一種比率式檢測肼的熒光探針及其合成方法與應用與流程

本發明屬于化學分析檢測技術領域，具體涉及一種比率式熒光法檢測肼的分子探針及其制備方法和在檢測肼方面的應用。

背景技術：

肼(N₂H₄)是一種具有高反應活性的物質，在化學與制藥合成工業中有這廣泛的應用，同時不可避免地會排放到環境中。美國國家環境保護局認定肼為一種潛在致癌物，規定其安全限量值為10 ppb (0.3μmol·L^-1)。肼排放到環境中，由于極易溶于水，容易通過皮膚和呼吸等途徑被人體攝入，導致肝、肺、腎及神經系統的損傷。肼的排放不僅嚴重污染環境，而且影響人們的健康。所以開發高靈敏、高選擇檢測肼的方法對環境檢測與保護是非常必要的。

傳統的檢測肼的方法主要有滴定測量（Malone H.E. Anal. Chem. 1961, 33, 575.）、電化學方法（Stetter J.R., Blurton K.F., Valentine A.M. J. Electrochem. Soc. 1978, 125, 1804；Channon R.B., Joseph M.B., Bitziou E. Anal. Chem. 2015, 87, 10064.）及色譜法（Gyllenhaal O., Gr?nberg L., Vessman J. J. Chromatogr. A 1990, 511, 303；Sun M., Bai L., Liu D.Q. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 49, 529.）等。但這些方法一般都耗時較長、涉及復雜繁瑣的樣品處理過程或需要昂貴的精密儀器等。而利用分子探針熒光法檢測肼具有樣品處理簡潔、成本低廉及操作簡便快速等優點，近年來得到了發展與利用。但目前開發的用于檢測肼的探針分子的響應原理大都是單波長熒光強度依耐性的，這類探針測試結果容易受樣品基質及探針濃度的影響。而比率式的熒光探針(用兩個波長處的熒光發射強度的比值來定量)能克服上述問題。

技術實現要素：

對于上述情況，本發明目的是提供一種新的易于制備、性能穩定的比率式熒光分子探針，并提供該探針的合成方法，還在此基礎開發出對肼進行高選擇性和高靈敏度的檢測方法。

為實現本發明目的，本發明利用肼具有較強的親電性，能對缺電子分子或基團進行親電取代反應。而溴代脂肪酸在一定的溶液環境中溴能選擇性的被肼取代。另一方面萘酰亞胺熒光骨架具有良好的熒光特性且通過在4位引入不同的官能團會使其產生比率式的熒光相應。基于此，設計了一種溴代脂肪酸為響應基團，萘酰亞胺骨架作為發光團的用于檢測肼的熒光分子探針。

所述檢測肼的熒光分子探針，其特征在于，結構通式如下：

其中R選自具有1至18個碳原子的烷基鏈中的任一種；n為2、3或4；X為Cl或Br。優選：R選自具有1至6個碳原子的烷基鏈中的任一種；n為2、3或4；X為Cl或Br。優選：R選自具有1至4個碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種；n為2或3；X為Cl或Br。

進一步優選為：

化合物1

其合成方法具體如下：

將取代的4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與鹵代脂肪酸在有機溶劑中溶解后，加入催化劑在室溫下偶聯反應，分離純化后得到探針分子化合物。

4- 羥基-1,8-萘酰亞胺骨架中的酰亞胺N取代基選自1至18個碳原子的烷基鏈中的任一種，優選為1-6個碳原子中的任一種。更優選1至4個碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種。

鹵代脂肪酸為：

其中：n為具為2、3或4；X為Cl或Br；n優選為2或3，X優選為Br。

所述反應溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮。

所述催化劑選4-二甲氨基吡啶，二環己基碳二亞胺，N,N-二異丙基碳二亞胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺中的一種或兩種。

上述方法中反應溫度為室溫。

上述方法中反應時間為12-24 h。

優選其制備方法如下：

將取代的4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與鹵代脂肪酸溶于二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺與N-甲基吡咯烷酮后室溫反應12h，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離得到純的探針化合物。

化合物1合成方法如下：

將N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與4-溴丁酸在有機溶劑中溶解后，加入催化劑在室溫下偶聯反應，分離純化后得到探針分子化合物1。反應流程如下：

利用該分子探針對肼進行定性和定量測定，用于水體、土壤或生物體系中肼的檢測。

采用比色法檢測時，溶液從無色變為黃色，實現待測樣品中肼的定性檢測；

采用熒光檢測時，將所述分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖體系中，加入含不同濃度肼溶液，測試其在550 nm和420 nm處熒光強度，然后以溶液在550 nm和420 nm處熒光發射強度的比值對肼的濃度作標準圖，根據標準圖，定量檢測待測肼溶液含量。

采用比色法或熒光法檢測時，所述熒光分子探針對肼的檢測濃度為1 – 30 μmol·L^-1，檢測限為0.27 μmol·L^-1。

本發明所述檢測肼的分子探針另一種應用方式是通過將薄層色譜板在含本發明所述分子探針的二氯甲烷溶液中浸泡后干燥，制備得到肼監測硅膠板，利用該硅膠板定性檢測氣態肼。

本發明所述熒光法檢測肼的分子探針，優選采用N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與4-溴丁酸通過酯化偶聯反應合成得到，萘酰亞胺為熒光基團；4-溴丁酸酯為肼的響應基團。

