異噁唑環類衍生物及其制備方法和應用與流程

本發明屬于化學合成領域，涉及異噁唑環化喜樹堿衍生物及其制備方法和應用。

背景技術：

癌癥是目前人類健康的頭號殺手。2010年衛生部公布的統計數據顯示，惡性腫瘤已成為中國人的首要死因，每年死于腫瘤的患者超過100萬。而據世界衛生組織(WHO)統計，全世界平均每年死于惡性腫瘤的者近700萬，新發病例約870萬例，而且每年還在不斷增長，死亡率居第二位，僅次于心腦血管疾病。因此，癌癥的治療刻不容緩。

喜樹堿(Camptothecin，CPT)是1966年從珙桐科植物喜樹中提取的一種細胞毒性生物堿，其結構式如下：

喜樹堿屬于色氨酸-萜烯類生物堿，經腫瘤實驗證明這種色氨酸-萜烯類生物堿具有明顯的抗腫瘤活性，尤其對消化道腫瘤、白血病、膀胱癌等活性更強，但它易引起骨髓抑制、嘔吐和血尿等副作用，且其不溶于水又難溶于脂，不便于制成適宜的劑型，進一步限制了它的應用。直到1985年的研究證實，CPT是拓撲異構酶Ⅰ的特異性抑制劑，使其又成為抗腫瘤藥物研究的熱點。通過對CPT環7、9、10、11位的結構改造(見喜樹堿結構式)，可得到拓撲替康和伊立替康、勒托替康、羥基喜樹堿等抗腫瘤活性更高、毒性更低的喜樹堿類衍生物。兩種喜樹堿類衍生物，拓撲替康和伊立替康已經在全世界范圍內分別用于小細胞肺癌/卵巢癌及大腸直腸癌的治療(表1)，雖然相比喜樹堿這兩種藥品的溶解性更強，但他們的毒性及不良反應仍然很強，包括腹瀉、血尿、嘔吐、惡心等，這就限制了他們的療效及用量，目前還未開發出一種口服制劑。不過雖然如此，這兩種藥物2005年全球銷售額仍然很巨大：伊立替康，大腸直腸癌一線藥品，銷售額達9億美金；拓撲替康，卵巢癌及小細胞肺癌二線藥品，銷售額達2億美金。

表1拓撲替康和伊立替康的介紹

世界衛生組織已經把喜樹堿衍生物的研究作為抗癌藥物的主攻方向之一，各國科學家都在爭相合成新的喜樹堿類衍生物(CPTs)并進行篩選。目前許多對喜樹堿的結構改造主要在7、9、10位上，或在A環上進行變化，又或者把E環打開、擴環以及衍生化，以期獲得效果更好的化合物，但是現有的結構改造還有待優化。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一類異噁唑環化喜樹堿衍生物。

本發明的目的于提供異噁唑環化喜樹堿衍生物的制備方法。

本發明的目的還在于提供異噁唑環化類喜樹堿衍生物及其鹽、組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明采取的技術方案為：

發明人通過在喜樹堿的9，10，20位上進行結構修飾，在保持喜樹堿新衍生物的穩定性前提下，提高其生物活性，增加其水溶性，并降低毒性，最終實現提高其體內抗腫瘤的高效性和作為藥物的應用。

喜樹堿衍生物，所述喜樹堿衍生物的化學結構通式如式(1)所示：

式(1)中，R₁為H、C1～C4的烷基，或(CH₃)₂-N-CH₂-；R₂為H或總碳原子數不超過8

的藥學上可接受的親水基團。

作為本發明的進一步改進，R₂為多元醇基及其酯、親水性氨基酸殘基及其鹽和酯，這些基團包括但不限于如下基團：

喜樹堿衍生物或其藥用鹽和酯，所述喜樹堿衍生物的化學結構通式如式(2)所示：

式(2)中，R₁為H、C1～C4的烷基，或(CH₃)₂-N-CH₂-。

喜樹堿衍生物的制備方法，包括如下步驟：

1)10-羥基-喜樹堿與六亞甲基四胺反應獲得9位醛基化10-羥基-喜樹堿，然后醛基與鹽酸羥胺反應生成9-醛肟-10-羥基-喜樹堿，在偶氮二甲酸二異丙酯和三苯基膦的作用下，9位醛肟與10位羥基反應合環成異噁唑，生成9,10位異噁唑喜樹堿；

2)將9,10位異噁唑喜樹堿的20位羥基用BOC-甘氨酸酯化，脫去BOC保護基后，甘氨酸的氨基末端再用琥珀酸酐酰化得到在20位連接親水基團的9,10位異噁唑喜樹堿衍生物，即異噁唑環化喜樹堿衍生物

