一種對男性個體進行快速Y?STR分型的方法和系統與流程

本發明涉及一種親權鑒定的方法和系統，尤其涉及一種對男性個體進行快速Y-STR分型的方法和系統。
背景技術：
：自1985年英國Jeffreys首次將DNA指紋圖應用于一起移民案件的親權鑒定以來，經過近三十年的發展，DNA分型技術不僅應用于常規案件中的生物物證檢驗，還應用于一些疑難和緊急案件的處理，例如在法定拘留或監控時間內查找證據或是危及生命的國際安全問題。然而，常規的檢測方法需經過DNA提取和PCR擴增之后才能進行DNA分析，這一過程需要8～9個小時，其中PCR擴增需3-4個小時，是檢驗過程中最耗時的步驟，為縮短反應時間提高檢驗效率，由此提出了快速PCR技術。目前，快速PCR的研究主要集中在DNA聚合酶的改進、添加劑的研發及熱循環儀的革新等三個方面。在PCR反應中，提高DNA聚合酶的延伸活性和速率將會顯著縮短擴增時間。目前，商品化的快速聚合酶有Takara公司的SpeedSTARTMHS、Fermentas公司的PyroStartFastPCRMasterMix、Kappa公司的KAPA2GFastPCRKits等，不同聚合酶的保真度、特異性等都有差別。Vallone等嘗試將PyroStart和SpeedSTAR兩種熱啟動酶混合，于36分鐘內完成了對1ng模板DNA的16重STR復合擴增。Verheij等利用高效的PhusionFlash聚合酶在PIKO快速熱循環儀上，對多種實驗樣本(血斑、唾液斑、精斑、毛囊)DNA進行STR擴增。PCR反應每個循環中變性、退火、延伸時升降溫所需時間直接影響PCR擴增時間，減少各階段時間及循環數均可以縮短擴增時間。此外，采用熱性能良好且熱利用率高、升降溫速率快的高速高效PCR儀也可實現快速PCR的目的。例如，美國Streck公司的PhilisaThermalCycler、德國耶拿公司的SpeedCycler2等。然而，快速PCR在縮短時間的同時也會帶來一些諸如影子帶增多、非特異性擴增、基因座之間平衡性被破壞、或等位基因丟失等問題，從而對DNA分型結果的解釋造成困難。如何構建一個新的檢測體系，在實現對男性個體進行快速的Y染色體STR分型的同時能避免上述問題成為有待解決的課題。技術實現要素：本發明提供了一種對男性個體進行快速Y-STR分型的方法，能快速獲得所述檢材16個Y染色體STR基因座的基因型，從而獲得男性個體Y染色體STR分型結果。本發明還提供一種對男性個體進行快速Y-STR分型的系統，通過該系統可以實現對男性個體針對上述16個基因座的快速、準確分型，從而實現對所述男性個體進行快速父系親屬鑒定、家系排查等。本發明還提供了一種復合檢測體系，所述檢測體系能快速獲得男性個體16個Y染色體STR基因座的基因型，為實現對所述男性個體進行快速父系親屬鑒定、家系排查等提供數據支持。本發明還提供了一種快速檢測試劑盒，包括所述的復合檢測體系。本發明提供的一種對男性個體進行快速Y-STR分型的方法，該方法包括：1)提取所述男性個體的DNA；2)獲得所述DNA16個Y染色體STR基因座的基因型，所述STR基因座為DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；3)根據所述16個STR基因座的基因型獲得所述男性個體Y-STR分型結果；其中2)包括采用與所述16個基因座對應的擴增引物對其進行擴增以獲得擴增產物的步驟，擴增過程中采用的熱循環參數為：①95℃，4min；②28-30個循環，每個循環95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保溫。在本發明的方案中，所述16個Y染色體基因座是申請人通過對中國人群男性個體的生活環境、種族起源等進行綜合分析，考察各地區民族人口的表型特征差異，包括外形特征，生理指標等，針對這些差異進行文獻和網絡數據庫調研，在已有研究的基礎上獲得的能進行Y染色體STR分型的特異性基因座的組合。在本申請的方案中，所述男性個體的Y-STR分型結果指的是能用于對該男性個體進行家系排查、父權親權鑒定等的Y-STR分型結果。進一步的，基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的擴增引物分別對應于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的擴增引物分別對應于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列。在本發明的一個具體實施方式中，擴增過程中采用的擴增體系為：10×緩沖液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，擴增引物組1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，滅菌水補足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每種dNTP的濃度為10mM，所述擴增引物組中各條引物的濃度為50μM。在本發明的另一個具體實施方式中，其中2)還包括在獲得擴增產物后，使用遺傳分析儀分析該擴增產物，以獲得所述16個基因座的基因型的步驟。在本發明的方案中，所述遺傳分析儀可以是本領域技術人員常規使用的遺傳分析儀，例如ABI3130或ABI3500型遺傳分析儀，通過ID-X軟件或其他GeneMapper軟件等分析該PCR擴增產物中所述16個基因座的基因型。