含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末及其制造方法與流程

本發明涉及一種含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末及其制造方法。
背景技術：
：一直以來，通過將類胡蘿卜素化合物添加到飼料中而將其應用于使魚肉的紅色感增強或雞蛋的蛋黃色澤增強。將作為類胡蘿卜素中的一種的蝦青素應用于家禽類的蛋黃或養殖魚貝類等色澤增強。如果使用含有蝦青素的飼料，所述蝦青素被生物體吸收，從而使雞蛋或魚肉的色澤得到增強。作為蝦青素的制造方法，存在從甲殼類的提取法、培養紅發夫酵母的方法、培養綠藻的方法、有機合成的方法等。副球菌屬的蝦青素生產能力高，其干燥菌體已應用于鮭魚的飼料中(非專利文獻1)。專利文獻1記載有儲存穩定性優異的含有類胡蘿卜素色素的組合物與其制造方法。專利文獻2記載有利用短波單胞菌屬(Brevundimonas)微生物制造蝦青素的方法。專利文獻3記載有利用紅發夫酵母(Phaffiarhodozyma)制造用于飼料的酵母的方法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特開2006-101721專利文獻2：日本特開2006-340676專利文獻3：日本特開平8-182非專利文獻非專利文獻1：生物工學,2010年,第88卷,第9號,pp.492-493技術實現要素：發明所要解決的問題本發明的目的在于提供一種具有提高的色澤增強作用的用于飼料的含有類胡蘿卜素類的粉末及其制造方法。解決問題的技術方案為了解決上述問題，本發明人進行了銳意研究，結果發現，在添加到飼料時，使產生類胡蘿卜素的微生物經過滾筒干燥比經過噴霧干燥得到的干燥菌體粉末更具提高的色澤增強作用，從而完成了本發明。即，本發明包含以下內容：[1]一種含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末的制造方法，所述方法包括使產生類胡蘿卜素的微生物菌體與溫度超過100℃的導熱部相接觸而進行導熱受熱干燥的工序。[2]根據1所述的制造方法，其中，產生類胡蘿卜素的微生物為副球菌屬(Paracoccus)細菌。[3]根據1或2所述的制造方法，所述方法包括將經干燥的菌體粉末進一步粉碎而進行微粉化的工序。[4]根據3所述的制造方法，所述方法通過粉碎工序將干燥菌體粉末的體積粒徑D50微粉化為20μm以下。[5]根據1～4中任一項所述的制造方法，其中，導熱部的溫度在120℃以上。[6]根據1～5中任一項所述的制造方法，其中，干燥為利用滾筒干燥機進行的干燥、利用真空箱型干燥機進行的干燥、利用圓筒干燥機進行的干燥、利用槽型干燥機進行的干燥、利用柜式干燥機進行的干燥或利用加熱板干燥機進行的干燥。[7]根據1～6中任一項所述的制造方法，其中，類胡蘿卜素為蝦青素。[8]根據1～7中任一項所述的制造方法，其中，制造的粉末用于添加到家禽飼料中。[9]一種家禽飼料的制造方法，所述方法包括將通過1～8中任一項所述的制造方法制造而成的干燥菌體粉末添加到家禽飼料中的工序。[10]一種體積粒徑D50被微粉化為20μm以下的含有蝦青素的干燥副球菌屬菌體粉末，其中，體積粒徑D50為7～12μm，且用如下方法步驟進行乙醇提取時蝦青素提取速度是每3分鐘的吸光度為1.1或每8分鐘的吸光度為1.9(A480nm)的提取速度：i)準備濃度為1mg干燥菌體重量/mL乙醇的樣品液體，ii)在25℃、300rpm的條件下振蕩樣品，iii)在振蕩開始3分鐘或8分鐘后分離上清液、用過濾器過濾，及iv)在樣品中添加等體積的乙醇，測定在480nm處的吸光度。[11]一種含有蝦青素的干燥副球菌屬菌體粉末，其中，體積粒徑D50為7～12μm時，通過乙醇提取而提取出的蝦青素的擴散系數D在25℃與35℃的溫度變化之比為0.807±0.05。