反應步驟如下所示：

上述的喜樹堿衍生物，或其藥用鹽和酯在制備治療腫瘤藥物中的應用。

優選的，所述腫瘤選自(非)小細胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直腸癌、乳腺癌、神經母細胞瘤、淋巴癌。

一種治療腫瘤的組合物，該組合物中的活性成分包括上述喜樹堿衍生物及其藥用鹽和酯。

優選的，所述腫瘤選自(非)小細胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直腸癌、乳腺癌、神經母細胞瘤、淋巴癌。

一種治療腫瘤的方法，包括持續或間斷給予患者含有上述喜樹堿衍生物及其藥用鹽和酯的藥用組合物。

本發明的有益效果是：

1)本發明的喜樹堿衍生物在抑制肝癌(HepG-2)、乳腺癌(MDA-MB-231)有更優于上市藥物拓撲替康的體外生物活性，同時其毒性更低。本發明的喜樹堿衍生物在作為一類低毒、高效的候選新藥應用具有廣泛前景。

2)本發明通過用親水基團酯化拓撲替康20位的羥基，打破其分子內氫鍵，使得喜樹堿/拓撲替康衍生物在血漿中開環可能性降低，有助于保持其閉環形式，使得本發明喜樹堿衍生物對靶點－Topoisomerase I的結合能力得以保持，同時通過異噁唑環化9，10位，最終達到提高這類衍生物的生物活性和降低毒性。

附圖說明

圖1是實施例1產物(Rngn-YH-006)的核磁共振氫譜圖；

圖2是實施例1產物(Rngn-YH-006)的核磁共振碳譜圖；

圖3是實施例1產物(Rngn-YH-010)的核磁共振氫譜圖；

圖4是實施例1產物(Rngn-YH-010)的核磁共振碳譜圖；

圖5是Rngn-YH-010、Rngn-YH-006和拓撲替康在體外對10種腫瘤細胞的抑制效果；

具體實施方式

本發明所使用的術語定義如下：

C1～C4的烷基：指含有1～4個碳的飽和烴基，特別是甲基、乙基、正丙基、正丁基。

本發明所請求保護化合物的藥用鹽包括但并不限于堿土金屬、堿性金屬鹽，特別是其鈣鹽、鎂鹽、鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鋅鹽、鐵鹽等等。

低級酯：指總碳原子數不超過8的酯類，包括取代和非取代的飽和酯。

本發明所請求保護化合物的藥用酯為其低級酯，優選C1～C4的飽和酯，特別是甲酯、乙酯。

藥學上可接近的，指已有研究表明化合物本身或其體內代謝物對人體基本無毒害作用。

喜樹堿衍生物，所述喜樹堿衍生物的化學結構通式如式(1)所示：

式(1)中，R₁為H、C1～C4的烷基，或(CH₃)₂-N-CH₂-；R₂為H或總碳原子數不超過8的藥學上可接受的親水基團。

作為本發明的進一步改進，R₂為多元醇基及其酯、親水性氨基酸殘基及其鹽和酯，這些基團包括但不限于如下基團：

。

親水性氨基酸殘基優選為天然親水性氨基酸殘基。

喜樹堿衍生物或其藥用鹽和酯，所述喜樹堿衍生物的化學結構通式如式(2)所示：

式(2)中，R₁為H、C1～C4的烷基，或(CH₃)₂-N-CH₂-。

喜樹堿衍生物的制備方法，包括如下步驟：

3)10-羥基-喜樹堿與六亞甲基四胺反應獲得9位醛基化10-羥基-喜樹堿，然后醛基與鹽酸羥胺反應生成9-醛肟-10-羥基-喜樹堿，在偶氮二甲酸二異丙酯和三苯基膦的作用下，9位醛肟與10位羥基反應合環成異噁唑，生成9,10位異噁唑喜樹堿；

4)將9,10位異噁唑喜樹堿的20位羥基用BOC-甘氨酸酯化，脫去BOC保護基后，甘氨酸的氨基末端再用琥珀酸酐酰化得到在20位連接親水基團的9,10位異噁唑喜樹堿衍生物，即異噁唑環化喜樹堿衍生物

反應步驟如下所示：

上述的喜樹堿衍生物，或其藥用鹽和酯在制備治療腫瘤藥物中的應用。

優選的，所述腫瘤選自(非)小細胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直腸癌、乳腺癌、神經母細胞瘤、淋巴癌。

