本發明屬于HPV檢測
技術領域：
，具體涉及一種HPVl6感染相關疾病的免疫學檢測方法。
背景技術：
：人乳頭瘤病毒(HPV)為對稱二十面體，是微小無包膜的環狀雙鏈DNA病毒，大小約8kb。流行病學調查證實了HPV感染與宮頸癌的發生有極密切的相關性，檢測結果表明宮頸癌病例中HPV病毒基因組的陽性率大于99％，其中70％的病例由高危型病毒HPV16和HPV18的感染引起。HPV16是最常見的與宮頸癌相關的高危型病毒。HPV基因組按功能不同分為3個區：非編碼區，為基因轉錄復制調控區；早期區，含6個開放讀碼框架(El，E2，E4，E5，E6，E7)，編碼的蛋白參與病毒的復制與轉錄；晚期區，含L1和L2兩個開放讀碼框架，編碼病毒兩個衣殼蛋白，即主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，共同組成病毒的外殼。HPV16的E6和E7是主要的致癌基因，在宮頸癌SiHa細胞系中，當HPV16E6/E7表達沉默時，SiHa細胞的增殖及遷移能力就會明顯受到抑制。1993年比利時的HamersCasterman報道了在駱駝血清中不僅存在由2條H鏈和2條L鏈構成的常規抗體，還存在缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chainantibody，hcAb)這類抗體的抗原結合位點僅由重鏈的可變區VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH)形成，盡管天然缺失輕鏈可變區，卻仍具有良好和廣泛的抗原結合力。VHH納米抗體分子量為15kDa，僅為常規抗體的1/10。納米抗體具有易表達，水溶性好，穩定性強，免疫原性弱，組織穿透性好等優點，這些特點使得納米抗體在基礎研究、藥物開發等領域有重要的應用價值。而傳統抗體穩定性差、生產成本高，限制了對于乳頭瘤病毒的檢測。因此應用納米抗體技術研發乳頭瘤病毒的檢測試劑具有廣闊的前景。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是，提供一種HPV16E7蛋白納米抗體。本發明還要解決的技術問題是，提供上述HPV16E7蛋白納米抗體的制備方法。本發明還要解決的技術問題是，提供上述HPV16E7蛋白納米抗體在檢測HPV16E7蛋白中的應用。HPV16E7蛋白納米抗體，所述HPV16E7蛋白納米抗體的包括框架區和互補決定區：其中，所述框架區包括如下序列：如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述互補決定區包括如下序列如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3；或者，所述框架區包括如下序列：如SEQIDNO.8所示的FR1，如SEQIDNO.9所示的FR2，如SEQIDNO.10所示的FR3，如SEQIDNO.11所示的FR4；所述互補決定區包括如下序列如SEQIDNO.12所示的CDR1，如SEQIDNO.13所示的CDR2，如SEQIDNO.14所示的CDR3。HPV16E7蛋白納米抗體，所述HPV16E7蛋白納米抗體的氨基酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示。編碼HPV16E7蛋白納米抗體的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示。一種重組質粒，該質粒包含SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的序列。一種重組細胞，該重組細胞包含SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的序列。上述HPV16E7蛋白納米抗體的制備方法，包括如下步驟：將SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的核苷酸序列克隆到表達質粒上，再將得到的重組質粒轉化宿主細胞，培養，得到HPV16E7蛋白納米抗體。其中，所述表達質粒為pET28a。其中，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。上述HPV16E7蛋白納米抗體在檢測HPV16E7蛋白中的應用在本發明的保護范圍之內。有益效果：本發明的優點如下：本發明利用原核表達的HPV16E7抗原免疫駱駝，獲得高質量的免疫納米抗體基因庫。然后將HPV16E7蛋白包被在酶標板上，利用噬菌體展示技術篩選免疫納米抗體基因庫，從而獲得HPV16E7特異性的納米抗體基因，再將此基因轉至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。