具有免疫原性的模擬金黃色葡萄球菌LTA表位的多肽及其應用的制作方法

本發明涉及一種多肽及其應用，特別涉及一種模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽。

背景技術：

金黃色葡萄球菌（S. aureus）是一種寄居于人體皮膚和粘膜的革蘭氏陽性菌，是社區和院內感染的主要病原體。伴隨抗生素廣泛應用，金葡菌感染率在發達國家已經超過40% [1]，近十年來耐藥菌株（如耐甲氧西林、耐萬古霉素等）出現使臨床用藥面臨嚴峻考驗，如2013年我國CHINET細菌耐藥性監測結果顯示金葡菌中甲氧西林耐藥株的平均檢出率高達45.2% [2]。在應對上述挑戰中，人們對免疫學防治金葡菌感染寄予希望，然而迄今為止針對金葡菌不同成分的10余種疫苗尚無一被批準臨床應用 [3]，具體表現為：（1） 莢膜多糖交聯載體疫苗是胞外菌多糖疫苗的最常用類型，但針對金葡菌莢膜多糖疫苗StaphVAX已經失敗，原因在于約有20%金葡菌臨床分離株缺失莢膜多糖，以此疫苗候選免疫后部分個體不能產生保護性抗體；（2）以致病因子和表面蛋白作為疫苗靶標：多采用重組表達蛋白技術，表達相應細菌蛋白成份，如金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）突變體、鐵表面決定子B（IsdB）等；（3）滅活全菌疫苗SA75因誘導保護性反應差而終止。

現有疫苗主要針對金葡菌各種致病因子。但金葡菌致病因子眾多（多達50種以上），不同致病因子在細菌感染不同時期發揮不同作用 [4]；而且金葡菌可以逃避機體免疫系統對其殺傷和識別。單純選擇金葡菌致病蛋白作為靶點進行疫苗研制有一定局限性。因此選擇穩定表達于金葡菌表面、保守性結構作為疫苗候選成為現階段金葡菌疫苗研究的方向。

脂磷壁酸（LTA）是金葡菌及其它革蘭氏陽性菌的保守成份。由磷酸二脂鍵連接的磷酸甘油殘基與一個膜載體共價連接的線性聚合物 [5]。脂磷壁酸無種屬特異性，廣泛表達于金葡菌、鏈球菌、糞球菌等革蘭氏陽性菌細胞壁表面，是維持細菌細胞壁完整結構的重要成份 [6,7]；同時還是細菌表面重要粘附分子，參與細菌對宿主細胞的粘附作用；脂磷壁酸可作用于樹突狀細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞導致促炎性細胞因子（如白細胞介素6、腫瘤壞死因子α、白細胞介素1和白細胞介素8等）分泌，介導細菌感染后膿毒癥發生 [8]。然而常規并不將此分子作為疫苗候選，原因在于脂磷壁酸是糖脂類成份，屬于非胸腺依賴性抗原，單純以此分子作為疫苗不能誘導有效免疫記憶以及良好免疫應答。已有研究表明合成的線性肽以及在線性肽基礎上合成的多價抗原肽可有效模擬病原體中的糖脂類結構，以這些模擬糖脂的合成肽作為疫苗候選，能誘導機體產生針對相應病原體的保護性效應，包括特異性抗體和細胞免疫應答[9-15]。由此可以預見，能夠模擬脂磷壁酸表位的多肽(包括線性肽和多價抗原肽)有助于開發出新的、有效的金黃色葡萄球菌疫苗以及診斷性試劑。

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技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，以該多肽作為免疫原免疫小鼠，可誘導小鼠抵御金葡菌系統性感染，從而該多肽可作為用于研發新的金葡菌疫苗。

本發明人通過篩選，得到一條可模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，其序列如下：VHWDFRQWWQPS（SEQ ID NO：1），記為L3（為便于檢測，N端標記生物素）。以此核心序列合成線性肽L3-1（為便于檢測，N端標記生物素，序列為Biotin-HSVHWDFRQWWQPSGGGS（SEQ ID NO：2））和改變N端V為G氨基酸殘基、合成的線性肽L3-2（為便于檢測，N端標記生物素，序列為Biotin-HSGHWDFRQWWQPSGGGS（SEQ ID NO：3））；同時以L3-1序列合成四分枝多價抗原肽(即在四分枝多聚賴氨酸支架上包含四條HSVHWDFRQWWQPSGGGS)，記為MAP3。酶聯免疫吸附實驗表明L3、L3-1、L3-2以及四分枝多價抗原肽MAP3與抗多種革蘭氏陽性菌脂磷壁酸的單克隆抗體結合；以MAP3作為免疫原免疫小鼠，MAP3免疫組小鼠在金葡菌系統性感染后腎臟和肺臟細菌殘存量顯著低于對照肽免疫組和空白組。

