一種富硒微生物其制備方法及應用與流程

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種富硒微生物其制備方法及應用。

背景技術：

硒(selenium)，元素符號se，位于元素周期表ⅵ主族，是生命體所必須的非金屬微量元素。自然界中，硒主要以4種價態存在：還原態的硒化物(-2)、單質態的硒(0)和氧化態的亞硒酸鹽(+4)及硒酸鹽(+6)，其中又以亞硒酸鹽(+4)毒性最強，以單質硒(0)的毒性最弱。

硒是動物和人所必需的微量元素之一。它與動物的生長發育、繁殖和疾病發生有著密切的關系。研究表明，硒具有抗氧化、提高機體免疫力和抗病力，調節機體代謝，影響動物和人的繁育機能，抗腫瘤，延緩衰老，拮抗有毒元素等多種功能。

哺乳動物體內大部分的硒以硒半胱氨酸的形式在相應功能蛋白中發揮生物活性作用。硒作為許多具有重要生物功能的硒酶的活性中心，與機體的抗氧化作用及免疫應答等功能密切相關。目前在哺乳動物至少已發現并分離到35種硒蛋白，其中功能比較明確的硒蛋白是谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)、脫碘酶(id)、硫氧還蛋白還原酶(tr)、硒磷酸化物合成酶(sps2)、精子線粒體膜硒蛋白(mcs)、精子dna結合硒蛋白、前列腺上皮硒蛋白、人淋巴細胞硒蛋白、硒蛋白p、硒蛋白w和一種存在于多種組織中的18ku硒蛋白。

正因為硒具有包括促進動物生長、提高動物免疫功能和抗病力及抗氧化能力在內的一系列重要的生物學功能，所以本領域中存在很多在食品、藥品、保健品、飼料中補加硒的報道。當前廣泛使用的補硒方法是添加亞硒酸鈉。但由于亞硒酸鈉利用率低，毒性大，而且對環境會造成潛在地污染，因此一些國家已經限制使用亞硒酸鈉作為硒的營養補充劑。為了避免使用有機硒，本領域技術人員致力于開發能夠將無機硒轉化為有機硒的方案，提高含硒產品的安全性，并增強硒的使用效率。

益生菌(probiotics)，又名促生素、生菌劑、益生素、原生菌、微生態制劑、活菌制劑等，是指“當攝入一定量時能對宿主健康有作用的微生物活體”。益生菌具有以下幾個方面的功能：防止腸道感染，維持腸道菌群平衡；提高免疫機能；控制血清膽固醇；抗腫瘤作用等。目前應用于動物的益生菌菌種已突破40余種，1989年美國食品與藥品管理局與美國飼料學會發布了可以直接飼喂動物的益生菌菌種有41種。

由于大部分益生菌為厭氧菌或兼性厭氧菌，因此，其在有氧環境下的生存能力極差，這一特性給益生菌的儲存和使用帶來了極大的不便。因此，本領域技術人員致力于開發能夠提高益生菌在有氧條件下的生存能力的技術方案。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種富硒微生物其制備方法及其應用。

本發明的第一方面，提供了一種制備富硒微生物的方法，所述方法包括步驟：

(i)提供含有硒的培養基，并且在所述培養基中培養微生物；和

(ii)分離步驟(i)中培養的微生物，從而制得所述富硒微生物；

其中，所述培養基中硒濃度c≥10μg/ml(如≥20μg/ml，優選地≥30μg/ml，更優選地≥50μg/ml，最優選地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在另一優選例中，所述培養基中硒濃度c≤1000μg/ml(優選地，≤800μg/ml)。

在另一優選例中，所述培養基為本領域中的基礎培養基或改良培養基，如rcm培養基、mrs培養基、tpy培養基。

在另一優選例中，所述微生物為原核微生物、或真核微生物。

在另一優選例中，所述微生物為好氧微生物。

在另一優選例中，所述微生物為厭氧微生物，或兼性厭氧微生物。

在另一優選例中，所述微生物為原核微生物。

在另一優選例中，所述微生物為益生菌。

在另一優選例中，所述微生物選自下組中的一種或多種：雙歧桿菌(bifidobacterium)、乳桿菌(lactobacillus)、大腸桿菌(e.coli)。

在另一優選例中，所述含有硒的培養基中，初始添加的含硒成分為無機硒，優選為h2seo3、和/或na2seo4。

在另一優選例中，所述步驟(i)中，包括步驟：

(i0)在不含外源硒的培養基中，培養微生物；

(i1)向步驟(i0)的培養液中，添加新鮮的含硒的培養基，連續或梯度增加培養基中硒濃度，從而使培養液中硒濃度達到并維持在(1±20％)c，并繼續培養。

在另一優選例中，所述步驟(i1)中，培養液中的外源硒濃度從0提高到c的時間≥5天，優選地≥10天，更優選地≥15天，最優選地≥20天，比如可以為25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、或100天。

