一種煙草干旱響應基因NtXERICO及其克隆方法與應用與流程

本發明屬于遺傳工程技術領域，具體涉及一種煙草干旱響應基因NtXERICO及其克隆方法與應用。

背景技術：

干旱嚴重影響作物的生長發育、產量及品質。提高植物的抗旱能力已經成為現代植物研究工作中的關鍵問題之一。抗旱機理的研究是抗旱育種的基礎，也是育種的關鍵因素之一。經歷了幾十年的努力，對植物抗旱的研究已從抗旱指標的表觀因素分析，進入到分子及基因水平的探索。

近年來，隨著全球氣候變暖，干旱已成為我國作物生產中頻繁發生的自然災害。煙草作為中國重要的經濟作物，在整個生育期對水分的要求很高。中國大部分煙區處于干旱、半干旱環境中，而且優質煙區多位于丘陵山區，常因土壤干旱而影響煙株的生長發育，導致煙葉的產量和品質降低，干旱已成為制約我國煙葉產量與品質提高的主要限制因子之一。因此，加強煙草抗旱基因資源的挖掘和利用，對于煙草抗旱新品種培育，實現煙草農業可持續發展具有重大意義。

自20世紀80年代以來，國內外學者在干旱對煙草生長、發育、代謝的影響等方面做了大量研究，取得了一些重要進展。歸納起來主要有以下幾個方面:第一，干旱對煙草生理的影響，主要表現在:(1)干旱脅迫影響了葉綠素的合成，促進了葉綠素的分解，從而影響了葉片的光合效率(Plant Molecular Biology，1979，20:37-44) ； (2)干旱脅迫導致植株氮素代謝關鍵酶-硝酸還原酶(NR) 的活性降低，而蛋白水解酶活性增強引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和纈氨酸等大量積累；(3)干旱脅迫導致葉片膜脂過氧化作用增強，膜透性增加，丙二醛(MDA)含量升高，出現電解質外滲。抗氧化保護酶S0D、P0D、CAT等酶活性顯著下降。第二，干旱對煙草生長發育的影響，主要表現在:(I)干旱脅迫降低了種子的萌發和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生長，從而影響了礦質營養的吸收；(3)干旱脅迫導致植株矮小，節間短，葉片小，易早衰。這些研究較好地闡明了干旱對煙草生長、發育及代謝影響的生理生化基礎，但缺乏對煙草抗旱分子遺傳機理的研究。

近年來，隨著分子生物學和基因組學研究的深入，抗旱基因的發掘成為目前作物抗逆遺傳資源與品種改良研究的熱點，越來越多的抗旱相關基因相繼被克隆和鑒定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相關基因分為兩大類:第一類基因為功能基因，主要在植物抗性中起保護作用。這一類基因主要包括滲透調芐基因如:海藻糖合成酶基因TPSlJf氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因mtlD、甜菜堿合成酶級以內BADH、及多按合成基因Odc等；保護生物大分子的活性基因如:脫水蛋白基因BDN1、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎發生豐富蛋白LEA等。第二類基因為調芐基因，主要在信號傳導和逆境基因表達過程中起調節作用，主要包括一些轉錄因子基因如:DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。這些基因已在植物基因工程中得到應用。

泛素化生物體表觀遺傳修飾的一種重要形式，該過程能夠使生物體內蛋白發生泛素化，泛素化的蛋白能夠被降解。泛素連接酶E3是泛素化過程中的關鍵酶類，決定了那些蛋白能夠被泛素化。泛素化在植物激素調控、花發育和病原菌防衛反應中起著重要的作用(Plant J,2010,61:1029-1040 ；J Exp Bot，2007，58:221-227)。

技術實現要素：

本發明的第一目的在于提供一種煙草干旱響應基因NtXERICO；第二目的在于提供所述的煙草干旱響應基因NtXERICO的克隆方法，第三目的在于提供所述的煙草干旱響應基因NtXERICO的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，所述的煙草干旱響應基因NtXERICO的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明的第二目的是這樣實現的，包括以下步驟：

