本發明屬于環境污染生物修復領域，涉及一種酰胺類除草劑乙草胺降解菌及其菌劑的發酵生產和應用。
背景技術：
乙草胺是美國孟山都公司1971年開發的一種新型酰胺類除草劑，作為該類除草劑早期開發的品種，乙草胺占酰胺類除草劑當前銷售量的最大份額，是目前世界上最重要的除草劑品種之一，也是目前我國使用量僅次于草甘膦的第二大類除草劑。可廣泛用于玉米、水稻、花生、棉花、大豆、煙草、蔬菜等農作物的芽前土壤處理。因其具有除草活性高、持效期適中、應用范圍大等優點，所以應用面積不斷擴大。
隨著乙草胺的大量使用，其對環境的危害也日益加大，主要表現為對土壤微生物的影響、對土壤動物的毒害、對哺乳動物的毒害和對人類健康的影響、對魚類和水生動物的毒害以及對植物的毒害。鑒于此，美國環境保護局1994年將乙草胺定為B-2類致癌物質，但目前，乙草胺在我國旱田化學除草劑中仍占有著相當重要的地位，是我國生產量和使用量最多的三大除草劑之一，2011年，乙草胺在我國的使用量達7.3萬噸。
由于環境中殘留的乙草胺會對環境產生不利影響，因此因而尋求環境友好、生態安全的乙草胺殘留消除技術顯得十分重要，且一直是農業科技工作者的重要努力方向之一。 微生物修復技術是一種環境友好型的污染治理技術，其原理是利用微生物的新陳代謝活動來降解有機污染物，通過人工接種高效降解性微生物或刺激降解性微生物大量生長，使之能夠在自然條件下將有機污染物消除。該項技術起初主要集中在石油污染環境的生物修復研究上，現在，已被應用到土壤、水體等環境中的其他污染物處理。相對于物理、化學修復方法而言，生物修復具有成本低、效果好、無二次污染等優點，因此，該項技術日益引起人們的研究興趣，在國內外，微生物修復技術已經廣泛應用于石油、化工和農藥殘留有機污染的清除。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種對于氯代乙酰胺類除草劑乙草胺具有較好降解效果的降解菌株，以及通過該降解菌生產的菌劑。利用微生物修復的方法，降解環境中的化學農藥殘留，消除土壤中的乙草胺殘留有機污染，實現綠色無公害農產品的生產。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案實現。一種乙草胺除草劑的降解菌，芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO ：12860。
所述的保藏編號為CGMCC NO ：12860的芽孢桿菌ATC-4菌株在降解氯代乙酰胺類除草劑乙草胺中的應用。
所述的保藏編號為CGMCC NO：12860的芽孢桿菌ATC-4菌株在修復土壤或水體環境中乙草胺污染的應用。
一種用乙草胺除草劑的降解菌生產的菌劑，其活性成分為芽孢桿菌ATC-4，通過試管斜面種-搖瓶種-種子罐-生產罐-產品的生產工藝流程，所產生的產品包裝劑型為液體菌劑，其生產的具體步驟為：
1）斜面種制備：將芽孢桿菌ATC-4原種在LB固體培養基上活化，驗證其降解性能后接種于LB固體試管斜面上備用；
2）搖瓶種制備：將斜面種接種于盛有肉湯培養基的搖瓶中，經30℃恒溫振蕩培養至對數生長期，準備接種于種子罐；
3）種子罐培養：在500 L種子罐中加入400 L發酵培養基，將發酵培養基經115℃-121℃高壓濕熱滅菌，待罐體冷卻至35℃以下后，將培養好的上述搖瓶種按10%的體積比接種量接種入種子罐，培養至對數生長期；
4）生產罐培養：在生產罐中加入發酵培養基，并經115℃-121℃高壓濕熱滅菌，待生產罐罐體冷卻至35℃以下后通入無菌空氣，使罐體保持無菌狀態，將培養至對數期的種子液按10%的體積比接種量接入生產罐進行培養；
5）在所述步驟3）種子罐培養和所述步驟4）生產罐培養的過程中，無菌空氣的通氣量體積比為1:0.6-1.2，攪拌速度為180-240 rpm，培養溫度為30℃，全流程培養時間為84-96小時；
6）菌劑產品：生產罐發酵結束后ATC-4菌體數量達到10億個/mL以上，發酵完成后培養液出罐，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，完成發酵菌劑生產。
所述LB固體培養基的成分為：酵母膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH值為7.0，且添加2%的瓊脂粉。
所述肉湯培養基的成分為：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH值為7.0-7.2。
所述發酵培養基，其成分為：葡萄糖0.8%，(NH4)2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO40.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，其余成分為水，pH值為7.0-7.3。