在另一優選例中，所述步驟(i)中，包括步驟：

(i0)在不含外源硒的培養基中，培養微生物；

(i1)向步驟(i0)的培養液中，連續添加新鮮的含硒濃度為c的培養基；在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到并維持在(1±20％)c，并繼續培養。

在另一優選例中，所述方法中(i)中通過梯度增加的方式，逐步提高培養基中硒的含量。

在另一優選例中，所述步驟(i)中，包括步驟：

(i0)在不含硒的培養基中，培養微生物，所得培養物的體積為v；

(i1)第1次補料

向步驟(i0)的培養物中，連續添加新鮮的第一含硒培養基，其中所述第一含硒培養基中硒濃度為c1，添加速度為每8h～48h(優選為10h～24h)添加0.01v～1v(優選為0.05v～0.5v，更優選為0.1v～0.4v)，在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到約(1±20％)c1；

(i2)第2次補料

向第1次補料后獲得的培養物中，連續添加新鮮的第二含硒培養基，其中所述第二含硒培養基中硒濃度為c2，添加速度為每8h～48h(優選為10h～24h)添加0.01v～1v(優選為0.05v～0.5v，更優選為0.1v～0.4v)，在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到約(1±20％)c2；

……

(in)第n次補料

向第n-1次補料后獲得的培養物中，連續添加新鮮的第n含硒培養基，其中所述第n含硒培養基中硒濃度為cn，添加速度為每8h～48h(優選為10h～24h)添加0.01v～1v(優選為0.05v～0.5v，更優選為0.1v～0.4v)，在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到約(1±20％)cn,cn＝c；

其中，c1≤c2≤……≤cn，n為2～100的正整數(優選為3～50的正整數，更優選為4～30的正整數，最優選為5～20的正整數，如6、7、8、9、10)。

在另一優選例中，上一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度與下一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度的比值為1：1～10(優選為1：1.2～5，更優選為1：1.5～3)。

在另一優選例中，下一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度比上一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度高0～500μg/ml(優選地高10～200μg/ml，更優選地高20～100μg/ml，如高50μg/ml)。

在另一優選例中，c1為5～100μg/ml(優選地為10～50μg/ml，更優選地為15～30μg/ml)。

在另一優選例中，所述方法還包括任選地步驟：在每次補料過程中，或兩次補料之間，穩定培養1h～24h，在此過程中既不補充培養液也不移除培養液。

在另一優選例中，所述方法還包括步驟(3)：對步驟(2)中獲得所述富硒微生物進行干燥處理，獲得富硒微生物的干菌體。

在另一優選例中，所述步驟(1)為厭氧培養。

在另一優選例中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≥5mg(如≥10mg，優選地≥15mg，更優選地≥20mg，最優選地≥30mg)。

在另一優選例中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≥50mg(優選地≥100mg，更優選地≥200mg)。

在另一優選例中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≤500mg。

在另一優選例中，所述富硒微生物對氧的耐受能力是同種野生類型微生物(在不含硒培養基中，以相同條件培養的同種微生物)對氧的耐受能力的至少10倍，優選地至少20倍，更優選地至少50倍。

在另一優選例中，所述富硒微生物對抗生素的耐受能力是同種野生類型微生物(在不含硒培養基中，以相同條件培養的同種微生物)對抗生素的耐受能力的至少2倍。

本發明的第二方面，提供了一種富硒微生物，所述富硒微生物中每克干菌體中的硒含量≥5mg(如≥10mg，優選地≥15mg，更優選地≥20mg，最優選地≥30mg)。

在另一優選例中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≥50mg(優選地≥100mg，更優選地≥200mg)。