本發明所采取的技術方案是：

一種模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，其核心氨基酸序列為VHWDFRQWWQPS或GHWDFRQWWQPS（SEQ ID NO：4）。

可選的，該多肽序列的一端至少連接有不超過5個氨基酸的保護肽。

進一步的，該多肽核心氨基酸序列的N端連接有兩個氨基酸HS。

進一步的，該多肽核心氨基酸序列的C端連接有GGGS。

進一步的，該多肽序列為HSVHWDFRQWWQPSGGGS或HSGHWDFRQWWQPSGGGS。

一種免疫原，該免疫原上偶聯有模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，多肽的序列如上所述。

免疫原上偶聯有多條模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽。

免疫原由多聚賴氨酸支架和偶聯在其上的模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽組成。

本發明的有益效果是：

1)本發明所提供的模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，具有較好的抗原性，即能與針對多種革蘭氏陽性菌脂磷壁酸的單抗隆抗體特異性結合。說明這種多肽能良好模擬脂磷壁酸保守性表位，未見同類報道。

2)本發明所提供的模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，作為免疫原免疫小鼠，能誘導小鼠抵御金葡菌系統性感染。所述序列有望開發為新型的、具有保護性效果的金黃色葡萄球菌疫苗以及診斷性試劑。

附圖說明

圖1是線性肽L3與抗脂磷壁酸單抗的結合情況；

圖2 是線性肽L3-1與抗脂磷壁酸單抗的結合情況；

圖3 是線性肽L3-2與抗脂磷壁酸單抗的結合情況；

圖4 是四分枝多價抗原肽MAP3結構模式圖；

圖5是 MAP3與抗脂磷壁酸單抗的結合情況；

圖6 是MAP3免疫小鼠可降低金葡菌系統性感染后腎臟（A）和肺臟(B)細菌殘存量。

具體實施方式

一種模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，其核心氨基酸序列為VHWDFRQWWQPS或GHWDFRQWWQPS。

可選的，該多肽的序列的至少一端連接有不超過5個氨基酸的保護肽。更佳的，連接的氨基酸不超過4個。保護肽的作用在于更好地維持核心多肽的穩定性，避免其結構被破壞而失效。同時，保護肽的存在也利于將核心肽偶聯在其他半抗原上，以提高其免疫原性。

進一步的，該多肽核心氨基酸序列的N端連接有兩個氨基酸HS。

進一步的，該多肽核心氨基酸序列的C端連接有GGGS。

進一步的，該多肽序列為HSVHWDFRQWWQPSGGGS或HSGHWDFRQWWQPSGGGS。

一種免疫原，該免疫原上偶聯有模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，多肽的序列如上所述。

進一步的，免疫原上偶聯有多條模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽。如2條，3條、4條或更多。以進一步提高其免疫原性。

進一步的，免疫原由多聚賴氨酸支架和偶聯在其上的模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽組成。

線性肽L3與抗脂磷壁酸單克隆抗體（MA1-7401）特異性結合

根據序列VHWDFRQWWQPS合成線性肽L3（序列:Biotin-VHWDFRQWWQPS），酶聯免疫吸附實驗表明線性肽L3與抗脂磷壁酸的單克隆抗體（MA1-7401）特異性結合（圖1）。說明L3模擬脂磷壁酸表位。

酶聯免疫吸附實驗具體方法：以抗LTA單抗MA1-7401（5μg/ml，50μl/孔）包被酶標板，4℃孵育過夜，酪蛋白封閉液（200μl/孔）封閉 37℃ 2小時，洗板后加入L3合成肽（500μg/ml），37℃孵育1小時，洗板后加辣根過氧化物酶標記的親和素（HRP-Avidin），37℃孵育30分鐘，洗板后加底物顯色。測OD450nm。