[12]一種含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末，其中，通過粉碎工序而微粉化的干燥菌體粉末的體積粒徑D50為20μm以下。[13]根據12所述的含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末，其中，類胡蘿卜素為蝦青素。本說明書包含作為本申請優先權基礎的日本專利申請號第2014-134830號說明書和/或附圖中記載的內容。發明效果根據本發明，能夠制造具有提高的色澤增強作用的干燥菌體粉末。與添加通過既往的噴霧干燥制造而成的含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末的飼料相比較，如果將該粉末添加到飼料中，則雞蛋的蛋黃色澤更加明顯增強。此外，與添加通過既往的噴霧干燥制造而成的含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末的飼料相比較，根據本發明，即使較少的飼料也能得到約相同的色澤增強的蛋黃，因此可降低制造成本。附圖說明圖1是比較雞蛋著色的有效性的圖。圖2是乙醇提取實驗結果的圖。圖3是(1-E)對t半對數曲線(滾筒干燥品)的圖。圖4是(1-E)對t半對數曲線(噴霧干燥品)的圖。圖5是(1-E)對t半對數曲線(造粒型噴霧干燥品)的圖。圖6是比較雞蛋著色的有效性的干燥菌體粒度依賴性的圖。具體實施方式下面對本發明進一步詳細說明。本發明的范圍并不限于這些說明，對于除了以下示例之外的形式，在不脫離本發明主旨的范圍內也可以進行適當變更。本發明涉及一種具有提高的色澤增強作用的產生類胡蘿卜素的微生物干燥菌體粉末。該干燥菌體粉末可通過使產生類胡蘿卜素的微生物菌體與溫度超過100℃的導熱部相接觸進行加熱干燥來制造。因此，本發明提供一種含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末的制造方法，該制造方法包括使產生類胡蘿卜素的微生物菌體與溫度超過100℃的導熱部相接觸而進行加熱干燥的工序。作為可以在本發明中使用的微生物沒有任何限定，只要是產生類胡蘿卜素的微生物即可，可使用：副球菌屬(Paracoccus)細菌、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)細菌、短波單胞菌屬(Brevundimonas)細菌、赤細菌屬(Erythrobacter)細菌、紅球屬(Haematococcus)藻類、紅發夫屬酵母等。作為副球菌屬細菌，例如可舉出：Paracoccuscarotinifaciens、馬氏副球菌(Paracoccusmarcusii)、Paracoccushaeundaensis、Paracoccuszeaxanthinifaciens、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、噬氨副球菌(Paracoccusaminovorans)、Paracoccusaminophilus、Paracoccuskourii、Paracoccushalodenitrificans和Paracoccusalcaliphilus。作為紅球屬(Haematococcus)藻類，例如可舉出：雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)、湖泊紅球藻(Haematococcuslacustris)、Haematococcuscapensis、Haematococcusdroebakensis和Haematococcuszimbabwiensis等。作為紅發夫屬酵母，可舉出：紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)。但是，本發明中使用的產生類胡蘿卜素的微生物并不限于這些。在一種實施方式中，作為產生類胡蘿卜素的微生物，可使用Paracoccuscarotinifaciens。