A、煙草葉片cDNA合成：提取煙草葉片總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；

B、NtXERICO基因的PCR擴增：以煙草葉片cDNA為模板，根據NtXERICO基因序列設計引物，進行PCR擴增，回收和純化PCR擴增產物，并測序。

本發明的第三目的是這樣實現的，所述的煙草干旱響應基因NtXERICO在獲得抗干旱轉基因煙草植株中的應用。

本發明提供了一種新的植物抗旱相關蛋白及其編碼基因。

本發明所提供的植物抗旱相關蛋白，名稱為NtXERICO，其來源于云煙87栽培煙草，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質：

1)序列表中的SEQ ID NO：2；

2)將序列表中SEQ ID No：2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱相關的蛋白質。

序列表中的序列2由154個氨基酸組成。

所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

NtXERICO的編碼基因(NtXERICO)也屬于本發明的保護范圍。

NtXERICO的編碼基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No：2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。

含有本發明NtXERICO的表達載體，細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增NtXERICO中任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。

本發明還提供了利用該基因增強植物抗旱性的方法，是在植物中過量表達上述植物抗旱性相關蛋白編碼基因。

過量表達上述植物抗旱性相關蛋白編碼基因NtXERICO可通過多種方法實現，如植物病毒載體介導基因過表達的方法，農桿菌介導轉化過表達載體，對基因編碼匡進行優化修改，對該基因啟動子進行優化以達到過表達效果等方法實現。本發明過量表達基因的方法并不限于上述幾種方法，只要能過量表達NtXERICO即可。

利用任何基因過表達或者基因修飾方法該NtXERICO使植物表現為抗旱；利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的NtXERICO轉入植物中，植物就表現出干旱不敏感。

本發明的NtXERICO基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：煙草、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以植物苗期葉片失水程度來篩選轉化植株。攜帶有本發明NtXERICO基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株。

本發明的植物抗旱相關蛋白及其編碼基因為農作物尤其是煙草抗旱育種提供基因與技術的支持。

本發明中，干旱處理的煙草幼苗葉片中，所述的泛素E3連接酶編碼基因NtXERICO被誘導表達。本發明所述的蛋白NtXERICO是植物泛素化蛋白降解途徑中的關鍵酶類，所以調控NtXERICO的表達能夠調節植物對干旱的抗性。因此所述的干旱響應的基因NtXERICO在植物抗旱領域具有廣闊的應用前景，其經濟效益潛力巨大。

附圖說明

圖1為本發明煙草葉片中NtXERICO基因響應干旱脅迫柱狀圖；

圖2 NtXERICO的PCR產物電泳圖；

圖3為pdonr-zeo載體圖；

圖4為 NtXERICO基因植物表達載體PB2GW7圖；

圖5 為轉NtXERICO基因的煙草株系表達水平柱狀圖；

圖6為NtXERICO基因過量表達的煙草植株對干旱脅迫處理的生長表型照片。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。

本發明所述的煙草干旱響應基因NtXERICO的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的煙草干旱響應基因NtXERICO編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明所述的煙草干旱響應基因NtXERICO的克隆方法，包括以下步驟：

A、煙草葉片cDNA合成：提取煙草葉片總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；

B、NtXERICO基因的PCR擴增：以煙草葉片cDNA為模板，根據NtXERICO基因序列設計引物，進行PCR擴增，回收和純化PCR擴增產物，并測序。

B步驟中所述的引物為：

正向引物：5’-ATGGGCCTTTCACAGTATCCAAC-3’

反向引物：5’-TCACATAGGACAAGTATCTTC-3’。

B步驟中所述的PCR反應體系和擴增條件如下：

表1 PCR反應體系與條件

B步驟中所述的測序的具體操作為送交invitrogen公司進行測序。

B步驟中所述的回收和純化PCR擴增產物的具體操作如下：

凝膠電泳后，用干凈的刀片將帶有目的片段的膠切割下來，放入到離心管中，膠不要切得過大，以避免回收時DNA片段溶液含有大量的雜質。

向離心管中加入3倍體積的QG溶液（體積/膠質量）后，在50℃條件下溫浴10 min，直到膠完全融化；將離心管中的溶液移到2 ml的吸附柱中，離心1 min，棄去液相；再次向吸附柱中加入0.5 ml的QG溶液，離心1 min，棄去液相；向吸附柱加入0.75 ml的PE溶液，離心1 min，棄去液相；再次離心1 min后，將吸附柱放置在一個新的離心管上，加入50 μl的溶解液，靜置1 min，最后離心1 min，得到的液相即為回收的DNA溶液。