在本說明書的實施例中更詳細地說明了該探針的合成和檢測方法。將本發明熒光分子探針溶解于水與二甲基亞砜(DMSO) 的混合緩沖溶液中，室溫下便可以對肼進行測試。當加入肼后，肼能親核取代溴原子，并進一步通過成環脫除反應，使萘酰亞胺4位的羥基游離出來形成氧負離子的結構。反應后探針分子的酰亞胺為大π共軛的吸電子基團，反應后形成的4位的氧負離子為給電子基團。從而產生強烈的分子內電荷轉移(ICT) 效應，使探針溶液的吸收光譜與發射光譜都呈現出顯著地紅移。

本發明熒光法檢測肼的探針的具體特征如下：

該熒光探針分子具有良好的穩定性和光學性質，反應前最大吸收波長為~350 nm，單獨溶液呈無色，發射波長在~420處，為藍色發射；隨著肼的加入，探針分子在紫外吸收峰紅移至~450 nm，溶液呈黃色，熒光發射峰紅移至~550 nm，為黃綠色發射。

本發明所述的探針分子原料易得，合成產率較高，光學性能穩定（探針溶液能在室內穩定存放一個月以上，其光譜性質保持不變），靈敏度較高，對肼識別能力強，響應速度較快，響應范圍為1.0 – 30 μmol·L^-1，檢測限低（0.27 μM），因此該類型探針可用于水體、土壤以及生物體系及氣態肼的檢測。

附圖說明

圖1為本發明合成的分子探針的核磁共振氫譜；

圖2 為本發明分子探針與肼反應前后的紫外譜圖A與熒光光譜圖B，其中，A圖中，1-反應前，2-反應后；B圖中，1-反應前，2-反應后；

圖3為本發明5 μmol·L^-1分子探針在加入不同濃度肼后熒光發射光譜圖，從a至s，肼濃度分別為0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、 60、 70、 80、 90、 100 μmol·L^-1，溶液體系為水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4），橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖4為肼的濃度標準曲線圖，即5 μmol·L^-1分子探針，反應前后在550 nm和420 nm處熒光發射強度的比值（I₅₅₀/I₄₂₀）和肼濃度的線性關系；橫坐標為肼的濃度，縱坐標為I₅₅₀/I₄₂₀。

圖5為本發明分子探針對肼選擇性；即5 μM本發明分子探針，加入100 μmol·L^-1不同離子(Ag⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Li⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、F^-、HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-)后，在550 nm和420 nm處熒光發射強度的比值（I₅₅₀/I₄₂₀）的變化；橫坐標為測試的干擾離子，縱坐標為I₅₅₀/I₄₂₀。

圖6為本發明肼硅膠板檢測氣態肼的實驗圖；即本發明制備的薄層硅膠板在不同濃度肼水溶的密閉容器氣氛中處理后的光學照片（上）和紫外燈下的照片圖（下）。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例 1：熒光分子探針的合成

將N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺(0.27 g, 1.0 mmol)與4-溴丁酸(181 mg, 1.1 mmol)溶于二氯甲烷(10 mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(170 mg, 1.1 mmol)與N-甲基吡咯烷酮(8.5 mg, 0.1 mmol)后室溫反應12h。待反應結束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離（洗脫劑為二氯甲烷/甲醇=4/1的混合溶液）得到產物白色固體320mg (收率：76%)。產物結構式如下:

¹H NMR (400 Hz, CDCl₃): δ 8.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.19 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 7.76 – 7.65 (m, 1H), 7.53 – 7.43 (m, 1H), 4.19 – 4.02 (m, 2H), 1.64 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 1.55 (s, 2H), 1.38 (dd, J = 14.8, 7.3 Hz, 2H), 1.27 – 1.21 (m, 2H), 1.15 – 1.06 (m, 2H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS [ESI]: m/z, calcd for [M+H]⁺ 418.0654; found 418.0648.

實施例2

將N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺270 mg (1.0 mmol)與4-溴丁酸181 mg (1.1 mmol)在二氯甲烷(10 mL)中溶解后加入4-二甲氨基吡啶與二環己基碳二亞胺，室溫下反應過夜，待反應結束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離（洗脫劑為二氯甲烷/甲醇=4/1的混合溶液）得到產物白色固體,(收率：79%)。

實施例 3：探針對肼的熒光檢測

將上述制得分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4)），配制成5 μmol·L^-1的探針溶液。在3 mL的比色皿中加入2mL配制的5 μmol·L^-1 的探針溶液，然后分別加入不同濃度的肼后均勻混合，測試其熒光光譜，結果如圖3所示。以溶液在550 nm和420 nm處熒光發射強度的比值對肼的濃度作圖，肼濃度在1.0 – 30 μmol·L^-1范圍內時，兩者之間呈現良好的線性關系(圖4)，根據標準圖，實現該濃度范圍內待測樣品中肼的定量檢測，而且溶液從無色變為黃色，也適用于裸眼檢測。并且此探針不受其它一些常見離子的影響，如：Ag⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Li⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、F^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-。在上述干擾離子存在的條件下，探針對含肼仍具有良好的選擇性和靈敏度(圖5)。

通過將薄層色譜板在含1 mmol·L^-1 探針的二氯甲烷溶液中浸泡后干燥，制備得到了肼監測硅膠板。將制備的薄層硅膠板在不同濃度肼水溶（體積分數分別為：0，0.1%，1%，5%，10%，15%，20%，30%，40%）的密閉容器氣氛中處理1h，可以明顯地觀測到硅膠板逐漸由無色變為黃色。在手持紫外燈下發射的熒光由藍色逐漸變為黃綠色(圖6)。

可以看出，本發明能實現對肼的定性、定量檢測，靈敏度高，檢測限達0.27μmol·L^-1，且抗干擾強。