本發明涉及植物中有效成分的制備方法，具體設計羥基酪醇的提取制備方法。
背景技術：
3,4-二羥基苯乙醇（羥基酪醇）的分子式維C8H10O3，結構式
是一種天然的多酚類化合物，它主要是以酯化物橄欖苦甙的形式存在于橄欖的各個部位，橄欖苦甙經過水解后可得到游離的羥基酪醇。研究發現羥基酪醇具有很多有益于人體健康的生物藥理活性，近年來深受生物和醫學界的重視。
羥基酪醇在橄欖中主要是以橄欖苦甙的形式存在，橄欖苦甙在橄欖各個部位都占有相當的比例，在干燥的橄欖葉子中占6%~9%(質量分數)，也是橄欖果實具有強烈庫位的原因。在橄欖油加工過程中，為出去橄欖油中的酸澀味道，水解橄欖苦甙后得到多酚類化合物，羥基酪醇是這些酚類混合物的主要成分。目前羥基酪醇主要是從橄欖果、葉以及在制備橄欖油過程中產生的殘渣和廢水中分離出來的。而羥基酪醇的純化主要采用色譜分離的方法，如硅膠柱、離子交換柱。如公開號為CN1665764的發明專利，公開了一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法，包括①用橄欖制備植物液；②將酸加入植物液中，由此制得算話的植物液；③將酸化的植物液培養一段時間直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙（環烯醚萜類葡糖苷油橄欖苦甙）有至少50%轉化成羥基酪醇，其中所說的一段時間至少為2個月，通常為2~12個月。雖然該方法可以使植物液中原先存在的油橄欖苦甙的90%轉化為羥基酪醇，但完成這一轉化需要花費的時間太長，導致生產周期長，不適于工業化生產。又如公開號為CN10129811的發明專利，公開了一種從橄欖提取物液中提取羥基酪醇的方法，包括如下步驟：①將橄欖提取液加入去離子水稀釋；②過聚乙烯類樹脂層析柱，用去離子水沖洗，棄去前300mL~500mL的流出液，然后開始收集透明洗脫液；③濃縮所述透明洗脫液，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層濃縮，回收乙酸乙酯，濃縮汁不能再濃縮，得淺橘黃膠狀物；④將淺橘黃膠狀物進行分子蒸餾，得到羥基酪醇粗品。該發明所得產品的純度較高，也較大程度的保持了天然物的原有品質，但該方法并沒有將橄欖提取液中油橄欖苦甙轉化成羥基酪醇這一步驟，只是將提取液中單獨存在的羥基酪醇提取分離出來而已，因此該申請的得率比較低。公開號CN101973853的發明專利，公開了一種生產周期短、成本低且原料多樣化的羥基酪醇的提取方法，包括如下步驟：①玄參科、木犀科、冬青科、金絲桃科、紫草科或馬鞭草科和橄欖科橄欖屬植物為原料，制備提取液；②取上述提取液，加入濃鹽酸，煮沸2~4h水解，水解液過大孔吸附樹脂，用10~30%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥，得到羥基酪醇。該發明雖然將提取液算話后通過煮沸工序實現羥基酪醇的轉化，并縮短了轉化時間，但高溫煮沸破壞了羥基酪醇的分子結構，因此是羥基酪醇的純度和得率偏低。目前的技術還不能大量的將羥基酪醇從含有不同分子量的多酚類化合物的廢水中萃取并分離出來。
羥基酪醇因其特殊的生物和藥理活性，用途十分廣泛。在食品工業中，可作為天然的防腐劑，防止食品的氧化變質；在營養保健領域，可作為營養補充劑、抗菌劑，添加到各種食品中；還可以添加到化妝品中，利用其捕捉自由基的能力，減少紫外線對皮膚的損傷作用，延緩皮膚老化。
目前國外已經相繼有羥基酪醇的膠囊、片劑和粉末產品問世：Life Extension（延壽機構）的注冊商標產品為Polyphen-oilTM（顆粒）；Indena公司的產品為OleaselectTM（片劑）；西班牙公司的Genosa的產品為HytoliveTM（顆粒）；法國Seppic公司的產品ProlivolsTM（片劑）；CreAgri公司和荷蘭帝斯曼（DSM）公司合作開發了HIDROXTM（干粉）。除了將羥基酪醇作為一種營養性、功能性的物質直接使用以外，對于其一些衍生物，如橄欖苦甙、羥基酪醇的乙酰化衍生物，帶有多不飽和脂肪鏈的衍生物等的應用研究也不斷進行。這對于不斷增加羥基酪醇的應用具有很重要的促進作用。
技術實現要素：
本發明是采用酶法耦合膜技術制備羥基酪醇的方法。采用該方法制備羥基酪醇，轉化率高、收率高。本發明采用以下技術方案：