本發明所述的煙草干旱響應基因NtXERICO的應用，其特征在于所述的煙草干旱響應基因NtXERICO在獲得抗干旱轉基因煙草植株中的應用。

所述獲得抗干旱轉基因煙草植株的方法包括以下步驟：

A、構建載體：

根據煙草基因組中篩選出的NtXERICO基因序列設計引物，并根據Gateway系統中的BP反應要求，在正向引物前加上5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3’序列，在反向引物前加5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC3’序列。PCR反應均采用Phusion高保真聚合酶進行PCR克隆。通過BP反應將這些片段克隆到pDONR-Zeocin載體中，然后通過LR反應將這些片段分別克隆到各自目的載體中。

采用Gateway?技術構建載體，其原理可簡述如下：

attB1-gene-attB2 × attP1-ccdB-attP2 ? attL1-gene-attL2 × attR1-ccdB-attR2(expression clone) ( pDONR?) (entry clone) (destination vector)

BP反應

（1）在200 μl離心管中準備8 μl的反應體系，包括：1 ~ 7 μl的attB-PCR產物（約15 ~ 150 ng，濃度≥10 ng/μl）、1 μl的pDONR載體（150 ng/μl）和適量的TE緩沖液（pH8.0），在室溫下混勻；

（2）將BP Clonase? II酶混合物在冰上靜置2 min融化，輕輕震蕩2次，混勻待用；

（3）向（1）準備的樣品中加入2 μl的BP Clonase? II酶混合物，輕輕地將體系混勻；

（4）將BP Clonase? II酶混合物放回到-20°C或者-80°C保存；

（5）將反應體系放在25°C溫浴1 h；

（6）向反應體系中加入1 μl的蛋白酶K溶液，輕輕震蕩，然后將樣品放在37°C溫浴10 min，以便終止BP反應；

（7）將混合液轉化大腸桿菌后，取轉化菌液涂在含Zeacin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相應抗生素培養基溶液中搖菌培養，確認后提取陽性克隆的質粒備用。

LR反應

（1）在200 μl離心管中準備8 μl的反應物，包括：1 ~ 7 μl的2.2.10.1獲得的pDONR-Zeocin質粒（50 ~ 150 ng）、1 μl的目的載體（150 ng/μl）和適量的TE緩沖液（pH8.0），在室溫下混勻；

（2）將LR Clonase? II酶混合物靜置在冰上2 min融化，輕輕震蕩2次以混勻；

（3）加入2 μl 的LR Clonase? II酶混合物，輕輕震蕩將體系混勻；

（4）將LR Clonase? II酶混合物放回到-20°C 或者-80°C冰箱保存；

（5）將反應體系放在 25°C溫浴反應1 h；

（6）向反應體系中加入1 μl的蛋白酶K溶液以終止LR反應，輕輕震蕩后，將樣品放在37°C 靜置10 min；

（7）將LR反應產物轉化大腸桿菌后涂板、篩選陽性克隆、提取質粒，然后進行酵母雙雜和農桿菌轉化等實驗。

B、農桿菌轉化：

將1 μg（200 ng/μl）目的質粒加入到100 μl感受態農桿菌中，混勻后在冰上靜置5 min，放入液氮中冷凍5 min，然后從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中水浴5 min，再在冰上靜置5 min后，加入500 μl LB溶液，在28℃、充分震蕩條件下恢復培養4 h，最后將菌液均勻涂抹于選擇性平板培養基上，28℃下培養48 h。

C、培養轉基因植株：

(1) 無菌條件下，將煙草種子放入EP管中用無菌水沖洗2-3次；

(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3) 再用0.1%的升汞處理5min，最后用無菌水沖洗5次；

