本發明屬于煙草制品生物學效應評價技術領域，特別涉及一種檢測煙氣總粒相物對細胞超氧化物歧化酶影響方法。
背景技術：
隨著人們對健康的關注越來越高，對煙草產品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要盡可能的減少人體的不良感受。卷煙產品研發人員在煙油產品配方設計初期將不同組份按照不同比例組合調配，形成具有不同風格的初選配方，再結合化學評價和感官評價對配方進行不斷篩選調整形成最終的產品配方。然而初選配方數量眾多，全部進行感官評價耗時耗力，且感官評價側重于對產品的風格口感進行篩選，如何利用生物學測試指標對產品初選配方進篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方，目前尚屬探索階段，無統一的標準方法。
機體在遭受各種不利刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)超氧化物歧化酶(SOD)是體內重要的自由基-超氧自由基(O2·-)的天然清除劑，是免除自由基損傷的主要防御酶。對其進行測定，可用于產品初選配方的進一步篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種檢測煙氣總粒相物對細胞超氧化物歧化酶影響方法，為電子煙制品的安全性評估提供參考。
本發明公開一種檢測煙氣總粒相物對細胞超氧化物歧化酶影響方法，包括以下步驟：
(1)受試物的前處理；
(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備；
(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；
(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種；
(5)受試物的分組；
(6)受試物檢測劑量的設定；
(7)受試物培養品的制備；
(8)受試物的孵育；
(9)受試物孵育品的收集；
(10)樣品制備；
(11)樣品測定；
(12)蛋白濃度測定；
(13)超氧化物歧化酶酶活力的計算。
本發明優選的實施方案中，上述的方法，包括以下具體步驟：
(1)受試物的前處理：參照中華人民共和國國家標準GB/T 19609-2004《卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》制備卷煙煙氣總粒相物樣品，樣品濃度為10mg/mL；
(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備：人肺成纖維細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×105個/mL，接種到直徑為60mm細胞培養皿中，每皿4mL，將細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱內培養24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加受試物；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；
(7)受試物培養品的制備：移除步驟(4)中直徑為60mm細胞培養皿內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞；檢測樣品組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；用成纖維細胞培養基將每孔液體體積補足至4mL；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的直徑為60mm細胞培養皿置于37℃、5vt％CO2培養箱中孵育24h；
(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維細胞培養液懸起，1000rpm低溫離心10min；
(10)樣品制備：收集(9)步驟得到的細胞，加入100μL細胞裂解液，細胞裂解需在冰浴進行，裂解后收集細胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續測定；
(11)樣品測定：在不同離心管內加入20μL樣品待測液，空白對照1加入20μL檢測緩沖液，空白對照2加入40μL檢測緩沖液；檢測樣品組和空白對照組分別加入180μL氮藍四唑顯色工作液，37℃下孵育30分鐘，于560nm測定吸光度；
(12)蛋白濃度測定：測定樣品蛋白濃度；
(13)過氧化氫酶酶活力計算：
a.根據步驟(11)測定的的標準溶液吸光度值計算抑制百分率：
抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100％；
b.SOD酶活力的計算：
待測樣品中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units SOD酶酶活性(U/mg)＝待測樣品中SOD酶活力單位/樣品蛋白量(mg)。
本發明優選的實施方案中，步驟(11)所述的空白對照1是測溶液本身的本底吸光度，空白對照1是20μL溶液的本底吸光度，對照2是40μL溶液的本底吸光度，公式中要把這兩個本底值扣掉。
本發明優選的實施方案中，步驟(10)所述的細胞裂解液購買于碧云天公司，是一種在非變性條件下裂解細胞的裂解液。
本發明有益效果：
本發明對樣品的有效處理、檢測劑量的優化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測卷煙煙氣總粒相物對細胞超氧化物岐化酶酶活力影響的方法。
具體實施方式
下面將結合具體實例對本發明做詳細描述，但并不限制本發明。
本實施例針對1種國內市售卷煙的煙氣總粒相物對人肺成纖維細胞超氧化物岐化酶酶活力影響的方法。
(1)受試物的前處理：參照中華人民共和國國家標準GB/T 19609-2004《卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》制備卷煙煙氣總粒相物樣品，樣品濃度為10mg/mL；
(2)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的制備：人肺成纖維細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×105個/mL，接種到直徑為60mm細胞培養皿中，每皿4mL，將細胞培養板置于37℃、5vt％CO2培養箱內培養24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加受試物；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；
(7)受試物培養品的制備：移除步驟(4)中直徑為60mm細胞培養皿內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞；檢測樣品組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；用成纖維細胞培養基將每孔液體體積補足至4mL；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的直徑為60mm細胞培養皿置于37℃、5vt％CO2培養箱中孵育24h；
(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1min，用成纖維細胞培養液懸起，1000rpm低溫離心10min；
(10)樣品制備：收集(9)步驟得到的細胞，加入100μL細胞裂解液，細胞裂解需在冰浴進行，裂解后收集細胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續測定；
(11)樣品測定：在不同離心管內加入20μL樣品待測液，空白對照1加入20μL檢測緩沖液，空白對照2加入40μL檢測緩沖液；檢測樣品組和空白對照組分別加入180μL氮藍四唑顯色工作液，37℃下孵育30分鐘，于560nm測定吸光度；
(12)蛋白濃度測定：測定樣品蛋白濃度；
(13)過氧化氫酶酶活力計算：
a.根據步驟(11)測定的的標準溶液吸光度值計算抑制百分率：
抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100％；
b.SOD酶活力的計算：
待測樣品中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units SOD酶酶活性(U/mg)＝待測樣品中SOD酶活力單位/樣品蛋白量(mg)。
表1 1種卷煙煙氣總粒相物對HPF細胞SOD酶酶活性的影響
由試驗結果可以看出，在本發明方法給出的樣品處理方法、檢測劑量條件下，對照樣品組在檢測劑量范圍內對HPF細胞的SOD酶酶活性存在影響，且有劑量效應關系，與0劑量組相比存在顯著差異(p<0.05)；樣品1#在檢測劑量范圍內細胞的SOD酶酶活性與0劑量組相比無顯著差異(p>0.05)；以上結果顯示，該方法能夠有效的檢測卷煙煙氣粒相物對細胞SOD酶酶活性的影響。