一種治療腫瘤的組合物，該組合物中的活性成分包括上述喜樹堿衍生物及其藥用鹽和酯。

優選的，所述腫瘤選自(非)小細胞肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、直腸癌、乳腺癌、神經母細胞瘤、淋巴癌。

一種治療腫瘤的方法，包括持續或間斷給予患者含有上述喜樹堿衍生物及其藥用鹽和酯的藥用組合物。

1.劑型：

本發明提供了用于治療或預防癌癥的方法，包括制定病人的治療有效量，化合物或組合物，化合物及其組成，藥學上可接受的載體、賦形劑，或稀釋劑。該發明的化合物及其組合成分可以治療或預防癌癥包括但不僅限于，如淋巴管肉瘤，結腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細胞癌，腺癌，腎細胞癌，肝癌，子宮頸癌，肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，惡性黑色素瘤，白血病，急性淋巴細胞白血病和急性髓細胞性白血病(粒細胞，早幼粒細胞，粒細胞，單核細胞和白血病)；慢性白血病(慢性粒細胞白血病(粒)和慢性淋巴細胞白血病)，淋巴癌(霍奇金疾病和非霍奇金疾病)，多發性骨髓瘤等等。

本發明的化合物和組合物可以連續地或間斷地任何與其他分子相容的方式給藥，口服或不經腸道的方式吸收，包括肌肉注射、腹腔、靜脈、皮下、鼻內、硬膜外、口服、舌下、脊柱內、心室內、鞘內、腦池內、囊內、陰道，透皮，直腸，通過吸入或外敷，特別是耳朵，鼻子，眼睛，或皮膚等。也可能是與另一種生物活性劑一起作用。其作用可以是全身或局部。不同的藥物輸送系統包括了，封裝于脂質體、微粒子、微膠囊、膠囊等。

本發明也可以通過使用吸入器或噴霧器，和制成氣霧劑，或通過灌注在氟碳化合物或合成的肺表面活性劑。本發明的化合物還可作為栓劑，以傳統的粘合劑和載體如甘油三酯。

“藥學上可接受”普遍公認的藥典所列在動物身上，更尤其是在人類身上載體是指稀釋劑，助劑，輔料。這種載體可以諸如水和油。動物，蔬菜或合成來源，如花生油，大豆油，礦物油，香油之類的。載體亦可以為生理鹽水，阿拉伯膠，明膠，淀粉糊，滑石粉，角質，膠體二氧化硅等等。此外。輔助劑，穩定劑，增稠劑，潤滑劑，著色劑均可以使用。當給病人用藥時，發明的化合物成分和藥學上可接受載體，賦形劑或稀釋劑，最好是無菌的。靜脈給藥時，水是本發明的化合物是首選的載體。鹽、葡萄糖和甘油的溶液也可作為液態載體，特別是注射的方案中。合適的制藥載體還包括諸如輔料淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，大米，面粉，硅膠，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸，滑石粉，氯化鈉，脫脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。目前化合物和組成，如果有需要的話，也可以包含適量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。

目前的化合物和組合物可以采取解決方案的形式包括，懸浮物。乳劑，片劑，丸劑，裝有液體的顆粒，膠囊，粉末，長控釋制劑，栓劑，乳劑。航空溶膠，噴霧劑，懸浮物，或任何其他形式適合使用。

發明的化合物和組成物口服給藥可能是在片劑，含片，水的形式或油性懸浮物，顆粒，粉末，乳液，膠囊劑，糖漿的。化合物和組成物口服給藥方式也可以制定食品和食品混合。另外在藥片或藥丸形式的化合物成分可延遲解體和在胃腸道吸收，從而提供持續一個較長時期的效果。時間延遲材料包括如甘油單硬脂酸酯或甘油硬脂酸。口服成分可以包括標準醫藥級別的載體如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等等。

1.1聯合治療

本發明的化合物可同時與一個或多個其他的治療藥物，用于哺乳動物，尤其人類。當結合使用其他治療，如其他抗癌化合物，該化合物和治療劑的加法可以充當或更好的協同作用。發明的化合物與其他治療藥物可以是同樣的組成，或是分開的組合，之前或之后的用藥方式。對于許多慢性疾病治療，其體現就在于一個綜合療法與交互組合的用藥方式，例如，以盡量減少特定的藥物毒性。在某些情況，當發明的組成與另一種治療劑或試劑使用可能產生的副作用，包括，但不僅限于毒性，可以降低治療劑劑量以低于閾值達到降低所引起的不良副作用。