(4) 播種于MS培養基上，培養在云南煙草農業科學研究院組織培養室中，暗培養4天。25℃光照培養20-30天。

(5) 待煙草苗長至3-5cm時（20-30天），取頂芽放于MS+BA0.2 mg/L（壯芽，使其快速成長）培養基上，繼代培養。

(6) 繼代培養14天后（有小葉片即可），取葉片，大小1cmX1cm，切去葉柄，葉片表面及葉邊緣劃傷，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的預培養培養基上，正面朝下緊貼培養基放置，于黑暗條件下預培養2-3天。

(7) 然后取出預培養的葉片或莖段，放入侵染液中進行侵染。侵染前一天晚上，搖菌農桿菌2瓶。將2ml離心管裝滿菌液，4000rpm離心5min，用懸菌液清洗兩次。以1:10比例（10ml懸菌液放1管1.5ml菌體）放入懸菌液，加入As25mg/L（40ml中加40ulAs）不斷搖晃侵染液，使其與葉片及莖段切口處充分接觸，10min后，取出，放于滅過菌的干燥濾紙上吸干菌液；

(8) 將葉片及莖段放回到預培養基上，28℃黑暗條件下共培養2-3天，至葉片切口周圍有微菌斑形成；

(9) 洗菌，取出共培養的煙草葉片及莖段，用添加500mg/LCef的無菌水沖洗5次，第一次放置于搖床搖30min，后面每次5min，以洗去外植體表面的農桿菌；

(10) 取出后，用濾紙吸干，轉移到煙草誘芽培養基上，誘芽培養基為MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；過2周觀察，如果發現不長菌，則降低Cef濃度。如果長菌，則繼續保持Cef濃度。

(11) 每兩周更換一次培養基，直至長出不定芽（一般情況為2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），轉入繼代培養基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8；

(12) 至小苗長至2cm長時（有小芽即可），轉接入生根培養基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培養三周左右即可長出粗壯根系。

(13) 對生根的植株進行PCR初步檢測，將結果呈陽性的植株經過煉苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基質中，放入人工氣候室進行培養，并對其生長情況進行觀察、記錄。

農桿菌侵染液的制備

(1) 取-80℃冰箱保存的含有表達載體的農桿菌，劃平板培養，LB固體平板中加入50mg/L Kan和50mg/L Rif；

(2) 挑取單菌斑到含50mg/L Kan和50mg/L Rif的5mL LB液體培養基中，放入搖床中28℃、200rpm培養過夜（12h-16h）；

(3) 保存菌種，750ul菌液加入滅過菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存備用。

(4) 搖菌，LB液體培養基10ml加Kan（所需濃度50mg/L）10ul、Rif（所需濃度50mg/L）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm過夜培養（12h-16h）。

(5) 當菌液濃度達到OD600=1.5左右時，取2mL菌液加入到離心管中，4000rpm離心5min；

(6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液體培養基，重懸農桿菌，4000rpm離心5min。

(7) 重復步驟（6）一次；

(8) 用1mL的MS液體培養基重懸菌后，再加入到40mL的MS的液體培養基中（含40ul 25mg/L的As），即為侵染液。放置2h以上，再侵染。

200ml懸菌液

20x大量 10ml

200x有機 1ml

200x鐵鹽 1ml

200x微量 1ml

蔗糖5.6g

下面以具體實施案例對本發明做進一步說明：

實施例1

云煙87種子經24℃水培萌發后，在溫度為24-26°C、濕度為60%、光暗交替周期為12h/12h的光照培養室中培養。待幼苗長至四葉一心(約14天)時，整株取出，吸干水分，空氣干燥干旱迫處理實驗。處理的時間分別為0.5小時、2小時；以未做脅迫處理的煙草幼苗作為對照組，采取對照及處理的煙草葉片材料進行高通量RNA-seq。共計有1386個基因表達上調2倍（含2倍）以上，其中NtXERICO作為泛素化E3連接酶上調顯著，表明該基因被干旱誘導（圖1）。

實施例2

1.煙草葉片cDNA合成

采用TRIZOL(Invitrogen，USA)試劑提取煙草葉片總RNA，將煙草葉片總RNA定量1μ g于1.5ml離心管中，按照invitrogen公司的First Strand cDNA Synthesis Kit產品說明進行反轉錄,最終獲得煙草葉片 cDNA。

