高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法與流程

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法。

背景技術：

視網膜變性疾病是全球首要的致盲原因。在該疾病中，視網膜色素上皮細胞(retina pigmented epithelium,RPE)的損傷和功能異常導致光感受器細胞(photoreceptor)變性，最終影響病人視力直至失明。由于RPE和光感受器細胞的不可再生，至今在臨床上缺乏對這類疾病的有效治療措施。相較于其他治療方法，細胞治療對視網膜退行性疾病的治療有更大的前景。

由于多能干細胞具有無限增殖和分化為各種細胞的能力，因此可以作為理想的移植細胞的來源。已有報道證實胚胎干細胞(ESCs)來源的RPE應用于人類視網膜退行性疾病臨床研究的可行性與安全性，盡管病人術后視力與正常生活的要求還有很大差距。那么，一套穩定有效的體外多能干細胞向RPE細胞分化的方法對視網膜退行性疾病的治療和制藥研究顯得尤為重要。

在過去的十幾年間，多種方法被報道可以控制多能干細胞向RPE細胞分化，并且在多種動物病變模型中發揮保護作用。但是這些方法仍存在若干缺點如耗時長，方法繁瑣，批次間差異大和細胞得率低等。

因此，需要一種誘導多能干細胞向RPE細胞分化的方法。

技術實現要素：

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，本發明的方法不僅可以得到成熟的有功能的視網膜色素上皮細胞，而且方法簡單、耗時短、可重復性強且細胞得率高。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，包括以下步驟：

a、將多能干細胞接種到飼養層細胞中，加入干細胞完全培養基，放置培養并定期換液至細胞達到融合狀態；

b、用酶處理多能干細胞成團塊并接種到培養皿中，加入添加有200ug/ml Matrigel的第一誘導分化培養基培養兩天，更換無Matrigel添加的第一誘導分化培養基繼續培養5天；

c、在分化第8天更換第二誘導分化培養基，放置培養并定期換液至細胞分化形成大量的色素細胞；

d、用酶處理分化細胞成團塊并懸浮培養，1天后進行挑選分離，收集黑色的細胞懸球；

e、將黑色細胞懸球接種于培養皿中，加入第二誘導分化培養基，放置培養并定期換液便可得到成熟的視網膜色素上皮細胞。

優選地，所述多能干細胞包括胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)或誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。

優選地，步驟a中所述飼養層細胞為X射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞，所述干細胞完全培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細胞生長因子，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L，成纖維細胞生長因子濃度為4ng/ml，所述達到融合狀態為每天換液至細胞達到80％～90％的融合。

優選地，步驟b中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機械吹打；所述第一誘導分化培養基成分為：Neurobasal medium和DMEM/F12等體積混合的基礎培養基、N2、B27、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，N2體積含量為1％，B27體積含量為1％，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L。

優選地，步驟c中所述第二誘導分化培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積分數為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基 乙醇濃度為0.1mmol/L；所述形成大量的色素細胞為隔天換液至分化40天，培養皿中出現大量單層的色素細胞。

優選地，步驟d中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理20分鐘并用移液器機械吹打；所述懸浮培養為將細胞團塊接種到不貼壁的細胞培養皿中培養；所述挑選分離為：由于細胞懸球主要包括黑色與白色兩種，根據顏色進行分離挑選。

優選地，各步驟中所述培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行。步驟b或/和步驟e中所述培養皿為有100ug/ml Matrigel包被的細胞培養皿。步驟c或/和步驟e中所述定期換液為隔天換液。步驟e中所述成熟的色素上皮細胞為具有鵝卵石樣形態，色素積累的單層細胞。

目前文獻報道的體外誘導hESCs向RPE分化的方法不僅耗時長(8周到數月不等)，而且獲得的RPE細胞往往有其它分化細胞混合，需要人工挑取含有色素的RPE細胞進行RPE的純化。與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：

1、本發明方法未添加任何分子刺激誘導分化，避免外源添加分子可能引入污染的風險，減少批次之間的差異，提高實驗的重復性。

2、本發明在體外嚴格模擬體內眼球發育的過程，自發的分化為RPE細胞。

3、本發明通過采用培養方法以及胞外基質的改變實現定向自發分化，而傳統自發分化的方法，因非定向分化則得到的細胞種類多樣，分化時間長且目的細胞少，因此本發明方法簡單、快捷，并且由于本發明后期可根據顏色簡單富集黑色細胞懸球，無雜細胞的污染，最終得到百分百色素上皮細胞，因而細胞得率高。通過該方法可獲得高純度和大量的成熟且有功能的RPE細胞。

