca gcagggtcag ggcccctcat cttcccctcc tttcccagag 2220
ccatcttccc agtccaccgt ccccatcgtg ggcattgttg ctggcctggc tgtcctagca 2280
gttgtggtca tcggagctgt ggtcgctgct gtgatgtgta ggaggaagag ttcaggtagg 2340
gaaggggtga ggggtggggt ctgggttttc ttgtcccact gggggtttca agccccaggt 2400
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ggaccctgtg tgccagcact tactcttttg tgcagcacat gtgacaatga aggacggatg 2520
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gtccctgcta aggacagacc ttaggagggc agttggtcca ggacccacac ttgctttcct 2640
cgtgtttcct gatcctgccc tgggtctgta gtcatacttc tggaaattct ttttgggtcc 2700
aagactagga ggttcctcta agatctcatg gccctgcttc ctcccagtcc cctcacagga 2760
cattttcttc ccacaggtgg aaaaggaggg agctactctc aggctgcgtg taagtggtgg 2820
gggtgggagt gtggaggagc tcacccaccc cataattcct cctgtcccac gtctcctgtg 2880
ggctctgacc aggtcctgtt tttgttctac tccagccagc gacagtgccc agggctctga 2940
tgtgtctctc acagcttgaa aaggtgagat tcttggggtc tagagtgggc gggggggcgg 3000
ggagggggca gaggggaaag gcctgggtaa tggagattct ttgattggga tgtttcgcgt 3060
gtgtgatggg ctgttcagag tgtcatcact taccatgact aaccagaatt tgttcatgac 3120
tgttgttttc tgtagcctga gacagctgtc ttgtg 3155