在另一優選例中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≤500mg。

在另一優選例中，所述富硒微生物為通過權利要求1所述的方法制備而得

在另一優選例中，所述微生物為原核微生物、或真核微生物。

在另一優選例中，所述微生物為好氧微生物。

在另一優選例中，所述微生物為厭氧微生物，或兼性厭氧微生物。

在另一優選例中，所述微生物為原核微生物。

在另一優選例中，所述微生物為益生菌。

在另一優選例中，所述微生物選自下組中的一種或多種：雙歧桿菌(bifidobacterium)、乳桿菌(lactobacillus)、大腸桿菌(e.coli)。

本發明的第三方面，提供了一種微生物制品，所述微生物制品從本發明第二方面所述的富硒微生物的發酵產物中制得。

在另一優選例中，所述微生物制品為有機硒制品。

在另一優選例中，所述微生物制品包括但不限于；含硒蛋白制品、含硒多糖制品、含硒核酸制品、含硒小分子化合物、或其組合。

在另一優選例中，所述微生物制品為硒納米顆粒。

在另一優選例中，所述微生物制品為奶制品。

本發明的第四方面，提供了一種組合物，所述組合物中含至少一種本發明第二方面所述的富硒微生物和/或至少一種本發明第三方面所述的微生物制品。

在另一優選例中，所述組合物(凍干劑)中還包括保護劑，優選地所述保護劑包括選自下組的一種或多種；脫脂奶粉、海藻糖、和l-半胱氨酸(或其鹽)。

在另一優選例中，所述組合物為試劑組合物、藥物組合物、保健品組合物、食品組合物、飼料組合物或化妝品組合物。

在另一優選例中，所述組合物為菌劑。

在另一優選例中，所述菌劑為液體制劑、粉劑或片劑。

在另一優選例中，所述組合物為奶制品。

本發明的第五方面，提供了如本發明第二方面所述的富硒微生物、本發明第三方面所述的微生物制品或本發明第四方面所述的組合物的用途，用于提高微生物的抗逆性。

在另一優選例中，所述“抗逆性”包括但不限于：耐受自由基(如氧自由基)的能力、耐受氧的能力、耐受抗生素的能力、耐受高溫的能力、耐受低溫的能力、耐受酸堿度的能力、耐受紫外線的能力、耐受放射性射線的能力、或其組合。

在另一優選例中，所述用途還包括：用于提高厭氧或兼性厭氧微生物對氧的耐受能力。

本發明的第六方面，提供了一種提高微生物抗逆性的方法，包括步驟：

提供含有硒的培養基，并且在所述培養基中培養微生物。

在另一優選例中，所述培養基中硒濃度≥10μg/ml(如≥20μg/ml，優選地≥30μg/ml，更優選地≥50μg/ml，最優選地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在另一優選例中，所述培養基中硒濃度c≤1500μg/ml(優選地≤1000μg/ml，更優選地≤800μg/ml)。

在另一優選例中，所述方法包括本發明第一方面所述的制備富硒微生物的方法。

應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了根據本發明的富硒微生物對氧的耐受能力。

圖2a顯示了根據本發明的富硒微生物對頭孢曲松的耐受性。

圖2b顯示了根據本發明的富硒微生物對萬古霉素的耐受性。

圖2c顯示了根據本發明的富硒微生物對甲硝唑的耐受性。

具體實施方式

本發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種制備富硒微生物的方法，實驗結果表明，根據本發明的方法制備的富硒微生物具有顯著提高的抗逆性。本發明人在研究中意外地發現，微生物能夠在含≥20μg/ml的硒的培養基中正常生長，而且所培養的微生物具有顯著提高的抗逆性，在此基礎上，完成了本發明。

在描述本發明之前，應當理解本發明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應當理解本文所用的術語其目的僅在于描述具體實施方案，并且不意圖是限制性的，本發明的范圍將僅由所附的權利要求書限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數值中使用時，術語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在本發明的實施或測試中可以使用與本發明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優選的方法和材料。

富硒微生物

本發明提供了一類富硒微生物，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≥5mg(如≥10mg，優選地≥15mg，更優選地≥20mg，最優選地≥30mg)。本發明中所述的硒含量，如無特別說明均指有機硒的含量。硒含量的測定方法采用本發明中的常規的或標準的測量方法即可。比如，文獻《gb5009.93-2010食品中硒的測定》中記載的方法。

在本發明的一個優選的實施方式中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≥50mg(優選地≥100mg，更優選地≥200mg)。

在本發明的一個優選的實施方式中，所述富硒微生物每克干菌體中的硒含量≤500mg。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述的微生物為原核微生物、或真核微生物。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述微生物為原核微生物為好氧微生物。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述微生物為厭氧微生物，或兼性厭氧微生物。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述微生物為原核微生物。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述微生物為益生菌。

在另一優選例中，所述微生物選自下組中的一種或多種：雙歧桿菌(bifidobacterium)、乳桿菌(lactobacillus)、大腸桿菌(e.coli)。

根據本發明的富硒微生物，具有顯著提高的抗逆性。比如更具本發明的富硒微生物能夠顯著提高對抗生素的耐受能力。再比如更具本發明的富硒厭氧微生物(和/或兼性厭氧微生物)能夠顯著提高對氧的耐受能力。

益生菌

術語“益生菌”指在動物組織中，如人類胃腸和陰道中具有有益作用的細菌。最常用作益生菌的細菌是乳酸菌和雙歧桿菌；然而，其他有益細菌，如嗜熱鏈球菌(s.thermophilis)也可以是益生菌。在胃和小腸中增殖后，一些益生菌存活下來，并且在大腸內暫時生存，其中結腸發酵能力被正向修飾。見，例如，roberfroid，amjclinnutr71(suppl)：1682s-1687s(2000)。

本發明使用的益生菌可以是任何已知的益生菌，例如，嗜酸乳桿菌(l.acidophilus)，保加利亞乳桿菌(l.bulgaricus)，干酪乳酸桿菌(l.casei)，擬干酪乳桿菌(l.paracasei)，發酵乳桿菌(l.fermentum)，植物乳桿菌(l.plantarum)，鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosus)，唾液乳桿菌(l.salivarius)，兩歧雙歧桿菌(b.bifidum)，嬰兒雙歧桿菌(b.infantis)，動物型雙歧桿菌乳酸亞型(b.animalissubsp.lactis)，長雙歧桿菌(b.longum)，嗜熱鏈球菌(s.thermophilis)，糞腸球菌(e.faecalis)，和屎腸球菌(e.faecium)。

