本發明涉及動物分子遺傳學技術領域，尤其涉及一種zfy基因的RNA干擾片段、表達載體及其應用。
背景技術：
在自然條件下，幾乎所有哺乳動物的性別比例都接近1:1，從而實現了無間斷地進行穩定地繁衍后代，在自然的條件下達到生態平衡。對于畜牧生產實際而言，理想的性別比例具有十分重要的意義。利用泌乳、產蛋性狀進行生產的生產企業希望得到更多的雌性個體，而產肉、產毛性狀的在雄性個體上表現得優勢性更加明顯。一直以來，人類對控制動物后代的性別就有著極大的興趣。目前性別控制主要從受精前和受精后兩個方面進行，前者應用精子分離后再進行受精，使得在受精時就決定了后代的性別；后者采用早期胚胎性別鑒定，進行胚胎的性別篩選的方法來控制后代的性別。
哺乳動物性別決定理論認為，性染色體為“XX”的受精卵就能夠發育成雌性個體，而性染色體為“XY”的就會發育成雄性。那么從根本上講，控制家畜性別最理想的方法是先分離X、Y精子，然后再進行受精，就能人為地控制后代的性別，理論上這是在性別控制中最簡單、最經濟的途徑。自20世紀50年代后，關于精子分離的研究報告很多，這些研究都試圖利用X精子和Y精子不同的物理特性(體積、密度、電荷、運動性))，采用離心法、電泳法、離子交換法、細胞表面抗原法等不同的方法來實現精子的分離，但是都有一個共同的問題——可重復性差。而且這些差異隨著環境條件的不同而發生變化，因此，許多研究結果常常不一致，甚至出現相反的結論，致使兩類精子某些差異性研究存在爭議。到目前為止，除了X、Y精子DNA含量具有差異可以肯定之外，其他方面的差異表現很小，甚至難以確定。但是隨著分子生物學技術的不斷發展，以及研究工作的繼續深入，新的研究成果將會不斷涌現。
目前根據哺乳動物X、Y精子DNA含量存在差異的原理，利用流動細胞檢索儀進行分離X、Y精子，分離效果最好，純度可達90％以上，但是由于設備昂貴，分離速度慢，用于受精的精子數量少、活力差等原因，遠遠不能滿足生產上對性控精液的大量需求。相比之下，如果能夠找到兩種精子發育或受精過程中，甚至胚胎發育時關鍵性的X、Y染色體特異mRNA，結合當代新興的分子生物學技術利用RNA干擾(RNA Interference，RNAi)的方法則有望以較低的成本，簡便、快速地實現對動物的性別控制。
RNAi是一種轉錄后的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)現象，通過體外人工合成或體內產生的雙鏈RNA(Dubble-stranded RNA.dsRNA)在細胞內特異性地降解其同源的mRNA，使得相應的基因干擾，實現阻止目標基因的表達。RNAi方法能夠快速、簡便、有效、特異地下調細胞中的基因表達，它不但是研究基因功能的一種有力工具，而且也為特異性基因治療提供了新的技術手段，其應用前景十分廣闊。
在基因組、mRNA和蛋白水平的研究都證明，X、Y精子基因表達的確存在差異。基因表達檢測研究表明，在精子形成的減數分裂粗線期，為防止一些酶類與性染色體發生作用，兩條性染色體高度濃縮形成性體。性體的形成保護了性染色體，性染色體上特殊基因的表達被關閉。因此，哺乳動物成熟精子中沒有mRNA的轉錄，然而哺乳動物成熟精子中卻含有mRNA，這種差異來自精子發生過程中的轉錄，其翻譯遠落后于轉錄。這些mRNA是精子成熟后指導合成一些必須的蛋白，或者是受精后對卵母細胞mRNA庫的補充，或作為RNAi對生育和胎兒生長發育起著關鍵的作用。
Hendriksen等對小鼠的研究發現，減數分裂過程中，除Xist基因表達外，幾乎所有的性染色體基因都沒有表達，然而減數分裂后期，一些性染色體特異基因開始表達。減數分裂后，檢測到Y染色體上Ubely 和Sry基因具有較高的mRNA水平；在X精子中也檢測到Ubelx基因mRNA高水平表達，同時發現X染色體特異基因Mhr6A的表達產物。另外還有人發現X、Y染色體其他特異基因的表達，如X染色體特異基因Akap82(精子尾部的骨架蛋白)及Nap-X(編碼一種核相關蛋白)，Y染色體特異基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。
