一種治療丙肝的化合物的制作方法

本發明屬于醫藥領域，涉及一種治療丙肝的藥物，具體涉及一種化合物，及其制備方法及用途。

背景技術：

索非布韋(Sofosbuvir)是一種NS5B聚合酶抑制劑，由 Pharmasset 公司研制、后被吉利德(Gilead)于2011年收購，并由吉利德公司開發上市的一種用于治療丙肝的藥物。該藥2013年12月獲得美國FDA批準，作為抗病毒治療方案的一部分，用于慢性丙型肝炎(HCV)的治療，其商品名為Sovaldi。索非布韋是首個獲批可用于丙型肝炎全口服治療方案的藥物，在用于特定基因型慢性丙型肝炎治療時，可消除對傳統注射藥物干擾素的需求。索非布韋的結構如下：

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雖索非布韋治療丙肝效果較好，但治療費用極其昂貴，且其化合物專利在中國到期日遠至2030年，中國丙肝患者無法早日接受相對便宜的仿制藥的治療，因此迫切需要研發具有自主知識產權的治療丙肝的良藥，以使患者盡早接受價格相對合理的藥物治療。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種治療丙肝的藥物，以使中國患者接受價格相對合理的擁有自主知識產權的治療丙肝的藥物。

本發明所公開的索非布韋類似物，具有優于索非布韋的治療丙肝的效果，且毒副作用與索非布韋類似，并無明顯的不良反應。

本發明一方面提供了以下索非布韋類似物BG40204或其可藥用鹽：

BG40204。

本發明另一方面提供了該化合物的用途：在制備作為NS5B聚合酶抑制劑 的藥物中的用途；在制備用于丙型肝炎病毒相關的疾病和 / 或癥狀的藥物中的用途；在制備用于丙型肝炎病毒感染的藥物中的用途。

本發明第三方面提供了該化合物的制備方法：

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本發明第四方面提供了包括上述化合物或其可藥用鹽以及任選的藥學可接受的載體組成的組合物。

本發明第五方面提供了上述組合物的用途：在制備作為NS5B聚合酶抑制劑 的藥物中的用途；在制備用于丙型肝炎病毒相關的疾病和 / 或癥狀的藥物中的用途；在制備用于丙型肝炎病毒感染的藥物中的用途。

本發明技術人員在眾多索非布韋類似物中，意外的發現，具有下列結構的化合物活性較好：

BG40200。

但其活性仍不優于索非布韋，猜測是由于BG40200為消旋體，手性磷的構型對活性有影響。

本發明技術人員意外的發現，本發明化合物抗HCV（丙型肝炎病毒）活性優于索非布韋，更遠遠優于其異構體BG40205：

BG40205。

本發明化合物BG40202磷酸酯的構型為（S）構型時，活性優于（R）構型的BG40205。

附圖說明

圖1：BG40204及陽性對照對HCV GT1b復制子細胞的毒性及對HCV復制子劑量依賴性抑制（Inhibition%）活性（viability%）擬合曲線。

圖2：GS-7977及陽性對照對HCV GT1b復制子細胞的毒性及對HCV復制子劑量依賴性抑制（Inhibition%）活性（viability%）擬合曲線。

圖3：BG40204正離子質譜 MS(ESI⁺,m/e)：592。

圖4：BG40204負離子質譜 MS(ESI^-,m/e)：590。

圖5：BG40204氫譜圖¹H –NMR。

具體實施例

實施例1 BG40204的合成

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化合物2的合成

氮氣保護下，500mL三口瓶中加入10g（52.8mmol，1.0eq）Boc-L-丙氨酸，再加入200mL二氯甲烷，室溫下攪拌至溶清。再降溫至-5℃，加入10.9g（52.8mmol，1.0eq）DCC，反應液移至室溫，攪拌反應2小時。再加入7.75g（63.4mmol，1.2eq）對甲基苯甲醇，室溫攪拌24小時。過濾，濾液依次用水、飽和NaHCO₃溶液、1M鹽酸溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌。分層，所得有機相加入無水硫酸鈉干燥2小時。過濾，旋蒸濃縮，得24.9g淺色固體化合物2。

化合物3的合成

氮氣保護下，500mL三口瓶中加入23.6g（28.35mmol，0.9eq）化合物2，再加入50 mL乙酸乙酯，攪拌得渾濁溶液。將該懸濁液降溫至0℃，加入100mL 乙酸乙酯/鹽酸（6N）溶液。滴加完畢，反應液移至室溫，攪拌反應30min。旋蒸至干，得油狀物。加入100 mL水，用1N HCl溶液調節pH=~2，乙酸乙酯萃取三次，棄去有機相。水相用1M氫氧化鈉溶液調節pH=~8，乙酸乙酯萃取三次，所得有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌一次，無水硫酸鈉干燥2小時。過濾，旋蒸濃縮，得15.0g油狀液體3。

化合物4的合成

氮氣保護下，500mL三口瓶中加入16.17g（83.7mmol，1.0eq）化合物3，加入100mL二氯甲烷，室溫下攪拌溶清。再降溫至-80℃，滴加17.7g（83.7mmol，1.0eq）二氯磷酸苯酯，滴加過程中控制溫度不超-70℃。滴加完畢，再滴加17.0g（167mmol，2.0eq）三乙胺的二氯甲烷溶液（40mL）。反應液移至室溫，攪拌反應2小時。再降溫至0℃，滴加15.4g（83.7mmol，1.0eq）五氟苯酚的二氯甲烷溶液（40ml）。再滴加17.0g（167mmol，2.0eq）三乙胺的二氯甲烷溶液（40mL）。控制反應溫度0℃，攪拌反應3小時。過濾，所得濾液旋干，得油狀物。柱層析純化（PE/EA=1:1），收集純品部分，旋干，得淺色固體。