應當了解上述所列僅處于描述目的，而非關于益生菌限制性說明。對于此方面，任何額外的益生菌也可以用于本發明，例如，任何額外已知的和/或可用的乳酸菌或雙歧桿菌。

在本發明一個優選地實施方式中，益生菌可以包括一類對宿主有益的活性微生物，其定植于人體或動物體腸道、生殖系統內，能產生確切健康功效從而改善宿主微生態平衡、發揮有益作用。人體、動物體內有益的細菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、放線菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最強大的產品主要是以上各類微生物組成的復合活性益生菌，其廣泛應用于生物工程、工農業、食品安全以及生命健康領域。

益生菌大多為厭氧微生物或兼性厭氧微生物，因此其對氧的耐受能力較差，給益生菌產品的生產和存儲代帶來了極大的挑戰。

通過微生物(如益生菌)將無機硒轉化為有機硒的嘗試中，由于無機硒對微生物具有很大的毒性，因此轉化率較低。本領域技術人員一般認為，大多數微生物僅能在硒含量在約3μg/ml的培養基中正常生長。

富硒微生物制備方法

本領域技術人員普遍認為，在高濃度硒(如≥5μg/ml)的培養條件下，微生物是很難生長的，主要表現在，當培養基中硒濃度過高時，發酵產物的生物量顯著減少。本發明人經過深入的研究，意外地發現能夠在高濃度硒(如≥10μg/ml)的培養條件下，進行微生物培養，而且產生的生物量穩定，不會顯著降低。基于此，本發明提供了一種制備富硒微生物的方法，所述方法包括步驟：

(i)提供含有硒(外源的人工添加的硒)的培養基，并且在所述培養基中培養微生物；和

(ii)分離步驟(i)中培養的微生物，從而制得所述富硒微生物；

其中，所述培養基中硒濃度c≥10μg/ml(如≥20μg/ml，優選地≥30μg/ml，更優選地≥50μg/ml，最優選地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在本發明的一個優選的實施方式中，可以通過梯度增加的方式，逐步提高培養基中硒的含量，從而使培養基中硒濃度達到c。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述方法包括步驟：

(i)提供含有硒的培養基，并且在所述培養基中培養微生物；和

(ii)分離步驟(i)中培養的微生物，從而制得所述富硒微生物；

其中，所述培養基中硒濃度c≥10μg/ml(如≥20μg/ml，優選地≥30μg/ml，更優選地≥50μg/ml，最優選地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在另一優選例中，所述培養基中硒濃度c≤1000μg/ml(優選地，≤800μg/ml)。

在另一優選例中，所述含有硒的培養基中，初始添加的含硒成分為無機硒，優選為h2seo3、和/或na2seo4。

在另一優選例中，所述步驟(i)中，包括步驟：

(i0)在不含硒的培養基中，培養微生物；

(i1)向步驟(i0)的培養液中，連續添加新鮮的含硒濃度為c的培養基；在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到并維持在c，并繼續培養。

在本發明的一個優選地實施方式中，所述步驟(i)中，包括步驟：

(i0)在不含硒的培養基中，培養微生物，所得培養物的體積為v；

(i1)第1次補料

向步驟(i0)的培養物中，連續添加新鮮的第一含硒培養基，其中所述第一含硒培養基中硒濃度為c1，添加速度為每10h～24h添加0.01v～1v(優選為0.05v～0.5v，更優選為0.1v～0.4v)，在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到約c1；

(i2)第2次補料

向第1次補料后獲得的培養物中，連續添加新鮮的第二含硒培養基，其中所述第二含硒培養基中硒濃度為c2，添加速度為每10h～24h添加0.01v～1v(優選為0.05v～0.5v，更優選為0.1v～0.4v)，在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到約c2；

……

(in)第n次補料

向第n-1次補料后獲得的培養物中，連續添加新鮮的第n含硒培養基，其中所述第n含硒培養基中硒濃度為cn，添加速度為每10h～24h添加0.01v～1v(優選為0.05v～0.5v，更優選為0.1v～0.4v)，在維持培養液總體積約不變的情況下，移除部分培養液，從而使培養液中硒濃度達到約cn,cn＝c；

其中，c1≤c2≤……≤cn，n為2～100的正整數(優選為3～50的正整數，更優選為4～30的正整數，最優選為5～20的正整數，如6、7、8、9、10)。

在另一優選例中，上一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度與下一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度的比值為1：1～10(優選為1：1.2～5，更優選為1：1.5～3)。

