本發明涉及微生物領域中一種光合細菌菌劑及其制備方法與應用。
背景技術：
：光合細菌(PhotosyntheticBacteria，簡稱PSB)是自然界最廣泛存在的比較古老的、能進行光合作用而不產氧的特殊生理類群的原核微生物的總稱，具有原始光能合成體系，能在厭氧條件下進行不放氧的光合作用，是水體兼性厭氧層中主要的初級生產者，并在自然界的碳素、氮素、硫素轉化循環中起重要作用。它包括有紅螺菌科(Phodospirillaceae)、著色菌科(Chromati-aceae)、綠桿菌科(Chlorobiaceae)、綠色絲狀菌科(Chlo-roflexaceae)4科。沼澤紅假單胞菌是光合細菌的代表菌株之一，屬于紅螺菌科、紅假單胞菌屬，是我國農業部頒布12種允許在飼料中直接添加的活體微生物之一。根據國家農用微生物菌劑標準GB20287-2006，液體光合細菌菌劑的有效活菌數標準為≥2.0億/ml,保質期≥3個月。培養基的組成和配比對沼澤紅假單胞菌的繁殖速度和保藏期長短均有重要的影響。現有的研究表明沼澤紅假單胞菌在酵母膏存在的條件下菌體繁殖增快(張玲華,鄺哲師,陳薇,等高活性光合細菌沼澤紅假單胞菌培養特性初探[J].華南師范大學學報(自然科學版),2001(4):37–391)。菌種是菌劑生產應用的基礎。目前，限制沼澤紅假單胞菌菌劑發展的瓶頸就是高效菌種的選育問題和沼澤紅假單胞菌菌劑的制備和保藏問題。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種制備成本低(菌株生長速度快)、保質期長、既能提高雞生產性能又能提高雞免疫功能和雞肉品質的光合細菌菌劑及其制備方法。為了解決以上技術問題，本發明提供了一種光合細菌菌劑。本發明所提供的光合細菌菌劑的活性成分是沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，所述沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的菌株號為981，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCCNo.10802，以下簡稱沼澤紅假單胞菌981。所述光合細菌菌劑具體可由沼澤紅假單胞菌981和載體組成；所述載體具體可為稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮中的至少一種。本發明所提供的光合細菌菌劑的制備方法，包括將沼澤紅假單胞菌981在微生物培養基中培養得到沼澤紅假單胞菌981，將培養得到的沼澤紅假單胞菌981作為光合細菌菌劑的活性成分，得到光合細菌菌劑。上述制備方法中，所述微生物培養基可為發酵培養基B，所述發酵培養基B由水和溶質組成，所述溶質由豆芽汁和NaCl組成，所述豆芽汁是用水從豆芽中提取得到的水溶性物質；所述發酵培養基B中NaCl的含量為0.02-0.1g/L(如0.05g/L)，豆芽汁的含量以豆芽計是50-150g/L(如100g/L)。上述制備方法中，所述用水從豆芽中提取可為用水將豆芽煮沸30分鐘。上述制備方法中，所述水可為蒸餾水或去離子水。上述制備方法中，所述豆芽可為黃豆芽。本發明所提供的光合細菌菌劑的制備方法，包括將沼澤紅假單胞菌981在所述發酵培養基B中培養，收集培養容器內的物質，得到所述光合細菌菌劑。上文中，所述培養可在20-37℃(如28-37℃或30℃)每天24小時的光照強度為1000-1500Lx(1200-1500Lx或1500Lx)的光照條件下培養3天-10天(如3-7天或3天)。由上述任一種制備方法制備的光合細菌菌劑也屬于本發明的保護范圍。含有上述光合細菌菌劑的動物飼料也屬于本發明的保護范圍。上述含有光合細菌菌劑的動物飼料中，所述含有光合細菌菌劑的動物飼料由雞普通飼料和所述光合細菌菌劑組成；所述雞普通飼料不含有所述光合細菌菌劑。上述含有光合細菌菌劑的動物飼料中，所述光合細菌菌劑和所述雞普通飼料的配比滿足2.5×107-5×107cfu(菌落形成單位)沼澤紅假單胞菌981：100g所述雞普通飼料。上述含有光合細菌菌劑的動物飼料中，所述光合細菌菌劑和所述雞普通飼料的具體配比滿足2.5×107cfu沼澤紅假單胞菌981：100g所述雞普通飼料。上述含有光合細菌菌劑的動物飼料中，所述雞普通飼料除不含有上述光合細菌菌劑外，其它原料均可與雞常規飼料相同，如含有能量飼料、蛋白質飼料、礦物質飼料和維生素飼料；進一步，所述雞普通飼料還可含有抗氧化劑。所述雞普通飼料可由能量飼料、蛋白質飼料、礦物質飼料和維生素飼料組成，也可由能量飼料、蛋白質飼料、礦物質飼料、維生素飼料和抗氧化劑組成，當然，還可以在所述雞普通飼料中再加入防腐劑、著色劑、調味劑、藥物保健劑、生長促進劑等非營養性添加劑。所述能量飼料可為常用的雞能量飼料，如可選自下述物質中的至少一種：谷實、糠麩、薯、草籽和樹實等。所述蛋白質飼料可為常用的雞蛋白質飼料，如可選自下述物質中的至少一種：大豆粕、棉籽粕、玉米胚芽粕、肉骨粉、菜籽粕、花生粕和葵粕等。所述礦物質飼料可選自石粉、碳酸氫鈣、食鹽、貝殼粉、骨粉、磷酸氫鈣、碳酸鈣、食鹽、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸錳、碘化鉀、氧化鋅、亞硒酸鈉和氯化鈷等。