本發明一種對男性個體進行快速Y-STR分型的系統，所述系統包括DNA提取體系，復合檢測體系，以及推斷體系；所述DNA提取體系用于提取所述男性個體的DNA；所述復合檢測體系用于獲得所述DNA包括16個Y染色體STR基因座的基因型，所述STR基因座為DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；獲得所述16個基因座的分型結果的過程包括采用與所述16個基因座對應的擴增引物對其進行擴增以獲得擴增產物的步驟，擴增過程中采用的熱循環參數為：①95℃，4min；②28-30個循環，每個循環95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保溫；所述推斷體系用于根據所述16個STR基因座的基因型獲得所述男性個體Y-STR分型結果。進一步的，基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的擴增引物分別對應于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的擴增引物分別對應于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列。在本發明的一個具體實施方式中，擴增過程中采用的擴增體系為：10×緩沖液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，擴增引物組1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，滅菌水補足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每種dNTP的濃度為10mM，所述擴增引物組中各條引物的濃度為50μM。更進一步的，獲得所述16個基因座的分型結果的過程包括中還包括在獲得擴增產物后，使用遺傳分析儀分析該擴增產物，以獲得所述16個基因座的基因型的步驟。本發明提供的一種復合檢測體系，所述體系包括男性個體DNA，擴增引物，以及擴增體系；所述復合檢測體系用于利用所述擴增引物和擴增體系擴增男性個體DNA的16個基因座獲得擴增產物，并由所述擴增產物獲得男性個體的DNA的16個基因座的基因型；所述16個基因座為DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；所述擴增引物由與所述16個基因座對應的擴增引物組成，其中基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的擴增引物分別對應于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的擴增引物分別對應于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列；所述擴增體系為：10×緩沖液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，擴增引物組1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，滅菌水補足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每種dNTP的濃度為10mM，所述擴增引物組中各條引物的濃度為50μM；擴增過程的熱循環參數為：①95℃，4min；②28-30個循環，每個循環95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保溫。在本發明的方案中，所述DNA聚合酶可以是FastStartDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、HotstartDNA聚合酶中的一種或多種。本發明還提供了一種快速檢測試劑盒，包括所述的復合檢測體系。在本發明的方案中，本發明利用所述復合檢測體系進行16個基因座的分型的方法，包括：1)將提取的男性個體DNA作為模板；2)使用所述擴增引物利用上述擴增體系，在所述熱循環參數下對作為模板的男性個體DNA進行多重PCR擴增反應以得到擴增產物；3)將所述擴增產物利用遺傳分析儀進行分析，以獲得16個基因座的分型結果。在本發明的方案中，所述16個基因座信息如表1所示：表1基因座重復序列熒光標記物DYS458GAAA6-FAMDYS390TCTR6-FAMDYS438TTTTC6-FAMDYS392TAT6-FAMDYS393AGATHEXDYS437TCTRHEXDYS385a/bGAAAHEXGATA_H4TAGAHEXDYS391TCTATAMRADYS447TAATATAMRADYS19TAGATAMRADYS448AGAGATTAMRADYS456AGATROXDYS635TSTAROXDYS439AGATROX本發明提供的優選擴增引物序列如下。16個基因座對應的擴增引物如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；表2基因座名稱長度引物序列(5’-3’)序號DYS458PCRU25GGGTGGTGGAGGTTACTGSEQIDNo.1PCRL25CCCAAAGTTCTGGCATTASEQIDNo.2DYS390PCRU25CATTTTGGTACCCCATAATASEQIDNo.3PCRL25CTCAGAAACAAGGAAAGATASEQIDNo.4DYS438PCRU25GTTGAACGGTAAACAGTASEQIDNo.5PCRL25GAAACTCCATTTCAAATASEQIDNo.6DYS392PCRU25AAAGCCAAGAAGGAAAACAASEQIDNo.7PCRL25GAGGGATCATTAAACCTACCAASEQIDNo.8DYS393PCRU22GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATACSEQIDNo.9PCRL25CTCAAGTCCCAAAAATGAGGSEQIDNo.10DYS437PCRU25TGAGTAGCTGGGACTATGSEQIDNo.11PCRL25GATAGATAACCACAGATAAATASEQIDNo.12DYS385a/bPCRU23GGAAGGAAGGAAGGAAGGSEQIDNo.13PCRL25GGAAGGAAGGAAGGAAGGSEQIDNo.14GATA_H4PCRU21GAGACCTAAGCAGAGATGTTGGTTTTCSEQIDNo.15PCRL25CCTCTGATGGTGAAGTAATGGAATTAGASEQIDNo.16DYS391PCRU20CTATTCATTCAATCATACACCCATSEQIDNo.17PCRL25AGGTAGGCAGGCAGATAGGCSEQIDNo.18DYS447PCRU25AGCATGGCTTGGTTTTATSEQIDNo.19PCRL21TCTGCCTTTCTGGACAGASEQIDNo.20DYS19PCRU25CTACTGAGTTTCTGTTATAGTSEQIDNo.21PCRL22ATGGCCATGTAGTGAGGACASEQIDNo.22DYS448PCRU21TGTCAAAGAGCTTCAATGSEQIDNo.23PCRL25TTTCCTCATATTTCTGGCSEQIDNo.24DYS456PCRU22TTGTGGGACCTTGTGATAATSEQIDNo.25PCRL25AGAGGGACAGAACTAATGGASEQIDNo.26DYS635PCRU25AGTGTCTCACTTCAAGCACCAAGCACSEQIDNo.27PCRL25GCAGCAAAATTCACAGTTGGAAAAATGTSEQIDNo.28DYS439PCRU21GGTTTTCTTCTCGAGTTGTTSEQIDNo.29PCRL19CTGGCTTGGAATTCTTTTACSEQIDNo.30本發明方案具有以下的優點：1、本發明提供的方法和系統，能對快速獲得男性個體Y染色體STR分型結果，進而實現對該男性個體的父系親屬鑒定。在本發明方案中優化了獲得男性個體DNA擴增體系，使得可在1小時左右完成PCR擴增，與3小時左右的常規檢測系統相比，顯著縮短了PCR時間，從而使得對男性個體Y染色體STR分型的檢測過程時間大大縮短。2、雖然本發明方法和系統擴增時間由以前的三小時縮短到了1小時左右，但分型結果依然非常準確穩定。3、通過對豬、山羊、狗、大鼠、兔子、魚、大腸桿菌的DNA檢測，證明本發明方法具有良好的種屬特異性。附圖說明圖1顯示了未知男性個體1血樣DNA的STR分型；圖2顯示了未知男性個體2血樣DNA的STR分型；圖3顯示了采用本發明方法和系統得到的標準DNA9948(10ng)的16個基因座的分型圖譜；圖4顯示了本發明系統的靈敏度檢測統計結果；圖5顯示了本發明方法和系統的種屬特異性檢測結果；圖6顯示了采用本發明方法和系統得到的16個基因座的分型圖譜；圖7顯示了采用DNATyperY21試劑盒得到的16個基因座的分型圖譜。具體實施方式以下實施例中使用的男性個體血液樣本100份，收集于公安部物證鑒定中心；豬、山羊、狗、大鼠、兔子、魚、大腸桿菌的DNA各2份，由公安部物證鑒定中心提供。以下實施例中使用的方法如無特別說明均為常規方法，所用試劑耗材和儀器如下表所示：FastStartDNA聚合酶Roche公司dNTP混合物Roche公司PCR緩沖液Roche公司DNA聚合酶(DNApolymerase)Roche公司9700型PCR擴增儀ABI公司3130xl型遺傳分析儀ABI公司QIAampDNABloodMidi試劑盒QIAGEN公司NanoDrop2000cSpectrophotometerThermo公司實施例1、對本發明的對快速獲得男性個體Y染色體STR分型的方法和系統準確性的驗證在本實施例中，使用男性個體血液樣本100份，這些檢材為申請人從公安部物證鑒定中心收集的樣本，已知其個體來源，但在本申請實施例1的實施過程中設定其個體來源未知，采用本申請方法和系統對其Y染色體STR分型，包括：1)利用本發明的系統中的DNA提取體系提取男性個體的DNA，2)利用本發明的系統中的復合檢測體系獲得所述DNA16個Y染色體STR基因座的分型結果,所述STR基因座為DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439，3)根據所述16個STR基因座的基因型獲得所述男性個體Y-STR分型結果。本實施例中，所述復合檢測體系包括檢材DNA，擴增引物，以及擴增體系，所述復合檢測體系用于利用所述擴增引物和擴增體系擴增男性個體的DNA的16個基因座獲得擴增產物，并由所述擴增產物獲得男性個體的DNA的16個基因座的基因型；所述16個基因座為DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；所述擴增引物由與所述16個基因座對應的擴增引物組成，其中基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的擴增引物分別對應于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的擴增引物分別對應于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列；所述擴增體系為：10×緩沖液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，擴增引物組1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，滅菌水補足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每種dNTP的濃度為10mM，所述擴增引物組中各條引物的濃度為50μM；擴增過程的熱循環參數為：①95℃，4min；②28-30個循環，每個循環95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保溫。