作為Paracoccuscarotinifaciens的菌株，可舉出ParacoccuscarotinifaciensE-396菌株(FERMBP-4283)。這些產生類胡蘿卜素的微生物的突變菌株也可以在本發明中使用。即本發明也可使用產生類胡蘿卜素的能力發生改變的突變菌株。作為突變菌株，可舉出產生蝦青素能力高的菌株(日本特開2001-95500)、選擇性地多產生角黃素的菌株(日本特開2003-304875)、選擇性地多產生玉米黃素和β-隱黃素的菌株(日本特開2005-87097)、選擇性地產生番茄紅素的菌株(日本特開2005-87100)等，但并不限于這些。產生類胡蘿卜素的能力發生改變的突變菌株，例如可通過誘變處理與篩選來獲得。作為誘變處理方法，可舉出利用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍或甲磺酸乙酯等誘變原性物質的化學方法、紫外線和X射線照射等物理方法、利用基因重組或轉座子的生物學方法等，但并不限于這些。突變菌株的篩選方法例如可舉出：根據瓊脂培養基上菌落的色調來選擇目標突變菌株的方法；以及用試管、燒瓶、發酵槽等培養突變菌株，通過利用吸光度、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)等對類胡蘿卜素色素進行分析來選擇目標突變菌株的方法等。誘變與選擇可以進行一次或多次。作為本發明的產生類胡蘿卜素的微生物所產生的類胡蘿卜素，例如可舉出：蝦青素、β-胡蘿卜素、番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、角黃素、綠蠅黃質、側金盞花黃質、海膽酮、Asteroidenone、3-羥基海膽酮等。作為培養產生類胡蘿卜素的微生物的方法可以是任何方法，只要是產生類胡蘿卜素的條件即可，例如可舉出如下的方法。即，作為培養基，例如使用包含產生菌生長所需的碳源、氮源、無機鹽以及根據情況特殊要求的營養物質(例如，維生素、氨基酸、核酸等)的培養基。作為碳源，可舉出：葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、麥芽糖等糖類；乙酸、富馬酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸、丙二酸等有機酸；乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、異丁醇等醇類以及它們的組合。添加比例根據碳源的種類而不同，一般每1L培養基為1～100g，例如2～50g。作為氮源，可舉出：硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、氨、尿素以及它們的組合。添加比例根據氮源的種類而不同，一般相對于1L培養基為0.1～20g，例如1～10g。作為無機鹽，可舉出：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸錳、氯化錳、硫酸鋅、氯化鋅、硫酸銅、氯化鈣、碳酸鈣、碳酸鈉以及它們的組合等。添加比例根據無機鹽的種類而不同，一般相對于1L培養基為0.1mg～10g。作為特殊要求的物質，可列舉：維生素類、核酸類、酵母提取物、蛋白胨、肉類提取物、麥芽提取物、玉米漿、干燥酵母、大豆粕、大豆油、橄欖油、玉米油、亞麻籽油以及它們的組合。添加比例根據特殊要求的物質的種類而不同，一般相對于1L培養基為0.01mg～100g。培養基的pH例如調節為pH2～12，例如pH6～9。培養可在例如10～70℃、例如20～35℃的溫度下，通常持續1天～20天、例如2～9天，通過振蕩培養或通氣攪拌培養來進行。在這樣的條件下培養產生類胡蘿卜素的微生物。如果這樣進行培養，則微生物在菌體內外大量產生類胡蘿卜素。由以上培養方法得到的培養液可適當進行濃縮。作為濃縮方法，可舉出：膜濃縮、離心分離法等。接著，除去培養基成分。離心分離時，若是進行過濃縮，則向濃縮液加水，并除去培養基成分。