所述維生素飼料可為常用的維生素飼料，如可選自下述物質中的至少一種：維生素A，維生素D3，維生素E，維生素K3，維生素B1g，維生素B2，維生素B6，維生素B12，煙酸，D-泛酸鈣，生物素，氯化膽堿所述抗氧化劑可為維生素E(α-生育酚)或丁基羥基茴香醚(BHA)。上述光合細菌菌劑、上述制備方法或上述動物飼料在制備提高雞免疫性能和/或提高雞生產性能和/或提高雞肉品質的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述產品可為微生態制劑或動物飼料。上述光合細菌菌劑、上述制備方法或上述動物飼料在提高雞生產性能和/或提高雞肉品質和/或提高雞免疫性能中的應用也屬于本發明的保護范圍。上述提高雞免疫性能可為下述I1)-I5)中的全部或部分：I1)提高肉雞胸腺指數；I2)提高肉雞脾臟指數；I3)提高肉雞法氏囊指數；I4)提高肉雞紅細胞C3b受體花環率；I5)提高肉雞紅細胞免疫復合物花環率；所述生產性能為下述P1)-P6)中的全部或部分：P1)出欄率；P2)肉料比；P3)蛋白質的表觀消化率；P4)鈣的表觀消化率；P5)磷的表觀消化率；P6)體重；所述提高雞肉品質為下述Q1)-Q8)中的全部或部分：Q1)提高雞肉的纈氨酸含量；Q2)提高雞肉的蛋氨酸含量；Q3)提高雞肉的苯丙氨酸含量；Q4)提高雞肉的胱氨酸含量；Q5)提高雞肉的酪氨酸含量；Q6)提高雞肉的粗蛋白含量；Q7)降低雞肉的膽固醇含量；Q8)降低雞肉的脂肪含量。本發明還提供了一種提高雞生產性能和/或改善雞肉品質和/或提高雞免疫性能的方法。本發明所提供的提高雞生產性能和/或改善雞肉品質和/或提高雞免疫性能的方法，包括用含光合細菌菌劑日糧飼喂雞；所述含光合細菌菌劑日糧由雞普通日糧和所述光合細菌菌劑組成；所述雞普通日糧不含有所述光合細菌菌劑。所述含光合細菌菌劑日糧中，所述光合細菌菌劑和所述雞普通日糧的配比為滿足2.5×107-5×107cfu(菌落形成單位)所述沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)：100g所述雞普通日糧。上文中，所述動物可為雞。所述雞可為肉雞，如艾維茵肉雞或愛拔益加肉雞。上文中，所述雞可為雛雞。本發明光合細菌菌劑的活性成分沼澤紅假單胞菌981繁殖速度快，在豆芽汁培養基(發酵培養基B)中在30℃、每天24小時的光照強度為1500Lx的光照條件下培養3天菌體含量(有效活菌數)達2.03×1010cfu/ml，在含酵母提取物培養基(發酵培養基A)中在30℃、每天24小時的光照強度為1500Lx的光照條件下培養3天菌體含量(有效活菌數)達8.37×109cfu/ml。本發明光合細菌菌劑在豆芽汁培養基(發酵培養基B)中在20℃在每天24小時的光照強度為500Lx的光照條件下保質期達120天，本發明光合細菌菌劑在該條件下保藏120天后，沼澤紅假單胞菌981的含量是26.625×109cfu/ml，是保藏0天的1.31倍。本發明光合細菌菌劑既能提高下述I1)-I5)這5種雞免疫性能，又能提高下述Q1)-Q8)這8種雞肉品質，又能提高下述P1)-P6)這6種生產性能：I1)提高肉雞胸腺指數；I2)提高肉雞脾臟指數；I3)提高肉雞法氏囊指數；I4)提高肉雞紅細胞C3b受體花環率；I5)提高肉雞紅細胞免疫復合物花環率；P1)出欄率；P2)肉料比；P3)蛋白質的表觀消化率；P4)鈣的表觀消化率；P5)磷的表觀消化率；P6)體重；Q1)提高雞肉的纈氨酸含量；Q2)提高雞肉的蛋氨酸含量；Q3)提高雞肉的苯丙氨酸含量；Q4)提高雞肉的胱氨酸含量；Q5)提高雞肉的酪氨酸含量；Q6)提高雞肉的粗蛋白含量；Q7)降低雞肉的膽固醇含量；Q8)降低雞肉的脂肪含量。保藏說明菌種名稱：沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)菌株編號：981保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期：2015年5月11日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.10802具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的分離鑒定1.1菌株分離從中國江蘇省無錫市的一個水池中采集水樣。采用vanNeil紫色非硫細菌富集培養基進行富集培養，先后富集三次，直到培養基中光合細菌成為優勢菌群。將富集以后的光合細菌樣品分別在光合細菌分離固體培養基上劃線分離單菌落，28℃厭氧罐內光照培養24小時。將平板上的單菌落挑出到液體光合細菌分離培養基中繼續培養。并重復以上的步驟，得到純化的菌株。取編號為981的菌株(菌株981)進行下述鑒定。其中，vanNeil紫色非硫細菌富集培養基的配制方法如下:NH4Cl0.1g，NaCl0.2g，NaH2P040.05g，MgCl20.02g，酵母膏0.15g，將以上各組分溶解于100ml水，121℃蒸汽滅菌20min，制成基礎培養基。在該基礎培養基中加入過濾除菌的10％NaHCO3水溶液50ml，過濾除菌的乙醇1.5ml，用過濾除菌的磷酸調pH值7.0。光合細菌分離培養基的配制方法如下:乙酸鈉3.0g，丙酸鈉0.3g，NaCl1.0g，(NH4)2SO40.3g，MgSO40.2g，KH2P040.5g，K2HSO40.3g，CaC1250mg，MnSO42.5mg，FeSO45mg，酵母膏0.1g，蛋白胨10mg，谷氨酸0.2mg，水1000ml，pH7.4。