其中Zfx/Zfy基因是染色體上編碼鋅指蛋白的一對等位基因，從減數分裂期開始表達，在圓形精子細胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zinc finger-Y)基因家族中的一員，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Zfa基因，他們在分子結構上非常相似。一般哺乳動物有Zfx和Zfy基因,Zfx基因位于X性染色體上,是雌、雄性哺乳動物X染色體必含的基因,Zfy基因位于Y性染色體上，兩個基因位于性染色體的末端，但并不位于同源區域。Zfx基因包括一個酸性的轉錄激動區域，一個核定位序列和一個DNA連接區，具有13個C2H2[Cys(2)His(2)]型鋅指結構。在哺乳動物細胞中，C2H2鋅指結構是最常見的蛋白質結構之一。目前已發現800多種具有這種鋅指結構的蛋白質，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy編碼的蛋白作為轉錄因子，在精子形成過程中具有一些功能并與精子的發生有關。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明實施例提供一種zfy基因的RNA干擾片段，主要目的是通過對雄性犬的生殖細胞Y精子生成的相關基因進行沉默，阻礙或者破壞Y精子的正常發育和功能。
為達到上述目的，本發明主要提供如下技術方案：
一方面，本發明實施例提供了一種zfy基因的RNA干擾片段，其序列為GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。
另一方面，本發明實施例提供了一種上述實施例所述的zfy基因的RNA干擾片段在控制犬子代性別中的應用。
作為優選，上述的應用中，以zfy基因的RNA干擾片段對犬精子細胞中的Y精子生成相關基因進行沉默，產生特定類型的精子細胞。
另一方面，本發明實施例提供了一種表達載體，所述表達載體克隆有上述實施例所述的zfy基因的RNA干擾片段。
與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
本發明實施例提供的zfy基因的RNA干擾片段通過對雄性犬的生殖細胞Y精子生成的相關基因進行沉默，阻礙或者破壞Y精子的正常發育和功能。在與雌性犬交配時給與了X精子更多的受精機會，在受精前有效的控制了犬的性別從而使子一代犬產生的雌犬率大大升高。本方法對所需精子細胞不會造成損傷或者降低其活力，而且成本低廉。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但不作為對本發明的限定。在下述說明中，不同的“一實施例”或“實施例”指的不一定是同一實施例。此外，一或多個實施例中的特定特征、結構、或特點可由任何合適形式組合。
構建zfy基因的RNAi干擾載體：
所使用的zfy基因序列來自于NCBI基因庫，根據RNAi設計原則和在NCBI上的比對分析結果篩選出4個siRNA片段，如表1所示，為siRNA體外轉錄的zfy cDNA模板。分別在每個siRNA片段的5’和3’添加Hpa I和Xhol I酶切位點，參見表3所示，然后送生物公司合成siRNA片段。正、反義鏈通過退火合為雙鏈連接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen Vector(Clontech，美國)載體上，然后轉化到E.coli DH5α感受態細胞中(Tiangen,中國)進行擴增，提取質粒-20℃保存。
表1 siRNA的zfy cDNA模板
zfy基因的體外干擾試驗：
選取5月齡的健康雄性當地土種犬3只，通過手術在無菌條件下取出每只犬的雙側睪丸，采用兩步酶消化法分離出睪丸支持細胞和生精細胞。將這些分離出的細胞放入含10％胎牛血清的HamF12/DMEM培養液中，內添加HEPES(15mol/L)、100kU/L青霉素以及0.1g/L鏈霉素、1ug/ml表皮生長因子、100ul ITS(胰島素,轉鐵蛋白,硒酸鈉){胰島素(10μg/ml)、轉鐵蛋白(10μg/ml)}、3.3×10-7mol/L視黃酸、維生素A(3.3×10-7mo/L)、10μg/ml維生素E、10-4mol/L維生素C、10-3mol/L丙酮酸、10-7mol/L睪酮、25U/L rFSH。