可用于與本發明的化合物組合的抗癌藥物包括但不僅限于：阿西維辛；阿克拉霉素鹽酸阿考達唑鹽酸；阿克羅寧；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌醋酸；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；門冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；芐替哌；硫酸博來霉素；布喹那鈉；溴匹立明；馬利蘭；卡鉑；卡莫司汀；順鉑；克拉屈濱；阿糖胞苷；達卡巴嗪；紫杉醇；多西紫杉醇；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬檸檬酸；氟尿苷；磷酸氟達拉濱；氟脲嘧啶；吉西他濱鹽酸；吉西他濱；羥基脲；鹽酸伊達比星；環磷酰胺；伊立替康；蘭瑞肽醋酸曲唑；洛莫司汀；醋酸甲地孕酮；醋酸美倫；馬法蘭；甲氨蝶呤鈉；噻氨酯噠唑；嘌呤鹽酸；鏈黑菌素；替尼泊苷；硫酸長春堿；長春地辛硫酸；酒石酸長春瑞濱等等。

下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，實施例僅用于示例性說明本發明的技術方案，并不構成對本發明技術方案的限制。

實施例1

喜樹堿的異噁唑衍生物(喹啉并異噁唑化合物)，20號位沒有親水基團的化學結構式如下，化學名為：(S)-8-ethyl-8-hydroxy-8H-isoxazolo[4,5-f]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-9,12(11H,14H)-dione

20號位帶有親水基團的異噁唑環化喜樹堿衍生物化學名為：(S)-4-((2-((8-ethyl-9,12-dioxo-9,11,12,14-tetrahydro-8H-isoxazolo[4,5-f]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-8-yl)oxy)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutanoic acid，其化學結構式如下：

上述喜樹堿衍生物的制備方法，包括如下步驟，其合成路線如下：

具體的合成步驟如下：

1)在TFA(三氟乙酸)(10ml)中的10-羥基喜樹堿(化合物1，100毫克，0.27毫摩爾)和六亞甲基四胺(HMTA，80毫克，0.55毫摩爾)的溶液在氬氣下加熱回流20小時。然后將反應混合物濃縮，加入20ml蒸餾水并攪拌1小時。補加部分蒸餾水后，通過碳酸氫鈉將pH調節至8-9。水相用EA(丙烯酸乙酯)洗滌后將pH調至1.5，并用EA萃取(20mL×5)。將合并的有機相分別以1N HCl，H₂O和飽和NaCl水溶液洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將殘余物經色譜純化(甲醇：DCM(二氯甲烷)＝1：50)得到化合物5。化合物5由核磁氫譜和碳譜確定結構吻合；

2)向化合物5(50毫克，0.13毫摩爾)和鹽酸羥胺(11毫克，0.15毫摩爾)在乙醇(10毫升)中的溶液中緩慢加入TEA(15微升，0.15毫摩爾)。然后在95度下攪拌反應混合物20小時。將反應物濃縮，殘余物用EA及水萃取。將合并的有機層用水洗滌，經硫酸鈉干燥并濃縮。將殘余物經色譜純化(甲醇：DCM＝1：50)獲得化合物10。化合物10由核磁氫譜和碳譜確定結構吻合；

3)向化合物10的(48毫克，0.12毫摩爾)的THF(四氫呋喃)(10mL)溶液中緩慢加入偶氮二甲酸二異丙酯(Diisopropyl azodicarboxylate，DIAD，25毫克，0.12毫摩爾)后再加入PPh₃(三苯基膦)(32毫克，0.12毫摩爾)。在室溫下攪拌反應混合物5小時。除去溶劑，殘余物通過色譜純化，用甲醇：DCM(1：50)洗脫得到化合物11(Rngn-YH-006)；

4)化合物11的溶液(120毫克，026毫摩爾)，鈧(OTF)₃(三氟甲基磺酸鈧)(78毫克，0.16毫摩爾)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)(94毫克，0.78毫摩爾)在干燥的DCM的混合物室溫攪拌30min后，加入BOC-甘氨酸(136毫克，0.78毫摩爾)。室溫下攪拌反應混合物30分鐘后加入DCC(二環己基碳二亞胺)(272毫克，1.3毫摩爾)，室溫下攪拌過夜，然后通過硅藻土過濾并濃縮。將殘余物經色譜純化(甲醇：DCM＝1：100)，得到化合物12。化合物12由核磁氫譜和碳譜確定結構吻合；

5)往化合物12(95毫克，0.15毫摩爾)在DCM中的溶液中加入TFA(1毫升)，室溫下攪拌為30分鐘后除去溶劑，將剩余物溶解在2mL DMF(二甲基甲酰胺)，加入琥珀酸酐(97毫克，0.97毫摩爾)和4-甲基吡啶(73毫克，0.81毫摩爾)。室溫攪拌反應混合物過夜。除去溶劑，將殘余物經色譜純化(甲醇：DCM＝1：50)獲得Rngn-YH-010，兩步反應收率49％。