附圖說明

圖1為本發明人ESCs分化2天形成類似神經上皮及熒光鑒定的示意圖；

圖2為本發明人ESCs分化7天形成類似眼區及熒光鑒定的示意圖；

圖3為本發明人ESCs分化14天形成類似視囊及熒光鑒定的示意圖；

圖4為本發明人ESCs分化40天出現大量色素細胞的示意圖；

圖5為本發明黑色細胞懸球在懸浮培養分離前后的示意圖；

圖6為本發明黑色細胞懸球貼壁后生長及形成成熟RPE的示意圖；

圖7為本發明的多能干細胞來源的RPE細胞染色及功能鑒定的示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。

實施例

本實施例為高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞的方法。

本實施例中，所述多能干細胞為人胚胎干細胞或誘導多能干細胞，均能利用本方法實現發明目的。

本實施例中，所述誘導分化包括如下步驟：

a.將多能干細胞接種到飼養層細胞中，加入干細胞完全培養基，放置培養并定期換液至細胞達到融合狀態；

本步驟中所述多能干細胞為第50代人胚胎干細胞；所述飼養層細胞為X射線處理小鼠胚胎成纖維細胞；所述干細胞完全培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細胞生長因子，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L，成纖維細胞生長因子濃度為4ng/ml；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所述定期換液為每天換液；所述達到融合狀態為每天換液至細胞達到80％～90％的融合。

b.用酶處理干細胞成團塊并接種到培養皿中，加入添加有200ug/ml Matrigel的第一誘導分化培養基培養兩天，更換無Matrigel添加的第一誘導分化培養基繼續培養5天；

本步驟中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機械吹打；所述培養皿為100ug/ml Matrigel包被的細胞培養皿；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所述第一誘導分化培養基成分為：Neurobasal medium和DMEM/F12等體積混合的基礎培養基、N2、B27、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，N2體積含量為1％，B27體積含量為1％，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L。該誘導分化方法在添加200ug/ml Matrigel的第一誘導分化培養基中分化兩天可得到囊泡樣的極性神經上皮樣結構，通過免疫組化鑒定表達ZO-1，N-cadherin和Sox-2，如圖1；繼續培養5天細胞開始表達眼區相關基因Pax6和Rax，如圖2。

c.在分化第8天更換第二誘導分化培養基，放置培養并定期換液至細胞分化形成大量的色素細胞；

本步驟中所述第二誘導分化培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積分數為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所述定期換液為隔天換液；該誘導分化方法在分化第14天已經鑒定分化細胞表達視囊相關的基因Vsx2和MITF，如圖3；所述形成大量的色素細胞為在分化40天左右培養皿中已經出現大量單層的色素細胞如圖4。

d.用酶處理分化細胞成團塊并懸浮培養，一天后可進行挑選分離，收集黑色的細胞懸球；

本步驟中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理20分鐘并用移液器機械吹打；所述懸浮培養為將細胞團塊接種到不貼壁的細胞培養皿中培養；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所述挑選分離為由于細胞懸球主要包括黑色與白色兩種，可以根據顏色進行分離挑選，如圖5。

e.將黑色細胞懸球接種于培養皿中，加入第二誘導分化培養基，放置培養并定期換液便可得到成熟的色素上皮細胞。

本步驟中所述培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所述培養皿有100ug/ml Matrigel包被的細胞培養皿；所述定期換液為隔天換液；所述成熟的色素上皮細胞為具有鵝卵石樣形態，色素積累的單層細胞。該誘導方法將黑色細胞懸球貼壁培養兩周后即可得到成熟的色素上皮細胞，如圖6。

進一步對人ESCs分化來源的RPE細胞進行免疫組化鑒定，發現hESC-RPE細胞表達成熟的RPE細胞相關蛋白Bestrophin，ZO-1和RPE65，進一步檢測其功能發現分化的細胞具有吞噬外節的能力，如圖7。

上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限于上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護范圍之內。