將以上組分溶于水后調pH，然后121℃蒸汽滅菌30min，如果配置固體培養基則在以上的成分中加入17g瓊脂再蒸汽滅菌，傾倒平板，做無菌檢測后用于分離單菌落。1.2菌株鑒定菌株981菌體桿狀，偶有微彎，大小為0.5-0.8×1.0-2.5um，端生單鞭毛運動的光能異養菌。革蘭氏陰性，光合內膜系統呈片層狀。光照厭氧條件下培養物為深紅色，黑暗好氧則為淺紅色，老齡菌聚集成玫瑰花狀。對氨基苯甲酸為必需生長因子。該菌具有菌綠素a和標準紫紅醚系的類紅蘿卜素，能利用甲酸鹽、乙酸鹽、丙酮酸、乳酸鹽、琥珀酸鹽、丙三醇、天冬氨酸、苯甲酸鹽、硫代硫酸鈉以及氫氣等小分子有機物為光合作用的電子供體，不能利用單糖、糖醇和硫化物。生長pH范圍5.5-8.5，最適pH6.8-7.0。生長溫度范圍20-37℃，最適溫度范圍28-37℃。菌株981的16SrRNA基因序列如序列表中的序列1所示，與沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的同源性最高，達到99％。因此，綜合以上特征確定菌株981為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981已于2015年05月11日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.10802。實施例2、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的培養本實施例采用發酵培養基A和發酵培養基B這兩種培養基培養沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802。發酵培養基A是目前認為最適合沼澤紅假單胞菌的含酵母提取物的培養基，培養基B是本發明的發明人篩選到的培養基。發酵培養基A的配制方法如下：將胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g和MgSO4·7H2O0.5g溶于蒸餾水后，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到培養基A。發酵培養基B的配制方法如下：將100g(鮮重)黃豆芽用蒸餾水煮沸30分鐘，過濾收集全部濾液，該濾液即為豆芽汁，向全部豆芽汁中加入0.05gNaCl，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到培養基B。其中，黃豆芽由胚根、胚芽、胚軸和子葉組成，胚根長度為1-2cm。1、菌種的活化挑取沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802，對其用優選固體培養基進行斜面穿刺培養，保持溫度30℃光照強度為1200Lx條件下培養10d。優選固體培養基是在發酵培養基A中加入瓊脂得到的固體培養基，具體配制方法如下：將胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g、MgSO4·7H2O0.5g和17g瓊脂溶于蒸餾水后，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到優選固體培養基。2、制備種子液將步驟1活化的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802接種于裝有實施例2的發酵培養基A的無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍蓋，在30℃、每天24小時的光照強度為1200Lx的光照條件下培養5天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液。3、發酵培養3.1利用發酵培養基B培養沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802將步驟2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液10ml接入裝有100ml發酵培養基B的100ml無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍蓋，在30℃、每天24小時的光照強度為1500Lx的光照條件下培養3天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液(簡稱發酵液B)。實驗重復三次，每次重復10個藍蓋試劑瓶。3.2利用發酵培養基A培養沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802該步驟與3.1的區別僅在于所用的發酵培養基不同，其它條件均相同，具體方法如下：將步驟2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液10ml接入裝有100ml發酵培養基A的100ml無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍蓋，在30℃、每天24小時的光照強度為1500Lx的光照條件下培養3天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基A的發酵液(簡稱發酵液A)。實驗重復三次，每次重復10個藍蓋試劑瓶。