2. NtXERICO基因的 PCR 擴增

以煙草葉片cDNA為模板，根據煙草基因組數據庫信息設計引物，進行NtXERICO基因的PCR擴增，得到PCR擴增產物。

引物為：

正向引物：5’-ATGGGCCTTTCACAGTATCCAAC-3’

反向引物：5’-TCACATAGGACAAGTATCTTC-3’。

將擴增獲得的PCR產物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結果為(如圖2所示)，獲得462bp大小的片段。

電泳結束后，采用Qiagen公司PCR產物純化試劑盒，按照產品說明回收純化所述的PCR產物，并送invitrogen測序，驗證序列結果，結果表明該序列與基因組數據庫中數據完全相同。

實施例3

1.植物表達載體的構建

以實施例2中NtXERICO全長片段為模板，用含有gateway接頭序列的引物進行PCR擴增，擴增產物經PCR產物純化后，經過BP反應插入到invitrogen公司pdonr-zeo載體中。將構建好的BP反應載體通過LR反應將NtXERICO片段置換到PB2GW7載體中。

gateway反應引物序列如下：

NtXERICO_F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGGCCTTTCACAGTATCCAAC-3’

NtXERICO_R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACATAGGACAAGTATCTTC-3’。

2.農桿菌介導的煙草轉化及轉基因植株的鑒定

將經過PCR反應及測序，鑒定正確的重組質粒利用凍融法轉化農桿菌LBA4404，通過菌落PCR確定陽性農桿菌菌株，利用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草品種云煙87。

具體方法如下:

(1) 無菌條件下，將煙草種子放入EP管中用無菌水沖洗2-3次；

(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3) 再用0.1%的升汞處理5min，最后用無菌水沖洗5次；

(4) 播種于MS培養基上，培養在云南煙草農業科學研究院組織培養室中，暗培養4天。25℃光照培養20-30天。

(5 ) 待煙草苗長至3-5cm時（20-30天），取頂芽放于MS+BA0.2 mg/L（壯芽，使其快速成長）培養基上，繼代培養。

(6) 繼代培養14天后（有小葉片即可），取葉片，大小1cmX1cm，切去葉柄，葉片表面及葉邊緣劃傷，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的預培養培養基上，正面朝下緊貼培養基放置，于黑暗條件下預培養2-3天。

(7) 然后取出預培養的葉片或莖段，放入侵染液中進行侵染。侵染前一天晚上，搖菌農桿菌2瓶。將2ml離心管裝滿菌液，4000rpm離心5min，用懸菌液清洗兩次。以1:10比例（10ml懸菌液放1管1.5ml菌體）放入懸菌液，加入As25mg/L（40ml中加40ulAs）不斷搖晃侵染液，使其與葉片及莖段切口處充分接觸，10min后，取出，放于滅過菌的干燥濾紙上吸干菌液；

(8) 將葉片及莖段放回到預培養基上，28℃黑暗條件下共培養2-3天，至葉片切口周圍有微菌斑形成；

(9) 洗菌，取出共培養的煙草葉片及莖段，用添加500mg/LCef的無菌水沖洗5次，第一次放置于搖床搖30min，后面每次5min，以洗去外植體表面的農桿菌；

(10) 取出后，用濾紙吸干，轉移到煙草誘芽培養基上，誘芽培養基為MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；過2周觀察，如果發現不長菌，則降低Cef濃度。如果長菌，則繼續保持Cef濃度。

(11) 每兩周更換一次培養基，直至長出不定芽（一般情況為2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），轉入繼代培養基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8；

(12) 至小苗長至2cm長時（有小芽即可），轉接入生根培養基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培養三周左右即可長出粗壯根系。

(13)待根生長至2-3cm。苗高7-10cm左右時，移出三角瓶洗去根部培養基，移栽于花盆中，溫室培養。

采用Qiagen公司DNA提取試劑盒，提取轉基因煙草幼苗的基因組DNA，設計Basta抗性基因引物進行PCR擴增，篩選陽性植株,檢測到25株陽性植株。

按照實例2中所述方法提取野生型植株和25株轉NtXERICO基因T0代植株的總RNA,進行Real time-PCR分析，內參基因為26s，分析不同株系的表達情況。選取表達量最高的三株植株（圖3）。單株收取種子分別播種，用basta抗生素篩選Tl代植株的分離情況，如此重復直至T3代獲得遺傳穩定的轉基因株系。