1、提取待檢測的100樣本的DNA作為模板采用QIAampDNABloodMidi試劑盒(QIAGEN公司，德國)分別提取上述100樣本的DNA，使用NanoDrop2000cSpectrophotometer(Thermo公司，美國)進行定量。提取DNA步驟和定量步驟按照試劑盒說明書進行。2、利用所述復合檢測體系進行16個基因座的分型，包括：將提取的男性個體DNA作為模板；使用所述擴增引物利用上述擴增體系在所述熱循環參數下對提取的DNA模板進行多重PCR擴增反應，以獲得擴增產物；將擴增產物利用遺傳分析儀確定16個基因座的分型結果。具體過程如下：2.1、引物池配置擴增引物池的配置，其中所述擴增引物中為所述16個基因座對應的擴增引物，本實施例中，基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的擴增引物分別對應于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的擴增引物相同，為SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的擴增引物分別對應于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列；本發明提供的各種引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將合成好的引物用1×TE緩沖液稀釋到100μM，將16個基因座的上下游引物按照以下體積和濃度進行混合作為多重PCR引物池(即PrimerMix)。2.2、多重PCR反應本實施例使用9700型PCR擴增儀進行多重PCR反應。(1)配置PCRmix(10μL體系)試劑名稱配置量(μL)10×PrimerMix1μLdNTPMix(10mMeach)0.2μL10×PCR緩沖液1μLMgCl2(25mM)0.72μLFast-StartDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL男性個體DNA模板(1ng/μL)1μL滅菌水補足至10μL(2)擴增程序2.3、PCR產物分型取1μLPCR產物與9.5μL甲酰胺、Typer500內標混勻，95℃3min后立即冰浴5min。對擴增產物采用ABI3130XL型遺傳分析儀通過IDv3.2軟件進行分析，獲得所述16個基因座的基因型，100份DNA樣品中擴增分型代表性結果如圖1和圖2所示，圖1顯示了未知男性個體1血樣DNA的STR分型，圖2顯示了未知男性個體2血樣DNA的STR分型。由圖1-2可以看出，利用本發明提供的方法均可成功獲得男性基因組DNA的準確分型，無位點等位基因丟失現象。2.4、為了驗證分型結果的準確性，從100份DNA樣品中隨機抽取50份DNA樣品，對16個基因座進行測序(北京邁奧德恩生物科技有限公司測序)，采用本實施例的復合檢測體系獲得的所有的分型結果與測序結果均一致，一致性達到100％，此結果證本發明復合檢測體系分型結果的準確。3、根據所述男性個體16個基因座的基因型Y染色體STR分型。由本實施例方法獲得的上述100份檢材的父系親屬鑒定結果，與其已知的個體父系親屬鑒定結果一致，說明本發明方法可以進行男性個體的父系親屬鑒定。實施例2本發明對男性個體Y染色體STR分型的系統與現有Y染色體STR分型試劑盒的比較將實施例1的100份DNA樣品用本申請的系統進行16個基因座的分型，同時采用現有Y染色體STR分型試劑盒DNATyperY21(即常規檢測系統)對上述樣品Y染色體基因座進行分型，如圖6(采用本發明方法和系統得到的16個基因座的分型圖譜)和圖7(采用DNATyperY21試劑盒得到的16個基因座的分型圖譜)所示。將本發明的系統，與現有Y染色體STR分型試劑盒(相比，在相同基因座上獲得的DNA檢測結果一致，檢出率均達100％，結果見表3，各組實驗重復結果按照同一基因座出現該峰2次以上的統計原則進行綜合分析。分型效果分析指標采用“檢出率”(有效分型次數/重復次數)、“等位基因丟失率”(等位基因丟失條帶數/預計等位基因條帶數)。結果表明本發明的系統具有較好的準確性和一致性，可以用于進行男性個體的父系親屬鑒定，并且本發明的系統可在1小時左右完成PCR擴增，與3小時左右的上述常規檢測系統相比，顯著縮短了PCR時間，大大提高了Y染色體STR分型的效率。表3100份血液樣本的DNA檢測結果實施例3本發明方法和系統結果的靈敏性分別取DNA標準品994810ng、5ng、2.5ng、1.25ng、625pg、313pg、157pg、78.5pg、39.3pg和19.7pg，按本發明提供的方法進行擴增并檢測，平行重復3次，結果如圖3-圖4所示，其中圖3顯示了采用本發明方法和系統得到的標準DNA9948(10ng)的16個基因座的分型圖譜，圖4顯示了本發明系統的靈敏度檢測統計結果。由圖4可以看出，本發明方法最佳DNA模板量在157pg～1.25ng之間，在78.5pg或以下的模板量時，雖然仍可得到完整STR分型但一些等位基因峰高低于50RFU；DNA模板量為39.3pg甚至更低可能出現等位基因丟失，無法得到完整的STR基因分型；DNA模板量在2.5ng及以上時，可以獲到完整STR分型但一些等位基因峰高超過6000RFU，導致出現了峰滲透或拔起現象。實施例4本發明方法和系統結果的種屬特異性分別取豬、山羊、狗、大鼠、兔子、魚、大腸桿菌的DNA按實施例1方法進行擴增并分型，平行重復3次。