使用膜分離時，進行滲濾(diafiltration)，從而除去培養基成分。加水量根據濃縮液的色素含量等狀態而不同，例如可設為約1～5倍。接下來，為從培養物或濃縮物得到干燥菌體粉末而進行干燥。即在本發明中，將作為培養物或菌體懸濁液得到的含有類胡蘿卜素的菌體進行干燥而成粉末。作為干燥方式，大體上有熱風受熱和導熱受熱。熱風受熱干燥機對目的物吹熱風而進行干燥。導熱受熱干燥機通過由加熱的導熱部(板)的導熱來對目的物施加熱而進行干燥。作為熱風受熱方式的干燥機，可舉出：轉鼓式干燥機、對撞流干燥機、帶式干燥機、旋轉型干燥機、流化床干燥機、噴霧干燥機、氣流干燥機等。噴霧干燥機也稱為噴霧干燥器，將液體或懸濁液噴霧到熱風中，從而得到微粒子狀產品。如果對液體或懸濁液吹熱風，則水等介質蒸發，從而可得到干燥的粒子或粉體。通過由加熱空氣的熱量供給而使由噴霧器(噴霧機)產生的液滴干燥。一般認為干燥用的氣體的溫度高，但如果被干燥的液體或懸濁液的介質為水，則噴霧成球狀的液體的表面溫度在水脫離期間中不會超過作為水蒸發溫度的100℃，來自加熱空氣的熱量的供給速度不會太高。在噴霧干燥中從液滴表面開始進行干燥，因此目的物表面的孔縮小，存在發生表面固化的情況。作為導熱受熱干燥機，可舉出：真空箱型干燥機、滾筒干燥器(也稱為滾筒式干燥機、滾筒干燥機)、圓筒干燥機、槽型干燥機、柜式干燥機、加熱板干燥機等。由于導熱受熱干燥機將目的物與被加熱的導熱部相接觸，當導熱部的溫度超過100℃時，由于導熱效率高，因此得到非常高的熱量供給，水脫離速度會加快。對于將目的物與導熱部相接觸，只要將目的物應用、涂布、滴到導熱部上就可以。導熱部的材料可以是金屬，也可以是通過熱振動進行加熱的如丙烯酸樹脂這樣的非金屬性材料。導熱部只要具有充分的導熱面積即可，可以制成平面、彎曲面、氣缸側面等適當形狀的板。使與導熱部相接觸而干燥的目的物成為片狀(膜狀)，根據情況，可用刮鏟等進行刮取。導熱部與需干燥的目的物接觸的時間通常為數分鐘以下，可設為例如5分鐘以下、4分鐘以下、3分鐘以下、2分鐘以下、例如60秒以下，對此并不限定。材料加熱可以在常壓下進行，也可以在加壓下、減壓下或真空下進行。導熱部的溫度高于100℃。在一種實施方式中，導熱部的溫度高于110℃、120℃、130℃或140℃。在一種實施方式中，導熱部的溫度在220℃以下、210℃以下、200℃以下、190℃以下、180℃以下、170℃以下、160℃以下或150℃以下。在一種實施方式中，導熱部的溫度為140～160℃、例如140～150℃。使用滾筒干燥器時，將液狀或糊狀的目的物涂布在經加熱的滾筒表面上，在旋轉滾筒的同時干燥目的物。作為滾筒干燥器的種類，可舉出雙滾筒型干燥器和單滾筒型干燥器。作為雙滾筒型干燥器有內轉式、外轉式、真空式。作為單滾筒型干燥器有頂部加料型、浸沒加料型、噴射式型。使用任一種類得到的干燥物均為碎片或片狀。滾筒干燥器可以在任何條件下運轉，只要能得到干燥物即可。例如滾筒旋轉速度可設為1～5rpm、2～5rpm、2～4rpm、2～3rpm，對此并不限定。接觸時間或導熱部溫度如上所示。通過滾筒干燥等導熱受熱干燥成為碎片或片狀的干燥物，可在干燥后通過錘式粉碎機等粉碎工序變為粉末。為方便說明，本說明書中有時稱其為粉碎物。接著，干燥物或其粉碎物可通過氣流粉碎機工序而破碎得更細。為方便說明，本說明書中有時稱其為破碎物或微粉化物。粉碎物和破碎物均是片狀干燥物碎化而成的，因此在能保留平面狀形式的同時變碎。本說明書中在提及干燥菌體粉末時，其不僅指導熱受熱干燥的菌體粉末，也包括其微粉化物。在一種實施方式中，本發明通過導熱受熱進行干燥的例如滾筒干燥的干燥菌體粉末可通過氣流粉碎機破碎而進行微粉化。通過破碎工序可將粉末粒徑設為例如1μm～30μm、1μm～20μm、5μm～20μm、例如7μm～20μm。本說明書中在提及粒徑時，其是指將粒子視為球體時的球體直徑。此外，本說明書中在提及平均粒徑時，其是指體積粒徑D50。體積粒徑D50也可以稱為中位徑，是測定粒徑分布時累計值達到50％時的粒徑。