對3.1的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液和3.2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基A的發酵液按照平板稀釋計數法進行計數：量取10ml(精確到0.01ml)發酵液，放入內裝90ml無菌水的三角瓶中，置搖床振蕩30min，轉速200r/min。振蕩后靜置20min制成1：10的均勻稀釋液。采用10倍稀釋法稀釋。用滅菌吸管吸取1：10稀釋液5ml，注入含有45ml無菌水的三角瓶中，制成1：100的稀釋液，依次制成10倍遞增稀釋液。選取三個合適稀釋度懸液各取0.1ml，加至直徑為90mm的培養皿中，倒入45℃優選固體培養基，輕輕混勻，待凝固。每個稀釋度重復三次。保持溫度30℃光照強度為1200Lx條件下培養10d。計算菌數：菌體含量(cfu/ml)＝菌落平均數×稀釋倍數×基礎液體積/(樣品量×加樣量)。結果表明，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基A的發酵液中的菌體含量平均為8.37×109cfu/ml，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液中的菌體含量平均為2.03×1010cfu/ml，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液中的菌體含量是沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基A的發酵液中的菌體含量的2.42倍。表1、不同發酵液的菌體含量實施例3、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802增強肉雞免疫功能和體重1、材料1.1、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑的制備向實施例2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液中加入稻殼粉在50℃進行干燥，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑。該沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑中的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量為1×109cfu/g。其中，稻殼粉事先經過微粉化處理(90％的粉體粒度小于100μm，平均粒徑小于50μm，所述平均粒徑為50％粉體粒徑)。1.2、試驗動物選擇體重為50±5克的愛拔益加—快大型白羽肉雞的1日齡健雛，隨機均分為3個處理組，即對照組、菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組。每個處理組3個重復，每個重復300只雞。1.3、日糧下述實施例中的肉雞普通日糧的配方如表2所示。表2、肉雞普通日糧組成及配比表2中，每千克預混料含:CuSO4·5H2O0.64g,FeSO4·H2O516g,ZnSO4·H2O4g,MnSO4·H2O318g,Na2SeO30.016g,VA16IU,VD3415IU,VE400IU,VK90mg,VB160mg,VB2200mg,煙酸550mg,泛酸鈣220mg,葉酸12mg，其余為石粉。表2中的“％”為質量百分含量。肉雞育雛期日糧分為肉雞育雛期普通日糧、菌劑Ⅰ組育雛期日糧和菌劑Ⅱ組育雛期日糧。其中，肉雞育雛期普通日糧如表2所示；菌劑Ⅰ組育雛期日糧是在表2的肉雞育雛期普通日糧中添加是表2的肉雞育雛期普通日糧質量的0.025％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧；菌劑Ⅱ組育雛期日糧是在表2的肉雞育雛期普通日糧中添加是表2的肉雞育雛期普通日糧質量的0.05％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧。肉雞育成期日糧分為肉雞育成期普通日糧、菌劑Ⅰ組育成期日糧和菌劑Ⅱ組育成期日糧。其中，肉雞育成期普通日糧如表2所示；菌劑Ⅰ組育成期日糧是在表2的肉雞育成期普通日糧中添加是表2的肉雞育成期普通日糧質量的0.025％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧；菌劑Ⅱ組育成期日糧是在表2的肉雞育成期普通日糧中添加是表2的肉雞育成期普通日糧質量的0.05％的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑得到的日糧。2、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞免疫器官指數和紅細胞免疫功能試驗期28天，試驗期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規免疫程序進行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養條件完全相同。其中，對照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進行飼喂。