在另一優選例中，下一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度比上一次補料中所用的含硒培養基中硒濃度高0～500μg/ml(優選地高10～200μg/ml，更優選地高20～100μg/ml，如高50μg/ml)。

在另一優選例中，所述方法還包括任選地步驟：在每次補料補料過程中，或兩次補料之間，穩定培養1h～24h，在此過程中既不補充培養液也不移除培養液。

在另一優選例中，所述方法還包括步驟(3)：對步驟(2)中獲得所述富硒微生物進行干燥處理，獲得富硒微生物的干菌體。

在本發明中，術語“培養基”(medium)是供微生物生長和維持用的人工配制的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。不同培養基可根據實際需要，添加一些常規物質。如無特別說明，本發明的術語“培養基”即指本領域中的基礎培養基。本領域技術人員可以根據本領域的常規技術知識根據所培養的微生物類型的選擇合適的培養基。如可以參照文獻《微生物學實驗》(高等教育出版社,2007)選擇培養基。

在本發明的較佳的實施方式中，微生物培養溫度為20℃～45℃，優選為35℃～40℃。

在本發明的較佳的實施方式中，微生物培養的ph為3.0～9.0，優選為5.5～8.0，如7.5。

組合物和施用方法

本發明的組合物可包含根據本發明的富硒微生物。所述組合物可以為試劑組合物、藥物組合物、保健品組合物、食品組合物、飼料組合物或化妝品組合物。

本發明的組合物可包括生理學上可接受的運載體。生理學上可接受的載體可以是食物產品或藥物學載體。本文用術語“生理學上可接受”(或“藥學上可接受”)指分子實體和組合物在恰當地給予動物或人時不產生不利、過敏性或其它不良反應。因此，本發明的組合物可包括含有本發明富硒微生物的食物產品。食物產品可包括根據本發明的富硒微生物，優選為活體微生物。食物產品可以是奶制品例如奶或基于奶的產品，例如使用含有奶的培養基制備根據本發明的富硒微生物或將本發明的富硒微生物添加到奶制品中。示范性奶源包括但不限于奶牛、綿羊、山羊、牦牛、水牛、馬、驢、麋鹿和駱駝。

本文所述的組合物可與藥學上可接受的運載體混合。本文所述的術語“藥學上可接受的運載體”包括任何和全部可為藥學上可接受物質用作介質的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑、等滲和吸收延遲劑、緩沖劑、賦形劑、粘合劑、潤滑劑、凝膠、表面活性劑等。

因此，本發明還包括藥物組合物，其包含作為活性成分的根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物，以及一種或多種藥學上可接受的運載體。為了制備本發明的組合物，根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物一般與賦形劑混合，用賦形劑稀釋或包裹在載體內，其形式可以是膠囊、片劑、囊袋、紙或其他容器。如果輔料用作稀釋劑，它可以是固體、半固體或液體材料(例如生理鹽水)，用作活性成分的運載體、載體或介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉末劑、錠劑、藥袋、扁膠囊、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑(固體形式或在液體介質中)、軟膏劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射溶液以及無菌包裝的粉末劑。如本領域所知，稀釋劑類型可根據所需的給藥途徑改變。得到的組合物可包含額外試劑，例如防腐劑。賦形劑或運載體根據給藥模式和途徑選擇。合適的藥物運載體以及藥學配方中使用的一些藥學必要物如本領域熟知的教科書《雷明頓藥物科學》(remington'spharmaceuticalsciences(e.w.martin)),，以及usp/nf(美國藥典和國家配方)所述。合適的賦形劑的一些例子包括：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿和甲基纖維素。制劑還可包含：潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，例如甲-和丙羥基苯甲酸酯；甜味劑；和調味劑。藥物組合物可配制成在使用本領域已知的方法施給病人后，提供活性成分的快速、持續或延遲釋放。

可用標準技術制備用于本方法的藥物學上可接受的組合物，包括其中根據本發明的富硒微生物及其產生的一種或多種代謝物被包裹在膠體中用于口腔傳遞的那些。根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物可經干燥或通過碾磨或粉碎壓縮，置入用于口服給藥的膠囊中。在一些實施方式中，根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物可與一種或多種輔料混合，例如與崩解劑、填充劑、助流劑或防腐劑混合。合適的膠囊包括硬殼膠囊或軟殼膠囊。可用任何基于脂質或基于聚合物的膠體形成膠囊。用于膠體制備的示范性聚合物包括明膠、植物多糖或其衍生物，例如角叉菜膠和淀粉的改性形式和纖維素，如羥丙甲纖維素。可任選的，可在成膠劑溶液中加入其他成分，例如增塑劑，如甘油和/或山梨糖醇來降低膠囊的硬度，著色劑，防腐劑，崩解劑，潤滑劑和表面處理劑。在一些實施方式中，膠囊不包含明膠。在其他實施方式中，膠囊不包含植物多糖或其衍生物。