①制備橄欖提取液，所述原料為橄欖科橄欖屬植物的果肉、莖或葉；
②取上述任一種提取液，加入固定化糖苷酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，50~55℃水浴反應2~4h。
③膜過濾水解液。
④濃縮，噴霧干燥，得到羥基酪醇。
在本發明所述的羥基酪醇的制備方法中，所述步驟②中加入的固定化糖苷酶，選用海藻酸鈉為載體，與戊二醛交聯后，將糖苷酶包埋成球狀固定化酶。
在本發明所述的羥基酪醇的制備方法中，所述步驟③進一步包括使用微濾膜、超濾膜和納濾膜過濾所述提取液。
與現有技術相比，本發明采用固定化酶水解提取液，與酸水解液比較，結果表明酸水解會產生較多的副產物，且橄欖苦甙沒有被完全轉化；而固定化酶水解，專一性強，橄欖苦甙可被完全轉化為羥基酪醇，酶解條件溫和，提高了羥基酪醇的收率。此外，酶的固定化起到保護酶的作用，為酶的重復利用提供了可能。從整個制備過程中縮短了生產周期，節約了生產成本。
具體實施方式
下面以實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不局限于這些實施例。
實施例1：
①以橄欖葉為原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的50%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中進行動態循環提取，提取兩次，每次提取1h，獲得提取液；
②濃縮提取液，攪拌均勻進行水沉12小時；
③將上述水沉液體板框過濾，分離獲得清亮的濾液；
④濾液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，50℃反應3小時；
⑤將上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超濾裝置的料液桶中，用截留相對分子量為3萬的有機膜，進行連續式的超濾，超濾時物料溫度控制在30℃左右，調節回流閥，控制料液出口的壓力為100PSI，收集過濾液體；
⑥濃縮至浸膏，噴霧干燥，得到羥基酪醇，純度40%，收率85%。
實施例2：
①以橄欖葉為原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的30%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中進行動態循環提取，提取兩次，每次提取1h，獲得提取液；
②濃縮提取液，攪拌均勻進行水沉12小時；
③將上述水沉液體板框過濾，分離獲得清亮的濾液；
④濾液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，55℃反應2小時；
⑤將上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超濾裝置的料液桶中，用截留相對分子量為1萬的有機膜，進行連續式的超濾，超濾時物料溫度控制在30℃左右，調節回流閥，控制料液出口的壓力為100PSI，收集過濾液體；
⑥濃縮至浸膏，噴霧干燥，得到羥基酪醇，純度42%，收率88%。
實施例3：
①以橄欖葉為原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的70%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中進行動態循環提取，提取兩次，每次提取1h，獲得提取液；
②濃縮提取液，攪拌均勻進行水沉12小時；
③將上述水沉液體板框過濾，分離獲得清亮的濾液；
④濾液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，52℃反應2.5小時；
⑤將上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超濾裝置的料液桶中，用截留相對分子量為1萬的有機膜，進行連續式的超濾，超濾時物料溫度控制在30℃左右，調節回流閥，控制料液出口的壓力為100PSI，收集過濾液體；
⑥濃縮至浸膏，噴霧干燥，得到羥基酪醇，純度45%，收率86%。