本發明涉及糞鏈球菌的檢測方法，具體涉及羽絨羽毛中糞鏈球菌的檢測方法。
背景技術：
羽絨羽毛及其制品具有輕、柔、暖、抗潮等優良特性，備受廣大消費者青睞，具有其他產品不可替代的優勢。隨著國家改革開放和市場經濟的持續穩定發展，我國羽絨羽毛及其制品的進出口規模也在不斷擴大。與此同時，國內外消費者對羽絨羽毛及其制品的要求不僅僅是美觀舒適，而且更注重衣服的安全性、衛生性和環保性。特別是2004-2005年全球范圍內禽流感疫情的發生，使羽絨羽毛及其制品作為動物源性產品，其微生物指標成為消費者關注的問題之一。
據相關資料表明，目前我國年可用毛絨約20萬噸，占世界總產量的70％左右，已然成為世界羽絨羽毛原料的最大供應國。我國也是世界上最大的羽絨羽毛及其制品出口大國，占世界同類貿易量的50％以上。羽絨羽毛微生物檢測與消費者的安全息息相關。
目前，國內外關于羽絨羽毛微生物檢測標準有FZ/T 80001-2002《水洗羽毛羽絨試驗方法》、GB/T 10288-2003《羽絨羽毛檢驗方法》、SN/T 0475-95《出口商品中糞鏈球菌群檢驗方法》和EN 1884-1999《羽絨羽毛微生物狀態測定方法》等。涉及的羽絨羽毛微生物檢測指標包括嗜溫性需氧菌、糞鏈球菌、還原亞硫酸梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌等。
糞鏈球菌作為其中一項重要檢測指標，是引起產品不合格的主要污染菌之一。糞鏈球菌(Enterococcus faecalis)廣泛存在于土壤、植物、乳制品等，為人、禽、動物等胃腸道正常菌群之一，也是健康人體的上呼吸道，口腔或腸道的常居菌。但是當其進入人體血液或其他部位，可引起尿道、血液、心內膜、腹腔、膽道等多部位感染。其中糞鏈球菌為條件致病菌，它來源于人和溫血動物的糞便，偶爾出現于感染的尿道及急性心內膜炎糞鏈球菌為條件致病菌，比沙門氏菌，致病性大腸桿菌抵抗性及存活率均高，能夠通過羽絨羽毛及其制品感染人類。據有關研究報道，通過對來自生產企業送檢及市場銷售的羽絨羽毛及羽絨制品200批進行微生物含量檢測，糞鏈球菌的不合格率為6.0％。因此，糞鏈球菌的檢測具有重要意義，可以直接或間接的表明送檢樣品的衛生狀況以及受污染程度，并判斷出該樣品在使用上是否安全。
羽絨羽毛微生物檢測有別于其他產品檢測，它對檢測人員知識的全面性具有更高的要求，任何方面知識的欠缺都可能使檢測數據的真實性和準確性大打折扣。上述標準中提及的方法都僅僅只是傳統的糞鏈球菌培養方法和確證試驗。此類試驗缺乏一定的可操作性和準確性，易引起試驗的假陽性或者假陰性。
面對我國羽絨羽毛及其制品中糞鏈球菌檢測存在的問題，有必要建立一套科學合理、準確可靠、方便的糞鏈球菌檢測方法。以此規范羽絨羽毛及其制品市場作用明顯，不僅保障了我國消費者的安全利益，也順應全球消費發展趨勢，有利于推進中國羽絨羽毛產業的發展，具有相當顯著的經濟社會效益。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種羽毛羽絨中糞鏈球菌的檢測方法，以滿足相關領域應用的需要。
所述的羽毛羽絨中糞鏈球菌的檢測方法，包括如下步驟：
(1)用重量濃度為0.1％的蛋白胨生理鹽水(蛋白胨生理鹽水的pH為6.9～7.1)，從羽絨羽毛中提取糞鏈球菌；
該提取方法為常規的，采用GB/T10288-2003《羽絨羽毛檢驗》的方法；
(2)用KF鏈球菌培養基，初步培養步驟(1)提取的的糞鏈球菌；
所述的KF鏈球菌培養基的組分、配比和制備方法，在SN/T0475-95《出口商品中糞鏈球菌群檢驗方法》中有詳細的報道；
具體的制備方法如下：將71.5gKF鏈球菌瓊脂溶解在1000mL水中，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養基pH為7.2±0.2；