分別于14日齡、21日齡、28日齡測定肉雞的脾臟、胸腺和法氏囊指數。測定方法為：每個重復隨機抽取20只雞，早晨空腹稱重，屠宰后摘取脾臟、法氏囊以及兩側胸腺，剔除脂肪后用電子天平稱重，計算免疫器官指數。免疫器官指數＝免疫器官重(mg)/體重(g)。按照如下方法測定21日齡肉雞紅細胞C3b受體花環(E-C3bR)率和紅細胞免疫復合物花環(E-ICR)率：每組每個重復隨機抽取6只雞，采血抗凝，離心取紅細胞，配成1.25×107個/mL的紅細胞懸液，作為待測紅細胞懸液。將酵母菌用生理鹽水洗滌3次后，配成1％懸液，置水浴內煮沸20min，充分混勻。用二層定性濾紙過濾，除去小凝塊，在低倍鏡下呈單個酵母菌細胞分散狀態。加等量小白鼠血清，混勻后置37℃水浴致敏15min。用生理鹽水洗滌一次，2500r/min離心10min。去盡上清，用生理鹽水重混懸。計數后配成1×108/ml補體(C3)致敏的酵母菌懸液。按照如下步驟進行測定：(1)取兩支小試管，每管加待測紅細胞懸液100ul，第一管再加補體致敏酵母菌懸液100ul，第二管加未致敏的酵母菌懸液100ul，搖勻放37℃水浴30min；(2)取出用手腕輕輕搖勻，加生理鹽水200ul；(3)混勻后，再加0.25％戊二醛75μl并輕輕混勻；(4)分別取1/3量水平涂片、吹干、加甲醇固定；(5)用瑞氏法染色，油鏡下計數。涂片染色后RBC為紅色，酵母菌為藍色。紅細胞上粘附2個或2個以上酵母菌者為花環。分別計數200個紅細胞，算出花環陽性細胞百分率。第一管為RBC-C3b受體花環率，第二管為RBC-IC花環率。花環形成百分率(％)＝(紅細胞花環數/200)×100。試驗所有數據采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統計軟件的獨立樣本t檢驗處理統計。結果如表3所示，14日齡和21日齡時，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的脾臟指數均極顯著高于對照組(P<0.01)；14日齡時，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的胸腺指數均極顯著高于對照組(P<0.01)；菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組其它日齡的胸腺指數、脾臟指數和法氏囊指數均顯著高于對照組(P<0.05)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肉雞脾臟、法氏囊和胸腺的發育具有促進作用。表3、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肉雞免疫器官指數的影響(mg/g)注：同行數據標注不同小寫字母者差異顯著(P<0.05)，標注不同大寫字母者差異極顯著(P<0.01)。如表4所示，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的(E-C3bR)率和(E-ICR)率均極顯著高于對照組(P<0.01)，并且菌劑Ⅰ組的(E-C3bR)率和(E-ICR)率均極顯著高于菌劑Ⅱ組。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對雞紅細胞免疫功能具有促進作用。表4、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對21日齡肉雞紅細胞花環率的測定結果(％)注：同列數據標注不同小寫字母者差異顯著(P<0.05)，標注不同大寫字母者差異極顯著(P<0.01)。3、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞體重試驗期42天，試驗期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規免疫程序進行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養條件完全相同。其中，對照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進行飼喂，在第29-42日齡用表2的肉雞育成期普通日糧進行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進行飼喂，在第29-42日齡用菌劑Ⅰ組育成期日糧進行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進行飼喂，在第29-42日齡用菌劑Ⅱ組育成期日糧進行飼喂。測定試驗期間肉雞的體重。測定方法為：分別于7日齡、14日齡、21日齡、28日齡、42日齡分別稱重一次，清晨禁食禁水稱重。稱重時，每個重復隨機抽取100只雞，分別記錄。試驗所有數據采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統計軟件的獨立樣本t檢驗處理統計。結果表明，7日齡時，各組肉雞體重差異不顯著(P＞0.05)；14日齡至42日齡時，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的肉雞活重均顯著高于對照組(P<0.05)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對提高肉雞活重具有良好的促進作用。