粒子的粒徑可利用公知的方法，例如激光衍射散射法來測定。本發明的干燥菌體粉末或其微粉化物可添加到家禽養殖飼料中。作為家禽，可舉出：雞、鵪鶉、火雞、珍珠雞、鴿子、鴨、鵝等，特別優選雞。例如，1g副球菌屬(Paracoccus)細菌的干燥菌體中含有約2.1mg～2.5mg的蝦青素。因此，通過在飼料中使用本發明的干燥菌體，從喂食的家禽得到的蛋的蛋黃中類胡蘿卜素濃度、特別是蝦青素濃度增高，色澤增強。在一種實施方式中，本發明提供一種家禽養殖飼料的制造方法，其包括添加產生類胡蘿卜素的微生物的干燥菌體粉末的工序。通過給家禽喂食該飼料，使家禽生長，收集蛋而可得到具有色澤增強的蛋黃的蛋。可以以在每100g家禽養殖飼料中添加0.1mg以上、0.4mg以上、0.8mg以上、1mg以上、例如0.4～50mg、例如0.4～20mg的產生類胡蘿卜素的微生物中的蝦青素的方式，將產生類胡蘿卜素的微生物的干燥菌體粉末添加到家禽養殖飼料中。上述干燥菌體粉末可以例如混合到飼養家禽中使用的飼料中。家禽養殖飼料中干燥菌體粉末的量，根據該干燥菌體中含有的蝦青素含量而不同，例如按照重量優選可設為0.01％以上、0.05％以上、例如0.01％～5％。本發明的干燥菌體粉末可混合到家禽飼料中進行喂食，也可以與維生素類等一起提前混合到預混合飼料中進行喂食。各種類胡蘿卜素化合物均有助于蛋黃的色澤，但在一些實施方式中，著眼于作為代表類胡蘿卜素的蝦青素來說明本發明。然而，本發明的色澤增強作用并不限于源于蝦青素，其還源于包括產生類胡蘿卜素的微生物，例如副球菌屬菌體中含有的蝦青素的代謝產物或蝦青素的前體物質等的所有類胡蘿卜素化合物的貢獻總和。用含本發明的干燥菌體粉末的飼料喂食的家禽，其產生的蛋富含類胡蘿卜素。根據本方法，可得到例如在蛋黃中以每100g蛋黃含有蝦青素0.1mg以上、0.2mg以上、0.3mg以上、例如0.2mg～10mg、0.2mg～5mg的色澤增強的家禽的蛋。本發明的干燥菌體粉末不是通過如噴霧干燥這樣的熱風受熱式干燥機械裝置而是通過如滾筒干燥這樣的導熱受熱干燥機械裝置進行干燥而得的。本說明書中，有時將用噴霧干燥得到的干燥菌體粉末稱為噴霧干燥品。此外，有時將用滾筒干燥得到的干燥菌體粉末稱為滾筒干燥品。進一步地，有時將滾筒干燥品用氣流粉碎機破碎的所得物稱為滾筒干燥微粉碎品。由干燥方式的不同所反映出的，本發明通過導熱受熱進行干燥的干燥菌體粉末與噴霧干燥品不僅在形狀上有明顯差異，物理性質也不同。本發明的滾筒干燥品和微粉碎品由于其形狀為片狀和在超過100℃高溫下進行的干燥，因此認為得到的粉末中含有的蝦青素容易向外部擴散，容易被生物體吸收。就這一點而言，認為噴霧干燥品由于其形狀以球狀為主、在短時間內急劇干燥，因此表面的孔迅速縮小而發生表面固化。所以，認為既往的噴霧干燥品的結構是蝦青素擴散的障礙，含有的蝦青素相對地難以被生物體吸收。這種不同可通過將例如本發明通過導熱受熱進干燥的干燥菌體粉末、例如滾筒干燥品中含有的蝦青素通過溶劑提取(例如乙醇提取)來進行評價。此外，可將使本發明通過導熱受熱進行干燥的干燥菌體粉末、滾筒干燥品或微粉碎品用于用乙醇提取時的蝦青素提取速度與噴霧干燥品的蝦青素提取速度進行比較。已知溶劑提取速度依賴于溫度，根據溫度依賴關系可確定類胡蘿卜素類從干燥物內擴散釋放時的路徑途中是否存在特別障礙。下面對本發明的含有蝦青素的干燥副球菌屬菌體粉末通過乙醇提取的蝦青素的擴散系數D在25℃與35℃時的溫度變化之比(b25/b35)進行說明。將用乙醇從干燥菌體粉末提取蝦青素時的提取率設為E＝C/Ce。式中，C為外液(乙醇)中提取物蝦青素濃度(A480)，Ce為平衡濃度。表面濃度恒定的擴散解吸過程在擴散恒定時，用下面的級數公式表示。[數1]式中，D為提取物的固體內擴散系數，R為提取物的半徑。將固相內部的濃度作為CS，將其平均濃度作為如下：[數2]將初期濃度(＝總提取濃度)作為CS0。當外部介質充分大，最終平衡濃度Ce低時，則充分滿足表面濃度恒定的假設。