冷卻至50℃左右，每100mL中添加1％(重量)TTC溶液1支，4h之內，混勻后制成平板，置(4-10)℃儲存，3周內可使用。
所述的KF鏈球菌瓊脂可采用北京陸橋技術有限責任公司，牌號為KF鏈球菌瓊脂基礎產品；
所述的TTC溶液的化學名稱為2.3.5-氯化三苯基四氮唑，可采用北京陸橋技術有限責任公司的產品，1支的重量為1.0101g；
(3)再用疊氮化鈉葡萄糖肉湯，對初步培養的糞鏈球菌進行增菌純化培養；培養方法如下：
從濾膜上刮去典型暗紅色小菌落，將其接種于具塞的250mL裝有100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養基的錐形瓶中，在35℃生化培養箱中進行液體培養，得到一代種子菌液。
取0.5mL種子液接種于，100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養基的具塞錐形瓶中，在35℃生化培養箱中培養。
所述的疊氮化鈉葡萄糖肉湯的詳細信息，在SN/T0475-95《出口商品中糞鏈球菌群檢驗方法》中有詳細的報道；具體的制備方法如下：
將34.7g疊氮化鈉葡萄糖，將其溶解在1000mL蒸餾水中，完全溶解后，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養基pH為7.2±0.2，現配現用；
(4)對純化培養的糞鏈球菌進行鏡檢、API以及分子生物學的方法鑒定，獲得結果；
所述的鏡檢為革蘭氏陽性鏈球菌，分子生物學的方法鑒定結果與API 20strep鑒定結果相同，能準確鑒別出糞鏈(腸)球菌和屎腸球菌；
術語“API 20strep”指的是一個結合各方面的20個生化試驗的標準化方法。該系統能鑒定醫學細菌中絕大多數鏈球菌的種或群；
本發明的原理：本方法通過對羽絨羽毛中糞鏈球菌進行初步選擇性培養，再進行增菌純化培養，同時進行鏡檢及API和分子生物學基因測序進行鑒定，從而達到準確分離鑒定，避免假陽性。
本發明操作簡單，通過API 20strep系統鑒定以及分子生物學的基因鑒定可以準確快速判斷其菌屬，以免造成假陽性，具有良好的應用前景。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
以下實施例中，羽絨羽毛中糞鏈球菌的分離鑒定情況。
實施例1
(1)用重量濃度為0.1％的蛋白胨生理鹽水(蛋白胨生理鹽水的pH為6.9～7.1)，從羽絨羽毛中提取糞鏈球菌；
提取方法如下：
戴消毒手套取出樣品并制備試樣，取兩個約12g的羽絨試樣，分別稱量，精確至0.1g，將每個試樣分別放入2000mL的錐形瓶中加入1200mL的0.1％蛋白胨生理鹽水，室溫機械攪動3h；通過消毒紗布過濾溶液，然后將兩個原始濾液在無菌條件下混合，即為原始濾液。取200mL澄清的原始濾液，用作糞鏈球菌檢驗。
(2)用KF鏈球菌培養基，初步培養步驟(1)提取的的糞鏈球菌；
提取方法如下：
用0.45μm濾過膜100mL原始濾液，并將濾膜放在KF鏈球菌瓊脂培養基上，倒置平皿(35±2)℃培養24h-48h，觀察濾膜上是否有暗紅色小菌落。
具體的制備方法如下：將71.5gKF鏈球菌瓊脂溶解在1000mL水中，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養基pH為7.2±0.2；
冷卻至50℃左右，每100mL中添加1％(重量)TTC溶液1支，4h之內，混勻后制成平板，置(4-10)℃儲存，3周內可使用。
所述的KF鏈球菌瓊脂可采用北京陸橋技術有限責任公司，牌號為KF鏈球菌瓊脂基礎產品；
所述的TTC溶液的化學名稱為2.3.5-氯化三苯基四氮唑，可采用北京陸橋技術有限責任公司的產品，1支的重量為1.0101g；