表5、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肉雞活重的影響(g)日齡(d)對照組菌劑Ⅰ組菌劑Ⅱ組7196.2±3.84ab207.6±4.08a184.3±4.15b14312.5±6.53b338.7±6.25a332.1±7.99a21718.6±16.28b759.5±15.10a751.3±14.52a281168.1±18.77b1295.9±14.28a1265.2±16.22a351560.9±18.79b1714.2±21.35a1703.3±19.01a421898.9±21.02b2095.8±22.21a2085.2±20.12a注：表中同行的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。實施例4、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞生產性能和改善肉雞肌肉品質1、材料1.1、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑的制備向實施例2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液中加入稻殼粉在50℃進行干燥，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑。該沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌劑中的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量為1×109cfu/g。其中，稻殼粉事先經過微粉化處理(90％的粉體粒度小于100μm，平均粒徑小于50μm，所述平均粒徑為50％粉體粒徑)。1.2、試驗動物選擇體重為50±5克艾維茵—白羽肉雞的1日齡健雛，隨機均分為3個處理組，即對照組、菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組。每個處理組3個重復，每個重復300只雞。1.3、日糧同實施例3的1.3。2、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉雞生產性能試驗期47天，試驗期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規免疫程序進行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養條件完全相同。其中，對照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進行飼喂，在第29-47日齡用表2的肉雞育成期普通日糧進行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅰ組育成期日糧進行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅱ組育成期日糧進行飼喂。測定試驗期間肉雞的死亡率、出欄率、采食量以及料肉比。于第36日齡至47日齡采集肉雞糞樣和日糧樣品，以內源指示劑法(4mol/L鹽酸不溶灰分)測定肉雞的營養物質表觀消化率。日糧和糞樣中的粗蛋白(CP)含量采用GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測定方法，鈣含量采用NY/T1944-2010飼料中鈣的測定(原子吸收分光光譜法)，磷含量采用GB/T6437-2002飼料中總磷的測定(分光光度法)。計算公式如下：死亡率(％)＝死亡雞只數(只)/入舍雞只數(只)×100；出欄率(％)＝出欄雞只數(只)/入舍雞只數(只)×100；平均日采食量＝(配料總量—剩料量)/試驗天數*每組雞數平均日增重＝(試驗末平均體重—試驗初平均體重)/試驗天數料肉比＝平均日采食量/平均日增重。日糧營養物質表觀消化率(％)＝[1-(b/a)×(c/d)]×100。其中，a為日糧中某營養成分的含量(％)；b為糞便中某營養成分的含量(％)；c為日糧中鹽酸不溶灰分的含量(％)；d為糞便中鹽酸不溶灰分的含量(％)。試驗所有數據采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統計軟件的獨立樣本t檢驗處理統計。結果表明，菌劑Ⅰ組的料肉比顯著低于對照組(P<0.05)(表6)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981能夠降低肉雞料肉比。表6、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肉雞料肉比的影響處理料肉比對照組1.98a菌劑Ⅰ組1.83b菌劑Ⅱ組1.94ab注：同列標注不同字母為差異顯著(P<0.05)。結果表明，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的死亡率均顯著低于對照組(P<0.05)，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的出欄率均顯著高于對照組(P<0.05)(表7)。