不論其最初來源或其獲得的方式，根據本發明的富硒微生物及其產生的一種或多種代謝物可根據其用途來配制。這些組合物可根據藥學領域熟知的方法制備，可以各種途徑施用，視需要局部或系統性治療和要治療的區域而定。給藥可以是口服或外用(包括眼科和粘膜，包括鼻內、陰道內和直腸內給藥)。在一些實施方式中，給藥可以是經肺(例如通過粉末或氣溶膠的吸入或吹氣，包括通過噴霧器)；經氣管；經鼻；表皮和透皮)或眼。眼部給藥的方法包括外用(滴眼劑)、結膜下、眼周、或通過球導管來玻璃體內注射或引入，或手術置于結膜囊內的眼科插入物。胃腸外給藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸液；或顱內如鞘內或心室內給藥。胃腸外給藥可以單次推注劑量形式，或可以是通過連續灌注泵。外用給藥的藥物組合物和配方可包括透皮貼片、油膏劑、乳液、軟膏劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴劑、液體、粉末等。常規藥學載體、水、粉末或油狀基底、增稠劑等可能是必須或需要的。

組合物可配制成單位劑型，每種劑型包括每日劑量例如約0.005mg到2000mg的根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物。術語“單位劑量形式”指適合作為單一劑量用于人體對象或其他哺乳動物的物理上離散的單位，每個單位包含預定量的活性成分和合適的藥用賦形劑，所述預定量經計算能夠產生所需的治療效果。為制備固體組合物如片劑，將主要的活性成分與藥用輔料混合，形成包含本發明化合物均質混合物的固體預制組合物。當這些預制混合物為均勻時，活性成分通常均勻地分散在組合物中，使得組分能容易地進一步分成等同的有效單位劑型，例如片劑、藥丸和膠囊。然后將固態預制混合物分成上述類型的單位劑型，包含例如從0.005mg到約1000mg的根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物。

組合物可配制成單位劑型，每劑包含例如從約0.1mg到約1000mg、從約0.1mg到約40mg、從約0.1mg到約20mg、從約0.1mg到約10mg、從約0.2mg到約20mg、從約0.3mg到約15mg、從約0.4mg到約10mg、從約0.5mg到約1mg；從約0.5mg到約100mg、從約0.5mg到約50mg、從約0.5mg到約30mg,、從約0.5mg到約20mg、從約0.5mg到約10mg、從約0.5mg到約5mg；從約1mg到約50mg、從約1mg到約30mg、從約1mg到約20mg、從約1mg到約10mg、從約1mg到約5mg；從約5mg到約50mg、從約5mg到約20mg、從約5mg到約10mg；從約10mg到約100mg、從約20mg到約200mg、從約30mg到約150mg、從約40mg到約100mg、從約50mg到約100mg活性成分。

在一些實施方式中，可對本發明的片劑或丸劑進行包衣或另行復合，提供能夠實現延長作用優點的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內部劑量和外部劑量組分，后者包封前者。兩種組分可由腸衣層分離，該層阻止胃內崩解并允許內部組分完整地通過十二指腸或延遲釋放。多種材料可用于此類腸衣層或包衣，這些材料包括各種聚合酸以及聚合酸與諸如蟲膠、十六醇和醋酸纖維素等材料的混合物。

可摻有本發明組合物用于口服給予或通過注射給予的液體劑型包括：水性溶液劑，適當調味的糖漿；水性或油性混懸劑；和含食用油的經調味乳劑，所述食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油，以及酏劑和類似的藥用運載體。

在藥物組合物中本發明組合物的比例或濃度可根據許多因素變化，包括劑量、化學性質(例如疏水性)、以及給藥途徑。例如根據本發明的富硒微生物或其產生的一種或多種代謝物可以包含約0.005mg-1000mg的膠囊提供，用于口服給藥。

組合物可包含一種或多種根據本發明的富硒微生物的代謝物，即根據本發明的富硒微生物產生的任何物質，優選地代謝物中含有硒，硒的形態可以為有機的或無機的。代謝物可以由一種或多種基因編碼，或可通過一種或多種基因產物的酶活性產生。代謝物包括例如小分子，如氨基酸、核苷、核苷酸以及較大的聚合物結構，例如多肽、碳水化合物、核酸、蛋白聚糖和脂類。代謝物可以是初級代謝物，例如直接參與正常細胞功能的代謝物，或次級代謝物，例如通常基礎細胞功能不需要的代謝物。代謝物還可包括任何在初級或次級代謝物合成過程中產生的代謝中間物。中間物可包括但不限于emp、磷酸戊糖(戊糖-p)途徑、ed途徑、檸檬酸循環和氨基酸生物合成的中間物。

示范性的初級代謝物包括但不限于醇，例如乙醇、甲醇、丁醇；氨基酸，例如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、組氨酸、瓜氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；核酸，例如5’鳥氨酸；抗氧化物，例如抗壞血酸；有機酸，例如乙酸、乳酸、檸檬酸；維生素，例如維生素b12；糖；脂肪酸。