(3)再用疊氮化鈉葡萄糖肉湯，對初步培養的糞鏈球菌進行增菌純化培養；培養方法如下：
從濾膜上刮去典型暗紅色小菌落，將其接種于具塞的250mL裝有100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養基的錐形瓶中，在35℃生化培養箱中進行液體培養，得到一代種子菌液。
取0.5mL種子液接種于，100mL疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養基的具塞錐形瓶中，在35℃生化培養箱中培養。
疊氮化鈉葡萄糖肉湯的制備方法如下：
將34.7g疊氮化鈉葡萄糖，將其溶解在1000mL蒸餾水中，完全溶解后，分裝每瓶100mL，于121℃滅菌15min，滅菌后的培養基pH為7.2±0.2，現配現用；
(4)對純化培養的糞鏈球菌進行鏡檢、API以及分子生物學的方法鑒定，獲得結果；
本實驗運用API技術和分子生物學的方法作為鏡檢后的驗證試驗。該實驗的鏡檢篩查作為初步確認試驗，而驗證試驗能明確鑒定出糞鏈球菌與其同屬不同種菌株。
API 20strep試驗條是由20個含干燥底物的小管所組成。(生物梅里埃公司)
準備一個培養盒(具有盤和蓋子)，取約3mL的蒸餾水或者去離子水，倒入盤子的蜂窩凹中，造成濕室。
從包裝中取出API 20strep試驗條，將其置于盤中。用無菌接種環取已接種好的平板培養物(待測菌種，是為步驟3的產物)，放入無雜質2mL無菌蒸餾水管內，制得大于4McFarland(麥氏標準渾濁度)菌懸液，作為接種物。其中，在試驗條的前一半(由VP 至ADH)用無菌吸管接種該菌懸液。VP到LAP測定，每管接入100μl菌懸液。對ADH測定，只充滿管的部分；試驗條的后一半(由RIB至GLYG)開啟API GP培養基的安瓿，并將菌懸液搖勻轉入。對ADH到GLYG測定，將石蠟油覆蓋在上面，形成一個凸面。為避免試驗條產生氣泡，需將試驗條前傾，并將吸管頂部靠至小管內緣加液體。用準備的蓋子蓋住培養盒，在(36±1)℃培養4h得到第一次結果，繼續培養至24h讀第二次結果。
經過孵育后，所產生的代謝產物顏色通過自然產生或加入試劑而改變。按照說明書加入相應的指示劑。4h后，VP測定：加入VP1和VP2各1滴。HIP測定：滴加2滴茚三酮(NIN)。而PYRA、α-GAL、β-GUR、β-GAL、PAL和LAP測定：都分別加ZYM A和ZYM B各1滴。過10min讀取結果；24h后，再讀ESC、ADH以及RIB至GLYG的反應結果。
將所有的結果參照讀表表格進行讀表，將得到的陽性或者陰性結果記錄于報告單上。得出7位數字編碼后，應用鑒定軟件包，通過輸入7位編碼得到菌種名稱和鑒定率。本試驗將初步篩選為陽性糞鏈球菌的10株菌株做API鑒定，實驗結果見表1.
表1 AI strep鑒定菌種名稱
通過表1可見，通過傳統方法分離出的10株陽性糞鏈球菌里有糞鏈(腸)球菌Enterococcus faecalis和屎腸球菌Enterococcus faecium。均屬腸球菌屬，同源不同種。通過API 20strep系統鑒定可以準確快速判斷其菌屬，以免造成假陽性，以達到正確發出報告及鑒定基礎。
實施例2
對微生物DNA進行測序，是當前生命科學領域上的一項重要研究。DNA測序技術穩定、簡便、自動化程度高；所得數據為直接的基因組序列，準確、數據可重復性好，被公認為國際金標準。
本實驗運用分子生物學鑒定分離菌種。其基本過程包括：基因組提取及電泳檢測，PCR反應和DNA瓊脂糖切膠純化及測序。通過對API鑒定有代表性的4株菌株做DNA測序，實驗結果見表2。
表2 DNA鑒定結果
分子生物學的方法鑒定結果與API 20strep鑒定結果相同。
通過API 20strep系統鑒定以及分子生物學的基因鑒定可以準確快速判斷其菌屬，以免造成假陽性，以達到正確發出報告及鑒定基礎。