約按1×106CELL/cm2的密度接種于放有蓋玻片的六孔板中，在32℃、5％CO2、濕度為95％的條件下培養24小時，用鈣離子作為轉染試劑將構建好的載體轉染到生精細胞中，每組重復三次。轉染48小時候提取生精細胞的總RNA，用RT-PCR檢測zfy基因的mRNA表達水平(相關目的基因、內參基因引物、PCR條件見表2)。挑選出干擾效果較好的干擾片段進行下一步的實驗，如表3所示，以下簡稱pzq1(Zfy1904)、pzq2(zfy1857)、pzq3(Zfy1018)和pzq4(Zfy291)，表3為zfy基因RNAi寡核苷酸序列的BamHI和EcoRI酶切位點。
表2.熒光實時定量目的基因和內參基因引物序列及PCR條件
表3.帶有Hpa I和Xhol I酶切位點的zfyRNAi序列
zfy基因的動物體內干擾試驗：
選取12只成年健康雄性當地土種犬，隨機平均分為3組，每組4只；27只經產健康母犬隨機分為3組，每組9只。每組雄犬分別睪丸注射干擾載體Pqz1、Pqz2和等體積的生理鹽水，每只睪丸注射相同體積的干擾載體0.3mg。間隔10天注射一次連續注射3次。最后一次注射5天后隨機挑選27只2歲齡的經產健康當地土種雌性犬腹腔注射PMSG 5U，42-48h后注射5U HCG，然后與每組其中3只雄犬按雌雄比例3:1合籠(此時距最后一次注射質粒7d)。每日早晨，觀察陰道分泌物判斷雌犬是否受孕，直至受孕，然后將雌犬與雄犬分開進行單籠飼養，觀察產出后代的性別比例。合籠同時將每組剩余的1只雄犬處死，取雙側睪丸提取總RNA,用RT-PCR檢測各組zfy基因的mRNA表達水平，如表2所示為目的基因的引物和PCR的條件。
本發明實施例應用PLL3.7慢病毒骨架質粒載體的特異性酶切位點Hpa I和Xhol I，來優化RNAi干擾載體，只保證載體侵染活力，不進行病毒包裝，確保性控試劑的生物安全性。
實驗結果：
1、RT-PCR檢測生精細胞中zfy基因mRNA的表達水平：
選擇構建好的干擾載體pzq1、pzq2、pzq3和pzq4，轉染入體外培養的犬睪丸生精細胞，通過RT-PCR，以表2所示的熒光實時定量目的基因和內參基因引物序列及PCR條件，檢測體外條件下，犬生精細胞zfy基因mRNA表達量。與正常對照組相比，干擾載體pzq3和pzq4對zfy基因的mRNA無干擾抑制作用。而干擾載體pzq1、pzq2均可降低犬生精細胞中zfy基因mRNA表達量。其中干擾組pzq1的生精細胞中zfy基因mRNA表達量降低98.7％，差異極顯著(P＜0.01)。
2、RT-PCR檢測注射干擾試劑的睪丸組織中zfy基因mRNA的表達水平：
將體外培養條件下，細胞水平篩選的有效干擾載體pzq1、pzq2注射入犬活體睪丸，采集睪丸組織，通過RT-PCR，以表2所示的熒光實時定量目的基因和內參基因引物序列及PCR條件，檢測體內條件下，犬睪丸組織zfy基因mRNA表達量。與對照組相比，pzq2組zfy基因mRNA表達量下降了8％，差異不顯著。而pzq1組zfy基因mRNA表達量下降了97％，差異極顯著(P＜0.01)。結果顯示實驗組pzq1、pzq2中zfy基因mRNA的表達水平均低于對照組(生理鹽水組)，pzq1差異極顯著(P＜0.01)。
3、犬體內干擾試驗結果：
如表4，將體外培養條件下，細胞水平篩選的有效干擾載體pzq1、pzq2，作為性控試劑，注射入犬活體睪丸，自然交配，統計子一代犬的雌雄數量。對照組注射生理鹽水，子一代雌犬率為56.52％；注射pzq2載體，子一代雌犬率為52.38％，性別偏移不顯著(P＞0.05)；注射pzq1載體，子一代雌犬率為79.17％，性別偏移差異極顯著(P＜0.01)。結果顯示實驗組pzq2子一代犬的雌犬率與對照組沒有差異(P＞0.05)，而實驗組pzq1的子一代雌犬率高達79.17％，差異極顯著(P＜0.01)。表4顯示各組后代(子一代)雌雄犬數量。
表4犬睪丸注射干擾試驗子一代性別統計表
注：兩組之間有任一字母相同者為差異不顯著，大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。
表5體內外性控效果最好的干擾載體寡核苷酸序列
以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。