代謝物也可以是次級代謝物。次級代謝物通常是基礎細胞功能不必須的那些。次級代謝物變化廣泛，示范性次級代謝物包括抗生素、激素、類黃酮、類萜、生物堿、苯丙素、苯衍生物、己醇衍生物、香豆素、茋類、氰醇、硫代葡糖酸鹽、類固醇和皂素。

乳桿菌通常在發酵奶制品時產生如下代謝物：乳酸/乳酸酯、乙酸酯、乙醇、甲酸酯、乙醛、α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁烯二醇(丁二醇)。發酵可以是任何微生物導致或參與復雜有機物分解成簡單物質的過程。

根據本發明的富硒微生物代謝物可包含在培養基、發酵物或培養上清液內。在一些實施方式中，代謝物可從培養物、發酵物或培養上清液中部分或基本分離出來。分離代謝物的方法根據具體代謝物的結構和化學性質而變。部分或基本分離的代謝物將保留功能活性。可用領域已知的標準方法分離和確定根據本發明的富硒微生物代謝物的性質。示范性方法包括例如穩定性分析，例如對熱、ph、和/或酶活性的穩定性；層析分析，例如尺寸排阻層析、高效液相層析(hplc)、氣相層析、薄層層析、離子交換層析、親和力層析、反相層析、質譜等。

本發明的主要優點在于：

(1)首次披露了在含極高濃度的硒的培養基中培養微生物，能夠提高微生物的抗逆性；

(2)采用本發明的制備高硒微生物的方法，培養的益生菌不僅含有硒而且能夠顯著提高益生菌在氧氣環境下的存活率。

下面結合具體實施例，進一步詳陳本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如美國sambrook.j等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

材料

1.菌株

益生菌菌株

長雙歧桿菌(拉丁名bifidobacteriumlongum，保藏號cicc6187)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection,cicc)。

2.培養基

rcm培養基的主要組成為牛肉膏，蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，淀粉，氯化鈉，乙酸鈉，l-半胱氨酸鹽酸鹽，各個成分的含量可以依據本領域的常規知識進行調整。

優選地，每10份rcm培養基按重量份數組成為：牛肉膏0.1份，蛋白胨0.05份，酵母粉0.03份，葡萄糖0.05份，淀粉0.01份，氯化鈉0.05份，乙酸鈉0.03份，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.005份，ph6.8±0.2，其余為水。

實施例1使用連續培養得到適應高硒培養基的富硒益生菌

1.1培養方法1：

將長雙歧桿菌接種于rcm液體培養基中，接種量體積比，即種子液與rcm液體培養基的體積比為1％，37±1℃厭氧培養8h，為一級種子，其中每10份rcm培養基按重量份數組成為：牛肉膏約0.1份，蛋白胨約0.05份，酵母粉約0.03份，葡萄糖約0.05份，淀粉約0.01份，氯化鈉約0.05份，乙酸鈉約0.03份，l-半胱氨酸鹽酸鹽約0.005份，其余為水。將一級種子液按接種量體積比5％接種于2l連續培養裝置中，培養基裝液量為50％，連續通氮氣保持厭氧，37±1℃培養16h后，開始使用含有一定濃度硒(亞硒酸鈉)的培養基進行連續補料(na2seo3中se質量分數為45.7％，即含100μg/ml的na2seo3培養基中折合se的含量為45.7μg/ml)，補料周期調控如下表：

第101天開始，放出500ml發酵液后，依然以硒濃度為365.6μg/ml(即亞硒酸鈉濃度為800μg/ml)的培養基進行連續補料，補料速率為500ml/24h，從第102d起，每天放出500ml的發酵液離心濃縮，棄上清，用無菌的0.9％氯化鈉溶液重懸菌泥再離心，至上清液無色澄清、離心后無紅色顆粒物質集中沉淀在底部，倒出菌泥，小心勿將底部紅色較緊實的菌泥倒出。將收集的菌泥與保護劑以重量比1比1混勻后進行真空冷凍干燥，制得活菌粉。其中保護劑按重量份數的組成為：脫脂奶粉5份，海藻糖2份，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.01份。

在本實施例中，最終實現了長雙歧桿菌在硒濃度365.6μg/ml(即亞硒酸鈉濃度為800μg/ml)的條件下進行連續培養，并可持續收獲菌體。在上述培養過程中，對放出的培養液進行檢測，經活菌計數活菌量保持在約10⁸cfu/ml。在最高硒濃度(365.6μg/ml)的培養條件下，每升培養液中可收獲干菌體2.1克，菌體干重中總硒含量為41280μg/g。