線性肽L3-1與抗脂磷壁酸單克隆抗體特異性結合

在L3序列基礎之上，為使VHWDFRQWWQPS序列更穩定，分別在L3序列N端加入HS兩個氨基酸殘基，C端加GGGS四個氨基酸殘基，合成肽命名為L3-1，序列為Biotin-HSVHWDFRQWWQPSGGGS。酶聯免疫吸附實驗表明L3-1與抗脂磷壁酸單抗（MA1-7401）呈劑量依賴性結合（圖2），說明L3-1保持L3合成肽的抗原性，模擬脂磷壁酸表位，同時說明核心序列VHWDFRQWWQPS序列模擬脂磷壁酸表位。

酶聯免疫吸附實驗具體方法：以抗LTA單抗MA1-7401（5μg/ml，50μl/孔）包被酶標板，4℃孵育過夜，酪蛋白封閉液（200μl/孔）封閉 37℃ 2小時，洗板后加入不同濃度L3-1合成肽，37℃孵育1小時，洗板后加辣根過氧化物酶標記的親和素（HRP-Avidin），37℃孵育30分鐘，洗板后加底物顯色。測OD450nm。

線性肽L3-2與抗脂磷壁酸單克隆抗體（MA1-7401）特異性結合實驗

在L3-1序列基礎上，用G氨基酸殘基替換N端V氨基酸殘基，合成線性肽。序列為Biotin-HSGHWDFRQWWQPSGGGS（命名為L3-2）。酶聯免疫吸附實驗結果表明L3-2仍保持與抗脂磷壁酸單克隆抗體結合（見圖3），說明L3-2肽模擬脂磷壁酸表位。

具體實驗方法：以抗LTA單抗MA1-7401（5μg/ml，50μl/孔）包被酶標板，4℃孵育過夜，酪蛋白封閉液（200μl/孔）封閉 37℃ 2小時，洗板后加入不同濃度L3-2合成肽，37℃孵育1小時，洗板后加辣根過氧化物酶標記的親和素（HRP-Avidin），37℃孵育30分鐘，洗板后加底物顯色。測OD450nm。

四分支多價抗原肽與抗LTA單抗（MA1-7401）特異性結合實驗

與線性肽相比，四分支多價抗原肽的優勢是分子量大、在體內穩定、不易被降解，是良好的疫苗候選。為后續檢測多肽是否可以模擬LTA表位并可以作為疫苗候選免疫實驗動物，根據L3-1線性肽序列合成四分支多價抗原肽MAP3（含四分支多聚賴氨酸支架，每一支架上連接一條HSVHWDFRQWWQPSGGGS，結構模式圖見圖4）。結果顯示抗LTA單抗特異地與MAP3結合（圖5），說明四分支多價抗原肽MAP3并未改變原始線性肽L3-1的構象，依然可以模擬LTA表位，可用于后續免疫動物。

具體實驗步驟：以不同濃度MAP3包被酶標板 4℃ 過夜孵育，洗板后加入酪蛋白封閉液（200μl/孔）37℃ 封閉2小時，洗板后加入MA1-7401（5μg/ml）37℃孵育40分鐘，洗板后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體 37℃孵育40分鐘，洗板后底物顯色，測OD450nm。

免疫小鼠實驗

具體實驗步驟：隨機將BALB/c小鼠分為3組，分別免疫MAP3、對照MAP（MAPctrl）和空白對照組（blank, 無免疫組）。以MAP3或MAPctrl為免疫原，100μg/只免疫小鼠，共免疫五次，間隔時間為3周、2周、2周、2周、2周。末次免疫后7天，靜脈注射金葡菌（2×10⁷ CFU/只），感染3天后取小鼠腎臟和肺臟，研磨，離心后測臟器研磨液中細菌殘存量。結果顯示MAP3免疫組小鼠腎臟和肺臟細菌殘存量顯著低于MAPctrl組和空白對照組（圖6）。提示MAP3作為LTA替代物免疫小鼠后，可保護小鼠抵御金葡菌系統性感染。因此MAP3有望作為金葡菌疫苗候選。

<110> 南方醫科大學南方醫院

<120> 具有免疫原性的模擬金黃色葡萄球菌LTA表位的多肽及其應用

<130>

<150> CN2016102968514

<151> 2016-05-05

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

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