一株解淀粉芽孢桿菌及其在抑制葡萄霜霉病菌中的應用的制作方法

本發明屬于微生物應用技術領域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其在抑制葡萄霜霉病菌中的應用。

背景技術：

葡萄霜霉病是一種真菌病害。葡萄霜霉病的普遍發生造成了果實的大量減產，嚴重影響了果實的食用價值和市場價值，導致了果農的經濟收入降低，嚴重制約了我國葡萄產業的發展。無論在發達國家，還是在發展中國家，由于缺少必要的有效防控藥劑，葡萄霜霉病引起的損失量占總量的20％以上。葡萄霜霉病的發生已給現代葡萄生產尤其是高端葡萄產品生產與加工造成了嚴重影響。

葡萄霜霉病主要危害葉片，也能侵染新梢幼果等幼嫩組織。葉片發生葡萄霜霉病后，初生淡黃色水漬狀邊緣不清晰的小斑點，以后逐漸擴大為褐色不規則形或多角形病斑，數斑相連變成不規則形大斑；天氣潮濕時，于病斑背面產生白色霜霉狀物(即病菌的孢囊梗和孢子囊)；發病嚴重時病葉早枯早落。嫩梢發生葡萄霜霉病后，形成水漬狀斑點，而后變為褐色略凹陷的病斑，潮濕時病斑也產生白色霜霉；病重時新梢扭曲，生長停止，甚至枯死。卷須、穗軸、葉柄有時也能發生葡萄霜霉病，其癥狀與嫩梢相似。幼果發生葡萄霜霉病后，病部褪色，變硬下陷，上生白色霜霉，很易萎縮脫落；果粒半大時受害，病部褐色至暗色，軟腐早落；果實著色后不再侵染。

葡萄霜霉病的病原菌為葡萄霜霉菌，屬鞭毛菌亞門、卵菌綱霜霉目、單軸霉屬。葡萄霜霉病菌以卵孢子在病組織中越冬，或隨病葉殘留于土壤中越冬。次年在適宜條件下卵孢子萌發產生芽孢囊，再由芽孢囊產生游動孢子，借風雨傳播，自葉背氣孔侵入，進行初次侵染。經過7-12天的潛育期，在病部產生孢囊梗及孢子囊，孢子萌發產生游動孢子進行再次侵染。孢子囊萌發適宜溫度為10℃～15℃。游動孢子萌發的適宜溫度為18℃-24℃。秋季低溫，多雨多露，易引起病害流行。果園地勢低洼、架面通風不良樹勢衰弱，有利于病害發生。

2014年我國葡萄栽培面積已經超過80萬公頃，超過法國，僅次于西班牙，是世界上葡萄有效種植面積第二大國，而且葡萄種植面積還在逐步增加。目前，葡萄霜霉病的普遍發生已成為制約我國葡萄產業發展的一個重要因素。目前生產中對葡萄霜霉病的防治仍然以化防為主，但由此帶來的“3R”負面影響非常嚴重。化學農藥的大量使用嚴重破壞了生態環境，導致葡萄果實中大量的農藥殘留，影響人們身體健康。在我國葡萄產區，在葡萄的采摘之前，對葡萄霜霉病的防治手段同樣也是以化學農藥為主，這不僅影響人民的身體健康，也限制了葡萄產品的加工與出口。我國已將發展生物農藥和綠色食品列入了《中國21世紀議程》，北京現代農業科技城的建設要求北京市及周邊地區作物病害實現綠色防控、農業產品實行綠色生產。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一株解淀粉芽孢桿菌及其在抑制葡萄霜霉病菌中的應用。

本發明提供的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB，已于2013年09月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC NO.8179。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB CGMCC NO.8179，簡稱解淀粉芽孢桿菌KB。

解淀粉芽孢桿菌KB的培養物也屬于本發明的保護范圍。所述培養物的制備方法如下：將解淀粉芽孢桿菌KB接種至LB液體培養基，進行培養，得到培養物。所述培養物的制備方法具體如下：將解淀粉芽孢桿菌KB接種至LB液體培養基并使其在培養體系中的初始濃度為10⁵cfu/毫升，進行培養，得到培養物。所述培養的條件具體可為28-30℃、180-220rpm振蕩培養48小時。所述培養物具體可為結束培養后的整個體系。

解淀粉芽孢桿菌KB的發酵物也屬于本發明的保護范圍。

本發明還保護解淀粉芽孢桿菌KB或所述培養物或所述發酵物在抑制葡萄霜霉病菌中的應用。

本發明還保護解淀粉芽孢桿菌KB或所述培養物或所述發酵物在防治葡萄霜霉病中的應用。

本發明還保護解淀粉芽孢桿菌KB或所述培養物或所述發酵物在防治葡萄霜霉病菌引起的植物病害中的應用。所述植物具體可為葡萄，例如葡萄品種“紅乳”。

本發明還保護一種抑制葡萄霜霉病菌的制劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌KB或所述培養物或所述發酵物。

本發明還保護一種防治葡萄霜霉病的制劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌KB或所述培養物或所述發酵物。

本發明還保護一種防治葡萄霜霉病菌引起的植物病害的制劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌KB或所述培養物或所述發酵物。所述植物具體可為葡萄，例如葡萄品種“紅乳”。