表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981能夠降低肉雞死亡率，提高出欄率。表7、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肉雞死亡率的影響注：同列標注不同字母為差異顯著(P<0.05)。結果表明，菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的粗蛋白(CP)表觀消化率、鈣(Ca)表觀消化率、磷(P)表觀消化率均顯著高于對照組(P<0.05)(表8)。說明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981可提高肉雞粗蛋白表觀消化率、鈣表觀消化率和磷表觀消化率。表8、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肉雞日糧表觀消化率的影響注：同列標注不同字母為差異顯著(P<0.05)。3、用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802改善肉雞肌肉品質試驗期47天，試驗期間所有肉雞自由采食和飲水，按照常規免疫程序進行免疫，各組除飼喂的日糧不同外，其它飼養條件完全相同。其中，對照組在第1-28日齡用表2的肉雞育雛期普通日糧進行飼喂，在第29-47日齡用表2的肉雞育成期普通日糧進行飼喂；菌劑Ⅰ組在第1-28日齡用菌劑Ⅰ組育雛期日糧進行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅰ組育成期日糧進行飼喂；菌劑Ⅱ組在第1-28日齡用菌劑Ⅱ組育雛期日糧進行飼喂，在第29-47日齡用菌劑Ⅱ組育成期日糧進行飼喂。試驗期結束前一天，每重復選取體重相近的雞3只，頸部放血屠宰，宰前禁食12h。測定雞全身肌肉中膽固醇含量、粗蛋白含量和氨基酸含量。3.1膽固醇含量按照GB/T5009.128-2003《食品中膽固醇的測定》標準進行測定。3.2粗蛋白質含量測定稱取肉樣，然后用組織搗碎機搗碎，放入烘箱恒溫烘干。在消解管中加入2g肉樣、2.5g抗氧化劑和10mL濃硫酸，然后在高溫消解爐上進行樣品消化。應用凱氏定氮儀進行測定，計算公式為：粗蛋白％＝(A-A0)×0.014×6.25×0.1612/W×100％A0為空白對照，W為肉樣重(g)，0.1612為硫酸濃度，A為機讀數。3.3粗脂肪含量測定取肉樣，然后用組織搗碎機搗碎混勻，在烘箱中恒溫烘干，在濾紙筒內放置1g樣品；烘干濾紙筒，直至稱量為恒重，在脂肪測定儀上進行粗脂肪的測定。3.4氨基酸含量測定按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》標準進行測定試驗所有數據采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)統計軟件的獨立樣本t檢驗處理統計。結果表明菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組的肌肉的膽固醇含量和粗脂肪含量顯著低于對照組，粗蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)(表9)。說明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802可以有效地改善肉雞肉質的營養成分。表9、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肌肉營養成分的影響檢測指標對照組菌劑Ⅰ組菌劑Ⅱ組膽固醇(mg/100g)79.63±1.59a75.58±1.35b75.81±1.55b粗蛋白(％)24.71±0.26b26.72±0.21a26.39±0.27a粗脂肪(％)4.46±0.19a3.62±0.15b3.79±0.18b注：同行標注不同字母為差異顯著(P<0.05)。結果表明菌劑Ⅰ組和菌劑Ⅱ組肌肉的纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，其它氨基酸含量沒有顯著差異(表10)。纈氨酸含量的增加，可以使血漿中丙氨酸升高，并且提高動物機體免疫機能；蛋氨酸含量的增加，可以提高機體免疫力、降低日糧粗蛋白質水平，同時在一定的程度上提高生產性能；賴氨酸的升高，可以提高胃液分泌功效，起到增進食欲、促進生長與發育的作用，提高鈣的吸收及其在體內的積累，加速骨骼生長。說明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802可以提高雞肌肉的纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量。表10、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981對肌肉氨基酸含量的影響注：同行標注不同字母為差異顯著(P<0.05)。實施例4、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的保存1、菌種的活化挑取沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802，對其用優選固體培養基進行斜面穿刺培養，保持溫度30℃光照強度為1200Lx條件下培養10d。