附圖說明圖1是pSUMO-HPVl6E7蛋白原核表達SDS-PAGE電泳圖：M為蛋白分子標準；1為未誘導全菌；2為IPTG誘導全菌。圖2是pSUMO-HPVl6E7蛋白鎳柱親和層析純化后的蛋白SDS-PAGE電泳圖：1為蛋白分子標準；2為目的蛋白。圖3是nest-PCR1產物瓊脂糖凝膠電泳圖：M為DNA分子標準；1為nest-PCR1產物。圖4是nest-PCR2產物瓊脂糖凝膠電泳圖：M為DNA分子標準；1為nest-PCR2產物即擴增所得的VHH片段。圖5是HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的多樣性鑒定圖：M為DNA分子標準；1-17是HPVl6E7蛋白納米抗體文庫中隨機挑選的單克隆噬菌體PCR產物。圖6.HPVl6E7蛋白納米抗體1誘導表達純化的SDS-PAGE電泳圖：M為蛋白分子標準；1為未誘導全菌；2為IPTG誘導全菌；3為超聲破碎沉淀；4為超聲破碎上清；5-6為流穿液；7，8為純化所得的HPVl6E7蛋白納米抗體。圖7.HPVl6E7蛋白納米抗體的免疫印跡親和性分析.l：pSUMO空質粒表達蛋白對照，2：HPVl6E7具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1：HPVl6E7蛋白的誘導表達及純化(1)HPVl6E7蛋白的誘導表達首先將成功構建好的pSUMO-HPVl6E7載體轉化到BL21(DE3)中，獲得pSUMO-HPVl6E7重組菌，挑選單克隆于卡那霉素液體LB中，培養過夜；然后以1：100接種于含卡那霉素液體LB中，培養1.5-2h，當菌液OD600為0.6～0.8時，用23℃，16h，0.1mmol/LIPTG進行誘導表達。圖1SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，誘導后的HPVl6E7蛋白表達菌在35KD處有一條帶，符合目的蛋白的預期分子量。(2)HPVl6E7蛋白的純化通過Ni-IDA親和層析的方法獲得純化的HPVl6E7蛋白。層析柱首先用菌體緩沖液清洗，加入Ni-IDA填充層析柱；將上述菌體超聲上清加入鎳柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床體積的清洗緩沖液(40mmol/L咪唑，菌體緩沖液)洗掉雜蛋白；用等體積的洗脫緩沖液(250mmol/L咪唑，菌體緩沖液)洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。圖2SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，經鎳柱純化的HPVl6E7蛋白，蛋白純度高達90％以上。實施例2：HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的構建(1)HPVl6E7蛋白免疫新疆雙峰駱駝將1mg的HPVl6E7蛋白與等體積的弗氏佐劑混合均勻，免疫新疆雙峰駱駝(皮下注射3-5點)，共免疫注射7次(首次用完全弗氏佐劑，其余用不完全弗氏佐劑)；免疫結束后，取免疫后駱駝的外周血200ml,分離獲得外周血淋巴細胞。(2)外周血淋巴細胞的分離及其總RNA的提取首先采用Percoll密度梯度離心分離純化駱駝外周血淋巴細胞。將淋巴細胞用生理鹽水清洗幾次后，加入Trizol,室溫靜置10min；然后加入氯仿劇烈震蕩，室溫靜置15min；離心后，收集上層水相加入異丙醇混勻，室溫靜置10min；離心去上清，75％乙醇清洗RNA，并用DEPC水溶解。(3)逆轉錄PCRI.采用invitrogen公司的SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR試劑盒，將外周血淋巴細胞總RNA逆轉錄成cDNA，通過nest-PCR擴增得到駱駝重鏈抗體的VHH片段。表1nest-PCR引物名稱及序列引物引物序列nest-PCR1up5'>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3'nest-PCR1down5'>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3'nest-PCR2up5'>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3'nest-PCR2down5'>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3'II.nest-PCR125ul體系以上述所得的cDNA為模板，nest-PCR1up和nest-PCR1down為引物，進行PCR擴增反應。