結果如圖5所示，圖5顯示了本發明方法和系統的種屬特異性檢測結果，可以看出，豬、山羊、狗、大鼠、兔子、魚、大腸桿菌的種屬特異性擴增檢測中均未有任何擴增產物出現。因此，本申請的系統和方法具有良好的種屬特異性。序列表<110>公安部物證鑒定中心<120>一種對男性個體進行快速Y-STR分型的方法和系統<130>165986GF<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gggtggtggaggttactg18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cccaaagttctggcatta18<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3cattttggtaccccataata20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ctcagaaacaaggaaagata20<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gttgaacggtaaacagta18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gaaactccatttcaaata18<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7aaagccaagaaggaaaacaa20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8gagggatcattaaacctaccaa22<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gtggtcttctacttgtgtcaatac24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10ctcaagtcccaaaaatgagg20<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11tgagtagctgggactatg18<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gatagataaccacagataaata22<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ggaaggaaggaaggaagg18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14ggaaggaaggaaggaagg18<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15gagacctaagcagagatgttggttttc27<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16cctctgatggtgaagtaatggaattaga28<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17ctattcattcaatcatacacccat24<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18aggtaggcaggcagataggc20<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19agcatggcttggttttat18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20tctgcctttctggacaga18<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21ctactgagtttctgttatagt21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22atggccatgtagtgaggaca20<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23tgtcaaagagcttcaatg18<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24tttcctcatatttctggc18<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25ttgtgggaccttgtgataat20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26agagggacagaactaatgga20<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27agtgtctcacttcaagcaccaagcac26<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28gcagcaaaattcacagttggaaaaatgt28<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29ggttttcttctcgagttgtt20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30ctggcttggaattcttttac20當前第1頁1 2 3