菌體中硒含量的檢測方法參考文獻《gb5009.93-2010食品中硒的測定》。

1.2培養方法2：

將長雙歧桿菌接種于rcm液體培養基中，接種量體積比，即種子液與rcm液體培養基的體積比為5％，37±1℃厭氧培養14h，為一級種子，再對其擴大為二級種。將二級種子液按接種量體積比6％接種于7l連續培養裝置中，裝液量為85％，連續通氮氣保持厭氧，并使用6mol/l氫氧化鈉溶液維持發酵液ph在6.0，38±1℃培養12h后，開始使用含有一定濃度硒的培養基進行連續補料并開啟自動出料，補料的同時以同樣的速度出料，維持發酵液體積不變，補料周期調控如下表：

從第33天開始，補料繼續進行，關閉自動出料，每天放出4l發酵液離心濃縮，棄上清，用無菌的0.9％氯化鈉溶液重懸菌泥再離心，至上清液無色澄清、離心后無紅色顆粒物質集中沉淀在底部，倒出菌泥，小心勿將底部紅色較緊實的菌泥倒出。將收集的菌泥與保護劑以重量比1比2混勻后進行真空冷凍干燥，制得活菌粉。其中保護劑按重量份數的組成為：脫脂奶粉3份，海藻糖3份，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.01份。

在本實施例中，最終能使長雙歧桿菌在硒濃度為91.4μg/ml(即亞硒酸鈉濃度為200μg/ml)的條件下進行連續培養，此時發酵液中長雙歧桿菌活菌數維持在10⁸cfu/ml左右，并可持續收獲菌體，每升培養液中可收獲干菌體2.1克，菌體干重中總硒的量為24220μg/g。

實施例2：富硒培養益生菌抗氧化性實驗

在實驗組中，使用上述實施例1的1.1方法，在不同終濃度的含硒培養基中培養富硒長型雙歧桿菌，在各終濃度條件下厭氧培養24h。各實驗組培養基中硒終濃度(以培養基中添加的na2seo3濃度計)分別為：10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、200μg/ml。

對照組培養基中不添加硒，其它培養條件與實驗組相同。

將上述厭氧培養24h后的培養物經離心、洗滌、重懸后轉入有氧條件下在無硒新鮮培養基中37℃震蕩培養，分別于0h，4h，24h后取樣，梯度稀釋涂布法進行活菌計數，計算有氧培養24h后菌體的存活率。依此方法比較無硒菌體及含硒菌體在氧氣條件下的存活率。將對照組和各實驗組在0h的活菌菌落數設為100％。

實驗結果如圖1所示，在24h后對照組存活率僅為0.336％。而添加了20μg/ml的na2seo3的實驗組中，存活率達到了20.60％。添加了200μg/ml的na2seo3的實驗組中，存活率達到了86.49％由上述結果可以看出，本發明的富硒益生菌抗氧化性顯著增強。相比無硒益生菌抗氧化能力提高了約100倍以上。

實施例3富硒雙歧桿菌在提高雙岐桿菌對抗生素的耐受性

按照實施例1中的1.1方法，在不同終濃度的含硒培養基中培養富硒長型雙歧桿菌，獲得不同硒濃度條件下培養的菌體：

對照組：普通長雙歧桿菌發酵菌體(培養基中未添加硒)

實驗組1：培養基中亞硒酸鈉終濃度為10μg/ml發酵所得的富硒菌體；

實驗組2：培養基中亞硒酸鈉終濃度為20μg/ml發酵所得的富硒菌體；

實驗組3：培養基中亞硒酸鈉終濃度為100μg/ml發酵所得的富硒菌體；

采用藥敏紙片，分別測定四種菌體對不同抗生素的耐受程度，抗生素耐受性能力(r)計算公式如下：

r(％)＝(對照組菌體抑菌圈直徑-實驗組菌體抑菌圈直徑)/(對照菌體抑菌圈直徑)×100％

在同一抗生素的同一測試濃度下，r值越高說明菌體的抗生素耐受能力越強。對照組的抗生素耐受能力設為0。

本實施例中，分別檢測了各組菌體對頭孢曲松、萬古霉素、甲硝唑的耐受能力。實驗結果如圖2所示。

圖2a顯示了對頭孢曲松的耐受能力，實驗結果表明，含硒濃度較高菌體具有顯著提高的對頭孢曲松的耐受能力。在32μg頭孢曲松的載藥量下，實驗組3菌體的耐受能力達到了實驗組1菌體的約12倍。

圖2b顯示了對萬古霉素的耐受能力，實驗結果表明，含硒濃度較高菌體具有顯著提高的對萬古霉素的耐受能力。在8μg萬古霉素的載藥量下，實驗組3菌體的耐受能力達到了實驗組1菌體的約5倍；在16μg萬古霉素的載藥量下，實驗組1菌體沒有表現出耐受能力，而實驗組3菌體仍然具有顯著的對萬古霉素的耐受能力。

圖2c顯示了對甲硝唑的耐受能力，實驗結果表明，含硒濃度較高菌體具有顯著提高的對甲硝唑的耐受能力。在2μg甲硝唑的載藥量下，實驗組3菌體的耐受能力達到了實驗組1菌體的約27倍。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。