芽孢桿菌(Bacillus spp.)在土壤中普遍存在，是存在于土壤和植物微生態系統中的優勢微生物種群之一，由于產生內生芽孢，具有較強的抵抗外界環境壓力的能力，能夠抵抗所生存的環境中因干燥、熱和紫外輻射所造成的傷害，維持自身生存能力不受影響。這個生物學特征使芽孢桿菌具有非常良好的應用前景，特別是在使用活菌制劑的生物制品中表現出強大的生命力。芽孢桿菌種類繁多，數量巨大，能夠產生多種多樣的生理活性物質和代謝產物，具有廣泛的工業應用前景。

本發明提供了一株對葡萄霜霉病菌具有抑制作用的解淀粉芽孢桿菌，對于葡萄霜霉病的防治具有重大的應用價值。

附圖說明

圖1為解淀粉芽孢桿菌KB革蘭氏染色后的照片。

圖2為解淀粉芽孢桿菌KB在葡萄葉盤上對葡萄霜霉病菌的抑制效果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)：黃曉慶，孔祥久等不同寄主來源的葡萄霜霉病菌致病力測定及孢子囊大小比較；《植物保護》,2015,41(3):178-182。

葡萄品種“紅乳”：侯國杰，紅乳葡萄；《北京農業》，2009，22期。

實施例1、解淀粉芽孢桿菌KB的獲得、鑒定和保藏

一、菌株的獲得

從中國北方有機果園中采集桃子和獼猴桃。從水果上分離菌株，采用常規梯度稀釋涂布分離，分別在LB固體培養基、NA固體培養基、KB固體培養基和CM0002固體培養基上28℃培養，挑取菌落形態差異較大并可純培養的菌落，在LB固體培養基上純化保存，并以葡萄霜霉病菌為靶標病原菌進行拮抗菌的初篩和多次復篩，最終得到一株抑菌活性強的菌株，將其命名為菌株KB。

二、菌株的鑒定

參考《土壤微生物研究原理與方法》(林先貴.土壤微生物研究原理與方法[M]，高等教育出版社，2010)中描述方法進行生理生化和環境耐受性特性的測定。

菌株KB的形態學特征：菌體細胞在400倍光學顯微鏡下菌體細胞呈短桿狀，直或近直，芽孢中生，柱狀或橢圓形，具有運動性；在LB固體培養基上不產色素，菌落為白色不透明，扁平或圓形，無光澤，隨著培養時間增長，菌落變厚變干，邊緣不整齊，菌落上有褶皺，變為乳脂色。

菌株KB的生理生化特征：革蘭氏染色陽性(照片見圖1)，形成菌膜，甲基紅、乙酰甲基甲醇、硝酸鹽還原、吲哚反應、接觸酶陽性、尿酶陽性，可水解明膠、纖維素、淀粉和七葉苷，氧化酶反應、分解酪氨酸陰性，產生硫化氫，利用檸檬酸鹽，不利用丙二酸鹽，精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶反應陽性，苯丙氨酸脫氨酶反應陰性，葡萄糖、蔗糖產酸產氣，可利用葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用阿拉伯糖和山梨糖。

菌株KB的環境耐受性表現：于含有1％-7％(質量含量)氯化鈉的培養基中均可正常生長，于含有10％(質量含量)氯化鈉的培養基中不可生長；于pH4.5-9.0的培養基中均可正常生長，在pH4.0生長勢弱，pH 9.5不可生長；在環境溫度為4℃下生長勢弱，在55℃-80℃下處理15min，仍可正常生長。

菌株KB產嗜鐵素、纖維素酶、蛋白酶和幾丁質酶。

菌株KB的16S rDNA序列如序列表的序列1所示。

綜合上述結果，將菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

三、菌株的保藏

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB，已于2013年09月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC NO.8179。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB CGMCC NO.8179，簡稱解淀粉芽孢桿菌KB。

實施例2、菌株的抑菌活性

1、采集葡萄品種“紅乳”的新鮮葉片，先用自來水沖洗，然后用75％乙醇水溶液消毒30秒，然后用無菌水沖洗，然后用打孔器打孔，獲取直徑1.5cm的葉盤。

2、取步驟1得到的葉盤，放置于鋪有無菌紗布的培養皿中，將培養皿置于無菌操作臺中，吹4-5分鐘。

3、分組處理

試驗組：完成步驟2后，取葉盤，在生防菌菌液中浸泡30-60秒。

生防菌菌液的制備方法：將解淀粉芽孢桿菌KB接種至LB液體培養基(初始菌濃度10⁵cfu/毫升)，28-30℃、180-220rpm振蕩培養48小時，取整個體系，4℃下保存備用。

對照組：完成步驟2后，取葉盤，在無菌水中浸泡30-60秒。

4、完成步驟3后，取葉盤，放置于鋪有無菌紗布的培養皿中(葉盤背面向上)，將培養皿置于無菌操作臺中，吹1-2分鐘。

5、完成步驟4后，取葉盤，每個葉盤在背面接種20μl病原菌菌液(用無菌水懸浮葡萄霜霉病菌的孢子，得到菌濃度為10⁴cfu/ml的病原菌菌液)，放置5-10分鐘，然后置于22℃、80-90％相對濕度、光暗交替(光照12小時/黑暗12小時)的環境中培養10天。觀察葉盤葡萄霜霉病發病情況，根據未發病的葉盤數占總接種葉盤數的多少，計算病害抑制率。

進行五次重復試驗，每次重復試驗中設置五個重復處理，結果取平均值。

培養10天后的照片見圖2。試驗組的病害抑制率為100％。結果表明，解淀粉芽孢桿菌KB對葡萄霜霉病菌具有較好的抑制功能。

序列表

<160> 1

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 1

gtaaagggcg gggtgctata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120

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