化合物11(Rngn-YH-006)結構由核磁氫譜和碳譜數據確定，其核磁氫譜、碳譜圖分別見圖1和圖2，由核磁氫譜和碳譜確定結構吻合，表征數據如下：

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.89(s,1H),9.12(s,1H),8.33(d,J＝9.3Hz,1H),8.25(d,J＝9.3Hz,1H),7.33(s,1H),6.53(s,1H),5.41(s,2H),5.34(s,2H),1.87(qd,J＝14.1,7.3Hz,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H).

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ172.93,161.84,157.20,152.07,150.48,147.12,146.48,145.74,133.19,132.20,128.07,122.44,119.45,116.94,115.01,97.04,72.84,65.70,50.87,30.77,8.24。

化合物Rngn-YH-010結構由核磁氫譜和碳譜數據確定，其核磁氫譜、碳譜圖分別見圖3和圖4，表征數據如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.06(s,1H),9.90(s,1H),9.11(s,1H),8.44(t,J＝5.1Hz,1H),8.32(t,J＝10.3Hz,1H),8.25(d,J＝9.4Hz,1H),7.15(s,1H),5.48(d,J＝8.6Hz,2H),5.34(s,2H),4.17(dd,J＝17.8,5.8Hz,1H),4.00(dd,J＝17.9,5.6Hz,1H),2.42(t,J＝4.5Hz,2H),2.40–2.35(m,2H),2.16(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.92(t,J＝7.4Hz,3H).

¹³C NMR(400MHz；DMSO-d₆)δ7.96,29.36,30.12,30.88,50.81,66.77,76.63,95.60,115.00,116.94,119.35,122.50,128.07,132.17,133.08,145.58,146.23,146.44,147.11,151.88,156.89,161.85,167.50,169.58,172.07,174.12。

藥效實驗

下面結合實驗對本發明化合物的活性作進一步的說明，但并不局限如此。

制備得到的喜樹堿/拓撲替康衍生物的體外抗腫瘤活性實驗

實驗原理：MTT分析法以活細胞代謝物還原劑MTT噻唑藍為基礎，利用酶標儀測定490nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目，從而測定化合物對腫瘤細胞的殺傷效果。

實驗步驟：

1)收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100μL，鋪板使待測細胞密度為1000-10000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)；

2)將96孔板放在5％CO₂，37℃培養箱中孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天晚上鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔5μL，設3-5個平行孔；5％CO₂，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察；

3)每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液；終止培養，小心吸去孔內培養液；每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，酶標儀在490nm處測量各孔的吸光值(OD值)。

計算公式如下：

抑制率＝(平均OD值–給藥組平均OD值)/(對照組平均OD值)×100％。

3種藥物分別用于檢測10種腫瘤細胞的抗癌細胞活性，分別為：

1)Rngn-YH-010(化合物12)；2)Rngn-YH-006(化合物11)；3)拓撲替康。

10種腫瘤細胞為：1)A549,Lung Cancer；2)MCF-7,Breast Cancer；3)PANC-1,Pancreatic Cancer；4)MDA-MB-231,Human Breast；5)HepG-2,Liver Cancer；6)KB,Oral Carcinoma；7)BEL-7402,Liver Cancer；8)MGC803,Gastric Cancer；9)SK-N-SH,Human Neuroblastoma；10)HuT-78,Human T cell lymphoma。

實驗結果如下表及圖5所示。

表2喜樹堿衍生物的體外抗腫瘤活性IC50(ng/ml)

圖5顯示了Rngn-YH-010、Rngn-YH-006和拓撲替康對10種不同腫瘤的體外抑制活性，縱坐標為IC₅₀，由上表及圖5均可知，體外MTT試驗檢測這些化合物對10種主要腫瘤細胞株的抗腫瘤活性。Rngn-YH-010對乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和肝癌細胞(HepG-2)兩種腫瘤都顯示出強于拓撲替康的活性，而對其他細胞的抗腫瘤活性也等同于上市藥拓撲替康。Rngn-YH-006對10種腫瘤細胞的抗腫瘤活性基本等同于上市藥拓撲替康。

以上數據和分析證實了新制備的Rngn-YH-010、Rngn-YH-006喜樹堿衍生物相較于上市的拓撲替康，具有更好的抗腫瘤生物活性，尤其在抗肝癌(HepG-2)和乳腺癌(MDA-MB-231)將可作為非常有前景的候選新藥。