NtXERICO qRT引物

NtXERICO_qRT_F：5’-AGTCATACCCCTGCAATTCG-3’

NtXERICO_qRT_R：5’-GGCCACATGAGAGATGGTTT-3’

26s內參基因引物

26s_F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’

26s_R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’

實施例4

將野生型煙草云煙87植株和3個轉基因系(0E-1、0E_2及OE_3)轉基因煙草種子均勻播于含營養土的小盆中，置于光照培養室中培養。待幼苗長至5-6片葉時(30天)，停止澆水1周，觀察植株生長情況，并記錄相關數據。2.、煙草植株經干旱處理1周后，NtXERICO轉基因煙草生長狀況明顯優于野生型煙草植株，轉基因植株葉片萎焉，野生型植株萎蔫情況更為明顯，大部分葉片萎焉 (圖5)。表明NtXERICO過表達的轉基因煙草對干旱脅迫表現出較好的抗性。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省煙草農業科學研究院

<120> 一種煙草干旱響應基因NtXERICO及其克隆方法與應用

<130> 2016

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 462

<212> DNA

<213> NtXERICO核苷酸

<400> 1

atgggccttt cacagtatcc aactccagca gatgcaggag tgctctgtgt gattctaatg 60

aacacagcca tatccatctc cgttctcaag gagatagtcc gatcaatcct tcacgtgatt 120

ggcatccgca ttgcagcatg ggacgactat tctatcgaag gaggaccctt ggatctgttt 180

gaatgtcgtg gaaccccatc agaatcatat atggaggaat tcagaagtca tacccctgca 240

attcgttatg actcaatctg tatctctaac catgctgaga aagagtgctc ggtctgccta 300

acggattttg agcctgatgc agaaataaac catctctcat gtggccatgt tttccacaag 360

caatgtctag agaaatggct caagtattgg aacgtaactt gtccgctttg caggaattac 420

atgatgcctc aagaaggcga agaagatact tgtcctatgt ga 462

<210> 2

<211> 153

<212> PRT

<213> NtXERICO氨基酸

<400> 2

Met Gly Leu Ser Gln Tyr Pro Thr Pro Ala Asp Ala Gly Val Leu Cys

1 5 10 15

Val Ile Leu Met Asn Thr Ala Ile Ser Ile Ser Val Leu Lys Glu Ile

20 25 30

Val Arg Ser Ile Leu His Val Ile Gly Ile Arg Ile Ala Ala Trp Asp

35 40 45

Asp Tyr Ser Ile Glu Gly Gly Pro Leu Asp Leu Phe Glu Cys Arg Gly

50 55 60

Thr Pro Ser Glu Ser Tyr Met Glu Glu Phe Arg Ser His Thr Pro Ala

65 70 75 80

Ile Arg Tyr Asp Ser Ile Cys Ile Ser Asn His Ala Glu Lys Glu Cys

85 90 95

Ser Val Cys Leu Thr Asp Phe Glu Pro Asp Ala Glu Ile Asn His Leu

100 105 110

Ser Cys Gly His Val Phe His Lys Gln Cys Leu Glu Lys Trp Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Asn Val Thr Cys Pro Leu Cys Arg Asn Tyr Met Met Pro Gln

130 135 140

Glu Gly Glu Glu Asp Thr Cys Pro Met

145 150

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

atgggccttt cacagtatcc aac 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

tcacatagga caagtatctt c 21

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 正向引物前序列

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 反向引物前序列

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc 30

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> NtXERICO_F

<400> 7

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg catgggcctt tcacagtatc caac 54

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> NtXERICO_R

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcacatagga caagtatctt c 51

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> NtXERICO_qRT_F

<400> 9

agtcataccc ctgcaattcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> NtXERICO_qRT_R

<400> 10

ggccacatga gagatggttt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_F

<400> 11

gaagaaggtc ccaagggttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_R

<400> 12

tctcccttta acaccaacgg 20