所述保藏編號為CGMCC NO ：12860的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4微生物菌劑在降解氯代乙酰胺類除草劑乙草胺中的應用。
所述保藏編號為CGMCC NO ：12860的芽孢桿菌ATC-4微生物菌劑在修復土壤或水體環境中乙草胺污染中的應用。
一種高效降解除草劑乙草胺的細菌菌株ATC-4，該菌株革蘭氏染色呈陽性，經鑒定屬于芽孢桿菌（Bacillus.sp），已于2016年8月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO：12860。本發明的ATC-4菌體為桿狀，在LB 固體培養基平板上生長2天后，菌落呈淡黃色，圓形，不透明，較干燥，邊緣不規則。菌株對接觸酶和氧化酶陽性，可以水解淀粉和明膠，VP實驗、硝酸鹽還原實驗、檸檬酸鹽實驗呈陽性，吲哚實驗陰性。
本發明提供的降解乙草胺的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4（CGMCC NO：12860），該菌株制備的菌劑可在短時間內，使基礎鹽培養基中的乙草胺降解85%以上，使土壤中乙草胺的殘留量降低80％以上，具有廣泛的應用潛力和價值。使用該發明生產的乙草胺殘留降解菌劑可以利用通用發酵設備進行生產，具有生產使用成本較低、使用方便、去除乙草胺效果優良等特點，適合在全國糧油蔬菜生產出口基地或有綠色食品商標標志的地區大面積推廣使用，治理土壤和水體環境中乙草胺殘留造成的污染。本發明對于保護生態環境，降低除草劑對農作物藥害，保護人民的身體健康，提高農產品的附加值具有重要的意義。
具體實施方式
以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
本發明生物材料保藏信息：
本發明的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4是本發明的發明人從安徽長期生產乙草胺的農藥廠污泥中篩選獲得的純培養物，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，（CGMCC NO：12860），地址為中國北京，中科院微生物所，保藏編號為CGMCC NO ：12860，保藏日期為2016年8月18日。
實施例1：乙草胺降解菌株的分離和鑒定：
用來富集乙草胺降解菌株的富集基質取自安徽富田農化有限公司農藥廢水生化處理池的活性污泥，取活性污泥5.0 g 加入100ml 基礎鹽培養基中（NaCl 1.0 g/L，NH4NO3 1.0 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH7.0，121℃滅菌25 min，固體培養基加2%瓊脂。），加入100 mg/L 的乙草胺，30℃，180 rpm 培養7天，以5%的接種量轉接到相同的培養基中，連續轉接3次，梯度稀釋富集液，取10-5-10-7 稀釋度的富集液各0.1 mL涂布于加有100 mg/L乙草胺的固體培養基平板上，30℃培養4天后，挑取長出的單菌落接種于含100 mg/L乙草胺的培養基中，30℃，180 rpm 搖床培養7天，驗證其降解效果。
降解效果的驗證方法：在培養液中加入等體積的二氯甲烷進行全量提取，劇烈振蕩后靜置10 min，待樣品分層后，用尖嘴吸管吸棄上清液，底部有機相過無水硫酸鈉柱，取1.0 mL置于微量離心管中，室溫下氮氣吹干；加入1 mL色譜純甲醇溶解，經孔徑0.22 μm濾器過濾后，采用高效液相色譜（HPLC）測定提取液中乙草胺的含量，液相色譜條件：流動相為甲醇：水(80 ：20，V/V)，Zorbax C218 ODSSpherex 反相柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent，USA)，柱溫為室溫，紫外檢測器，測定波長230 nm，進樣量20 μL，流速為1 mL/min。外標法按峰面積定量。
從富集液中，分離到1 株乙草胺降解菌，命名為ATC-4。菌株ATC-4在固體培養基上生長3天后，菌落呈淡黃色，圓形，不透明，較干燥，邊緣不規則。G+，菌體為短桿狀，大小為0.5-1.0×1.0-1.5 μm。好氧生長，對接觸酶和氧化酶陽性，可以水解淀粉和明膠，VP實驗、硝酸鹽還原實驗、檸檬酸鹽實驗呈陽性，吲哚實驗陰性。菌株ATC-4 的形態和生理生化特征和Bergey′ s manual of systematic bacteriology 上對芽孢桿菌菌屬的描述一致。