向述固體中加入300mL乙酸乙酯，室溫下攪拌溶清，再加入900mL石油醚，有固體析出。過濾、干燥，得20.0g白色固體4。

BG40204的合成

氮氣保護下，500mL三口瓶中加入6.1g（23.3mmol，1.0eq）2’-脫氧-2’-氟-2’-甲基-尿嘧啶，再加入75mL無水THF，室溫下攪拌至溶清。再降溫至-15℃，滴加70mL（70mmol，3.0eq）1M的t-BuMgCl/THF溶液，滴加完畢，反應液升溫至室溫，攪拌反應4小時。在12小時內分6批加入19.4g（35mmol，1.5eq）化合物4，TLC監控反應至無化合物4剩余。反應完畢，向反應液中傾入飽和氯化銨溶液淬滅反應。真空濃縮除去THF，所得液體用乙酸乙酯萃取三次，分層，有機相用飽和氯化鈉洗滌一次，無水硫酸鈉干燥2小時。過濾，旋蒸濃縮，得淺色固體，稱重15.3g。

向上述固體中加入150mL乙酸乙酯，升溫至回流，固體溶清。再加入150mL叔丁基甲基醚，降溫至室溫，攪拌析晶過夜。過濾并干燥，得13.2g目標化合物白色固體。

MS(ESI⁺,m/e)：592

MS(ESI^-,m/e)：590

¹H NMR：8.31 (1H, s), 7.43-7.16 (9H, m), 6.17 (1H, d), 5.69(1H, d), 5.12 (2H, s), 4.54-4.50 (1H, m), 4.49-4.41 (1H, m), 4.10-3.76 (3H, m), 3.58-3.56 (1H, m), 2.35 (3H, s), 1.61-1.36 (6H, m)

實施例2

以下為本發明化合物與索非布韋對照的藥理試驗：

BG40204、BG40205、BG40200如上所定義；GS-7977為藥理研發公司提供的標準索非布韋原料藥，作為對照。

1. 研究目的

運用丙型肝炎病毒（HCV） 基因型1b復制子細胞系統，對博瑞生物醫藥（蘇州）股份有限公司的3個化合物進行抗HCV復制子活性檢測。實驗中采用GS-7977作為陽性對照。

2 實驗材料

2.1 HCV 1b復制子細胞: 即Huh7細胞系穩定轉入HCV基因型1b復制子。

2.2 待測化合物：由博瑞生物醫藥技術（蘇州）有限公司提供，用 100% DMSO配制成20 mM母液暫存氮氣柜。

2.3 試劑：見表1.

表1. 試劑列表

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3. 實驗方法

3.1 化合物處理：根據表2化合物稀釋信息，對化合物DMSO母液進行稀釋，三副孔，并加入96孔實驗板中。細胞培養液中DMSO終濃度為0.5%。

表2. 化合物列表

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3.2 細胞處理：在上述96孔細胞板中種入HCV-1b復制子細胞（8,000 細胞/孔），隨后置于37℃，5% CO₂培養箱中培養3天。

3.3 細胞活性檢測：每孔加入細胞生長熒光滴定檢測試劑，37℃，5% CO₂培養箱培養細胞1小時后，用分光光度儀檢測系統Envision檢測Luminescence信號值，原始數據（RFU）用于化合物細胞毒性計算。

3.4 抗HCV復制子活性檢測：每孔加熒光素酶發光底物Bright-Glo，5分鐘內用化學發光檢測系統Envision檢測Luminescence信號值，原始數據（RLU）用于化合物抑制活性計算。

3.5 數據處理：使用如下公式將原始數據處理為細胞活力百分比：

使用如下公式將原始數據處理為抑制百分數：

CPD：化合物孔的信號值

HPE (Hundred percent effect): 100% 有效作用對照孔信號值，孔中只有DMEM培養液

ZPE (Zero percent effect): 無效作用對照孔信號值，用0.5%DMSO代替化合物

將細胞活力百分數、抑制百分數分別導入GraphPad Prism軟件進行數據處理得出化合物對應的曲線及其細胞毒性（CC₅₀）和對HCV復制子的抑制活性（EC₅₀）數值。

4. 實驗結果與討論

表3. 化合物抗HCV GT1b復制子細胞的EC₅₀和CC₅₀值

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在測試濃度范圍內，化合物BG40204、BG40205、BG40200對HCV復制子顯示出不同程度的抑制活性，其EC₅₀值分別為0.042μM、0.397μM、0.174μM。且所有受試化合物在測定濃度范圍內均沒有顯示出細胞毒性，CC₅₀值均大于最高檢測濃度。

附圖顯示受試化合物及陽性對照對HCV GT1b復制子細胞的毒性及對HCV復制子劑量依賴性抑制活性擬合曲線。

從結果可知，本發明化合物BG40204的活性優于其消旋體化合物BG40200（EC₅₀ 0.042 vs 0.174），遠優于其異構體BG40205（EC₅₀ 0.042 vs 0.397），而且也優于索非布韋（EC₅₀ 0.042 vs 0.124），且在測定濃度范圍內均沒有顯示出細胞毒性，CC₅₀值均大于最高檢測濃度。