如果相對于無因次時間tD/R2，對(1-E)繪制半對數曲線，則(1-E)<0.8范圍內為線性。這是因為式(1)的級數項中僅第一項為主導，并變為式(2)。[數3]因此，由(1-E)對t的半對數曲線的斜率可確定擴散系數D。為方便說明，本說明書中將(1-E)對t的半對數曲線的斜率作為b，將在25℃時的b表示為b25，在35℃時的b表示為b35。在本說明書中認為上述斜率對應于總傳質系數KS＝D/R2并對其進行分析。由于KS與擴散系數D成比例，因此認為即使溫度發生變化，只要是擴散控制機械裝置，則僅用擴散系數的溫度依賴性即可推算出KS。對于溶液中的擴散系數D相對于絕對溫度T，以下的關系成立。Dη/T＝恒定[式中，η為溶液(稀薄溶液中為溶劑)的粘度]在理想條件下，因為η＝0.914mPa·s(35℃、308K)，η＝1.096mPa·s(25℃、298K)，Dη/T＝恒定的關系推導出的斜率之比b25/b35的計算值為(0.914/308)/(1.096/298)＝0.807。即，本說明書中通過乙醇提取的蝦青素的擴散系數D在25℃與35℃時的溫度變化之比(b25/b35)是指從如下關系推導出的比：提取率E＝C/Ce[式中，C表示乙醇中的蝦青素提取物濃度，Ce表示平衡濃度]，將此時的(1-E)與時間t的半對數曲線的斜率作為b，在b25表示在25℃時進行乙醇提取時的b，b35表示在35℃時進行乙醇提取時的b的情況下Dη/T＝恒定[式中，D為擴散系數，η為溶液的粘度，T為絕對溫度]。一種測定試樣的b25/b35接近于0.807是在提取的擴散系數中無特別障礙(阻力)的情況。在一種實施方式中，當體積粒徑D50為7～12μm時，本發明的含有蝦青素的干燥副球菌屬菌體粉末通過乙醇提取而提取出的蝦青素的擴散系數D在25℃與35℃時的溫度變化之比(b25/b35)為0.807±0.05，例如0.807±0.04、例如0.807±0.03、例如0.807±0.02、例如0.807±0.01、例如0.807±0.005、例如0.807±0.004、例如0.807±0.003、例如0.807±0.002、例如0.805～0.809、例如0.807～0.809。接下來，通過參照實施例對本發明進行說明。本發明的技術范圍并不限于以下的實施例。實施例類胡蘿卜素類的定量使用高效液相色譜(HPLC)并按如下進行。色譜柱是將2根InertsilSIL-100A、5μm(GL科學株式會社制)連接在一起使用的。洗脫是通過在約室溫的恒定溫度下以每分鐘1.0mL流入作為流動相的正己烷/四氫呋喃/甲醇混合液(40：20：1)來進行的。測定中將20μL用四氫呋喃溶解并用流動相適當稀釋的樣品的溶液作為注入量，柱洗脫液的檢測在波長470nm處進行。此外，使用Sigma公司制的蝦青素(Cat.No.A9335)用于定量的標準品。蝦青素標準品的定量由分光光度計的吸光度(477nm)與HPLC(470nm)的面積比例(純度)來計算出。在測定標準液在477nm處的吸光度(A)和在上述條件下進行HPLC分析時的蝦青素峰面積百分比％(B)之后，用下式進行濃度計算。[數4]蝦青素的濃度(mg/L)＝A÷2150×B×100另外，正己烷/四氫呋喃/甲醇混合液(40：20：1)中蝦青素的比吸光系數如下所示。[數5]E1％1cm值(477nm)＝2150實施例中平均粒徑(體積粒徑D50)的測定使用光散射式的粒徑分布測定裝置(株式會社清新企業制的LMS-2000e)來進行。實施例1雞蛋著色(因干燥方法而不同)作為產生類胡蘿卜素類的副球菌屬菌體，使用來自ParacoccuscarotinifaciensE-396菌株(FERMBP-4283)的亞硝基胍誘變菌株。對該菌株，首先將菌種用燒瓶培養基進行培養，接著用培養用培養基在28℃、好氧條件下培養菌體至濃度最大。接著，針對經培養的菌體，用離心分離機收集菌體并回收。一般而言，噴霧干燥產生的干燥粉末為微小的粒子。而滾筒干燥產生的干燥粉末比較大。因此，為了比較噴霧干燥品與滾筒干燥品，在這里使用了造粒型噴霧干燥品。