以菌株ATC-4的基因組DNA 為模板，用細菌16S rRNA 基因序列通用引物進行PCR擴增，得到長度為1419 bp 的16S rRNA 基因序列（Genbank 登錄號為KX524426.1）。在RDP 數據庫(https://rdp.cme.msu.edu/)中進行Blast，結果表明菌株ATC-4與芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株的同源性最近，結合生理生化特征將該菌鑒定為芽孢桿菌屬。將該菌株送交位于中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC）保藏，保藏編號為CGMCC NO ：12860，保藏日期為2016年8月18日。
降解菌劑的發酵制備：
將本發明的乙草胺降解菌ATC-4原種在LB固體培養基（成分如下：酵母膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0，固體培養基添加2%的瓊脂粉）平板上活化，驗證其降解性能后接種于LB 固體試管斜面上備用。將斜面種接種于含200 mL肉湯培養基（成分如下：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0-7.2）的1 L搖瓶中，30℃恒溫振蕩培養至對數生長期，準備接種于種子罐。在500 L種子罐中加入400 L發酵培養基，其成分如下：葡萄糖0.8%，(NH4)2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，其余成分為水，pH值7.0-7.3。將培養基121℃高壓濕熱滅菌，待罐體冷卻至35℃以下后，將上述培養好的搖瓶種按10%（體積比）的接種量接種入種子罐，培養至對數生長期，攪拌速度為220 rpm，無菌空氣通入量為1:0.8。在生產罐（5噸）中加入4.5噸發酵培養基，培養基成分與種子罐中的培養基一樣，投料后的生產罐121℃高壓濕熱滅菌，待罐體冷卻至至35℃以下后通入無菌空氣，使罐體保持無菌狀態備用。將培養至對數期的種子液按10%的接種量接入生產罐進行培養，培養溫度控制在30℃，生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.6-1.2（體積比），攪拌速度為240 rpm，全流程培養時間為84-96小時，發酵結束后ATC-4菌體數量達到10億個/mL以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。
本發明的應用案例1：
培養基中ATC-4對氯代乙酰胺類除草劑生物降解實驗：
在基礎鹽培養基（同實施例1）中加入終濃度為100 mg/L 的乙草胺，3％的接種量接入ATC-4菌液，設接種滅活的ATC-4對照，30℃恒溫培養箱中培養。定時取樣檢測菌株對乙草胺的降解情況，結果見表1。菌株ATC-4在3 天內對乙草胺的降解率達到67.8%，7 天內對100 mg/L乙草胺的降解率到85.9％。
表1：菌株ATC-4在培養基中對乙草胺降解效果
本發明的應用案例2：
菌株ATC-4在土壤中對乙草胺的降解試驗：
采供試土壤采自菜園土，為從未使用過乙草胺的表層土壤(0~30 cm)，土壤經過風干過篩(Φ=2 mm)后備用。土壤基本理化性質如下：土壤為紅壤，pH 6.5，有機質13.23 g/kg，全氮0.85 g/kg，速效氮72.71 mg/kg，速效磷12.54 mg/kg，速效鉀126.53 mg/kg。取一定量的乙草胺乳油溶于100 mL 甲醇中，然后將其均勻拌入500 g 土壤中，使土壤中乙草胺的終濃度均為100 mg/kg。新鮮的ATC-4培養液10000 rpm 離心5min 后，收集菌體，用無菌去離子水洗滌3 次后再用無菌水重懸，調節菌體濃度約為1.0×109 cfu/mL，以10%的接種量接入到上述土壤中。于30℃恒溫培養箱中培養，不接菌的作為對照，期間土壤的持水量保持在60%。每隔7天，利用液相色譜測定土壤中乙草胺殘留量。測定結果如表2。
表2：菌株ATC-4 在土壤中對乙草胺的降解情況
從表2 可以得出，菌株ATC-4在7天內對乙草胺的降解率達到55.8％，28天內對乙草胺和的降解率達到87.9％。
序列表：
<110> 江西省農業科學院農業應用微生物研究所
<120> 一種乙草胺除草劑的降解菌及其菌劑的生產和應用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120
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