優選固體培養基是在發酵培養基A中加入瓊脂得到的固體培養基，具體配制方法如下：將胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g、MgSO4·H2O0.5g和17g瓊脂溶于蒸餾水后，用蒸餾水定容至1000mL，然后121℃蒸汽滅菌30min，得到優選固體培養基。2、制備種子液將步驟1活化的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802接種于裝有實施例2的發酵培養基A的無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍蓋，在30℃、每天24小時的光照強度為1200Lx的光照條件下培養5天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液。3、發酵培養將步驟2的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802種子液10ml接入裝有100ml實施例2的發酵培養基B的100ml無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，擰緊藍蓋，在30℃、每天24小時的光照強度為1500Lx的光照條件下培養3天，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的發酵培養基B的發酵液(簡稱發酵液B)，該發酵液B即為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑。實驗重復三次，每次重復10個藍蓋試劑瓶。4、保藏將步驟3的發酵液B進行B1和B2這兩種保藏：B1、在光照強度為500Lx的光照條件下進行保藏將步驟3發酵剛結束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑轉入無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑裝至瓶口，擰緊藍蓋，置于20℃在每天24小時的光照強度為500Lx的光照條件下分別放置30天、60天、90天、120天、150天、180天和210天后，按照實施例2的平板稀釋計數法進行計數。將步驟3發酵剛結束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑記為放置0天。每個處理重復三次，每次重復10個藍蓋試劑瓶。B2、在光照強度為10Lx的光照條件下進行保藏該步驟與B1的區別僅在于光照強度不同，其它條件均相同，具體方法如下：將步驟3發酵剛結束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑轉入無菌藍蓋試劑瓶(螺紋口的透明玻璃瓶)中，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑裝至瓶口，擰緊藍蓋，置于20℃在每天24小時的光照強度為10Lx的光照條件下分別放置30天、60天、90天、120天、150天、180天和210天后，按照實施例2的平板稀釋計數法進行計數。將步驟3發酵剛結束得到的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑記為放置0天。每個處理重復三次，每次重復10個藍蓋試劑瓶。結果表明沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B1條件下保藏120天后，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(簡稱沼澤紅假單胞菌981)的含量是26.625×109cfu/ml，是保藏0天的1.31倍，保藏150天后沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(簡稱沼澤紅假單胞菌981)的含量是12.375×109cfu/ml，是保藏0天的0.61倍；沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B2條件下保藏60天后沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(簡稱沼澤紅假單胞菌981)的含量是12.0×109cfu/ml，是保藏0天的0.59倍(表11)。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B1條件下的保質期為120天，在B2條件下的保質期為60天。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑在B1條件下滿足農業微生物菌劑標準(GB20287-2006)中關于液體劑型菌劑有效活菌數大于等于2.0億cfu/ml，保質期大于等于三個月的規定。表11、B1和B2保藏不同時間后的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液體菌劑中沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量當前第1頁1 2 3