造粒型噴霧干燥品是將回收的副球菌屬菌體直接用造粒型噴霧干燥器進行干燥來制造的。造粒型噴霧干燥品的平均粒徑(體積粒徑D50)為385μm。滾筒干燥品是將回收的副球菌屬菌體直接用雙滾筒干燥器進行干燥來制造的。運轉條件是滾筒轉數為3.5rpm、滾筒溫度為140℃。滾筒干燥品的平均粒徑(體積粒徑D50)為約100～125μm。將滾筒干燥品進一步用氣流粉碎機(株式會社清新企業社制)微粉化(粉碎)成平均粒徑(D50)為9μm。將其作為滾筒干燥微粉碎品。向中部飼料株式會社制的基礎飼料(レイヤーS7)中添加各干燥菌體，配制成飼料中蝦青素濃度為約0.8mg/100g的飼料。將產蛋雞以每3只為一組分成3組：造粒型噴霧干燥品添加組、滾筒干燥品添加組、滾筒干燥微粉碎品(平均粒徑D50為9μm)添加組，飼養4星期。喂食量為100g/天。喂食4星期后，從各試驗組收集雞蛋，通過高效液相色譜測定所得雞蛋的蛋黃中的蝦青素量。結果歸納于圖1。圖1表示飼料中蝦青素濃度約0.8mg/100g時，雞蛋的蛋黃中增加的蝦青素量。與造粒型噴霧干燥品相比，滾筒干燥器干燥品和滾筒干燥器干燥粉碎品向蛋黃中轉移蝦青素的量多。實施例2通過乙醇提取確定干燥菌體物理性質(實驗方法)試樣A微粉碎品(滾筒干燥微粉碎品)B滾筒干燥品C噴霧干燥品D造粒型噴霧干燥品A～D是與實施例1的方法同樣制造而成的。A的滾筒干燥微粉碎品的體積粒徑D50為9μm。B的滾筒干燥品的體積粒徑D50為125μm。提取溶劑乙醇(99.5％)C2H5OH(分子量46.07)和光純藥(目錄號052-03343)通過使用微板的實驗來分析短時間的提取動態。方法步驟i)制備2mL濃度為1mg(干燥菌體重量)/mL(乙醇)的各A～D樣品液體(在24孔板上，板使用多孔細胞培養板353047(Falcon))。ii)用振蕩培養箱(S1-300C)振蕩每個板(25℃、300rpm)。iii)在振蕩開始起3分鐘后開始分離，此后每5分鐘取上清液，并通過0.45μm過濾器進行過濾。iv)在樣品中添加乙醇并稀釋2倍(樣品0.1mL+100％乙醇0.1mL)、測定各樣品的吸光度(每孔的最終容量設為0.2mL)。另外，如果24孔板中樣品容量固定為0.2ml，則液滴部分為透鏡狀，其厚度相當于測定的光路長度。結果如圖2所示。從開始到18分鐘的提取速度的順序是A微粉碎品>B滾筒干燥品>C噴霧干燥品>D造粒型噴霧干燥品。乙醇提取的溫度依賴性測定與提取特性的評價此處每干燥菌體量的蝦青素提取量(A480處測定)用平均值作為提取平衡值。提取實驗用遮光瓶在25℃與35℃時實施。方法步驟i)制備30mL濃度0.1mg(干燥菌體重量)/mL(乙醇)的各A～D的樣品液體(遮光瓶)。ii)在恒溫槽(EYELANTT-2000,SS1000)中振蕩(速度控制器儲存3)。此時，測定前使溶劑達到測定溫度再開始實驗。iii)在各規定時間取上清液。在振蕩開始5分鐘后開始分離。iv)用乙醇稀釋采集的樣品(樣品0.1mL+100％乙醇0.2mL)，測定各樣品的吸光度(24孔板，每孔0.2mL)。提取率為E＝C/Ce。式中，C為外液(乙醇)中的提取物濃度(A480)，Ce為平衡濃度(作為在35℃時、21小時后B樣品的A480值)。擴散模型的分析表面濃度恒定的擴散解吸過程在擴散恒定時，用下面的級數公式表示。[數6]式中，D為提取物的固體內擴散系數，R為提取物的半徑。將固相內部的濃度作為CS，將其平均濃度作為如下：[數7]將初期濃度(＝總提取濃度)作為CS0。當外部介質充分大，最終平衡濃度Ce低時，則充分滿足表面濃度恒定的假設。如果相對于無因次時間tD/R2，對(1-E)繪制半對數曲線，則(1-E)<0.8范圍內為線性。這是因為式(1)的級數項中僅第一項為主導，并變為式(2)。[數8]因此，由(1-E)對t的半對數曲線的斜率可確定擴散系數D。為方便說明，將(1-E)對t的半對數曲線的斜率作為b，將在25℃時的b表示為b25，在35℃時的b表示為b35。在本實驗體系中認為上述斜率對應于總傳質系數KS＝D/R2并對其進行分析。由于KS與擴散系數D成比例，因此認為即使溫度發生變化，只要是擴散控制機械裝置，則僅用擴散系數的溫度依賴性即可推算出KS。圖3～5中表示相對于t，對樣品的提取實驗中的(1-E)繪制半對數曲線的結果。存在可近似線性的區域，最小二乘法的結果如圖中所示。對于溶液中的擴散系數D相對于絕對溫度T，以下的關系成立。Dη/T＝恒定[式中，η為溶液(稀薄溶液中為溶劑)的粘度]因為η＝0.914mPa·s(35℃、308K)、η＝1.096mPa·s(25℃、298K)，由Dη/T＝恒定的關系推導出的斜率之比b25/b35的計算值為(0.914/308)/(1.096/298)＝0.807。圖3的斜率之比(b25/b35)為0.00267/0.00330＝0.809，實測值基本對應于計算值。該關系成立于提取的擴散系數中沒有特別障礙(阻力)的情況。對于其他樣品(噴霧干燥品C、造粒型噴霧干燥品D)，此關系未必成立。此外，斜率本身表示提取速度，溫度越高，提取速度越快，同時其順序為B滾筒干燥品>C噴霧干燥品>D造粒型噴霧干燥品。A滾筒干燥微粉碎品由于提取速度非常快，數據偏差大，因此未計算出斜率之比而未在分析中使用。但是，滾筒干燥品B的上述斜率之比(b25/b35)為0.809，接近于理想值，認為與B相比，提取速度非常快的A滾筒干燥微粉碎品的上述斜率之比進一步接近于理想值。因而認為A滾筒干燥微粉碎品的上述斜率之比(b25/b35)在0.807與0.809之間。[表1]表1ln(1-E)對t曲線的斜率bT(℃)樣品B樣品C樣品D250.002670.001370.00096350.00330.002880.00192b25/b35*0.8090.4760.500*由Dη/T＝恒定的關系計算的b25/b35為0.807。在提取的擴散系數中的特別障礙是指在粒子表面存在像殼那樣的不均勻層時，通過該殼時受到其不均勻層的阻力。相反地，無特別障礙是指粒子表面為多孔質，在固液界面沒有不均勻層的情況。由圖3～5和表1的結果可知，樣品B無特別障礙，樣品C和D中存在特別障礙。因此，樣品B與樣品C和D的物理性質不同。此外樣品A的提取速度非常快，且是將樣品B進一步微粉碎而得物，因此與樣品B同樣地在提取的擴散系數中無特別障礙的可能性很高。因此，認為樣品A也與樣品C和D的物理性質不同。本發明的滾筒干燥品B和微粉碎品A如果用電子顯微鏡觀察，則干燥菌體粉末的形狀為片狀或凝膠凝固的形狀。B為如上所示在提取時在類胡蘿卜素類的擴散進程上無特別障礙的物理性質。即，認為粒子內為多孔質或未形成不均勻層的狀態，因此在生物體內易于被消化，容易被生物體吸收。對于A認為情況同樣如此。這從如圖1所示的蝦青素從微粉化品向生物體的吸收性好也可證明。與此相對，C和D如上所示在類胡蘿卜素類提取時在擴散進程上可見到特別障礙。作為該原因，噴霧干燥品C和D如果用電子顯微鏡觀察，則形狀以球狀為主，此外，可認為由于在短時間內劇烈地噴射干燥，球表面的孔迅速縮小而發生表面固化。可認為其結果是在生物體中消化延緩，與滾筒干燥品相比，類胡蘿卜素類(蝦青素)不易被生物體吸收。實施例3雞蛋著色(干燥菌體粉末的粒徑與蛋黃著色之間的相關關系)將滾筒干燥干燥品用氣流粉碎機(株式會社清新企業社制)粉碎，得到一些平均粒徑不同的滾筒干燥微粉碎品。向中部飼料株式會社制的基礎飼料(マルチレイヤーRG)中添加所得的干燥菌體，配制成飼料中蝦青素濃度為0.4mg/100g和0.8mg/100g的飼料。將產蛋雞以每5只一組分成10組，飼養4星期。參照表2。喂食量為100g/天。[表2]表2試驗組喂食4星期后，從各試驗組收集雞蛋，通過高效液相色譜測定所得雞蛋的蛋黃中的蝦青素量。結果如圖6所示。工業上的可利用性為了家禽蛋黃的色澤增強，可將通過本發明的制造方法得到的含有類胡蘿卜素的干燥菌體粉末用于家禽養殖飼料中。將本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請直接作為參考而包括在本說明書中。當前第1頁1 2 3