PCR反應體系：PCR條件：PCR反應結束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，圖3凝膠電泳結果顯示，擴增基因片段在700bp處有特異性條帶。切膠回收目的條帶。III.nest-PCR225ul體系以nestPCR1DNA回收產物為模板，nest-PCR2up和nest-PCR2down為引物，進行PCR擴增反應。PCR反應體系：PCR條件：PCR反應結束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，圖4凝膠電泳結果顯示，擴增基因片段在500bp處有特異性條帶。切膠回收目的條帶，即為VHH片段。(4)VHH片段的雙酶切使用TAKARA公司的EcoRI和HindⅢ內切酶進行雙酶切，反應體系如下：37℃水浴3小時，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收。(5)T7噬菌體抗體庫的構建選用Novagen公司的T7Select10試劑盒構建納米抗體庫。依據其說明書進行VHH片段和T7載體的連接以及T7噬菌體的包裝。通過噬菌斑滴度測定，構建的HPVl6E7蛋白納米抗體庫滴度大約為1×107pfu/ml。(6)T7噬菌體抗體庫的擴增選用液體裂解法對T7噬菌體抗體庫進行擴增。在50mlTB培養基中加入1ml培養過夜的宿主BLT5403菌液，37℃，200r培養至OD600為0.6～1.0；加入⑸中所得的T7噬菌體抗體庫，37℃，200r培養至有白色絮狀沉淀出現時，停止培養；13000rpm,10min離心，上清為擴增的T7噬菌體抗體庫；對其進行噬菌斑滴度測定，其滴度為1×1010pfu/ml。(7)檢測HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的多樣性隨機挑⑸中的噬菌斑于50ul10mMEDTA中,劇烈震蕩混勻，65℃水浴15min，13000rpm離心10min，上清為粗提的噬菌體DNA；以其為模板，按照Novagen公司的T7Select10試劑盒說明書，進行PCR反應，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物(見圖5)，圖5電泳結果顯示，構建的HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的重組陽性率為100％。然后對其測序，分析HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的多樣性。PCR反應體系如下：PCR條件如下：測序結果顯示，17個單克隆噬菌斑，有15種核酸序列，并且這些序列翻譯成的氨基酸序列也不相同，說明構建的HPVl6E7蛋白納米抗體文庫有很好的多樣性。實施例3：運用鎳離子金屬螯合親和層析介質Ni-NTA淘選HPV16E7納米抗體。(1)Ni-NTA介質的清洗：取100ulNi-NTA介質于1.5mlEP管中，加1ml滅菌水，渦旋震蕩儀混勻；3000rpm，30s離心，棄上清；共洗5次，最后一次用0.05％TBST代替滅菌水。(2)封閉：洗好的Ni-NTA介質加入1ml封閉液(0.5％BSA)，翻轉搖勻1h；封閉結束后，1mlTBST洗4次。(3)負篩去除非特異結合的噬菌體：HPVl6E7的VHH-T7噬菌體庫用TBST稀釋至1ml，加入到封閉后的Ni-NTA介質中，置于翻轉搖勻儀上，室溫結合30min；離心，上清即為負篩后的T7噬菌體庫。(4)與HPVl6E7特異結合的噬菌體的篩選：負篩后的HPVl6E7噬菌體庫加入20ugHPVl6E7蛋白(1ug/ul)，室溫結合30min。然后將混合物加入到封閉好的Ni-NTA介質中，室溫結合30min；離心，棄上清。1mlTBST洗獲得的沉淀，共洗5次；離心，棄上清；加入400ulTB培養基混勻，平均分為兩份，一份用來測定篩選后的噬菌體的滴度，一份用來擴增篩選后的噬菌體。(5)篩選后的噬菌體的擴增：將篩選后的噬菌體加入到50mlOD600＝0.6的BLT5403宿主菌中，37℃震蕩培養，培養至有白色絮狀沉淀出現時，停止培養；離心，上清即為擴增的第一輪篩選后的噬菌體，置于4℃保存，并用于下一輪的篩選；按相同篩選步驟，篩選3-4輪。實施例4：ELISA鑒定特異性的HPVl6E7蛋白VHH-T7陽性克隆。上述最后一輪篩選所得的噬菌體，在150mm的TB固體培養基上培養，并挑選70個單克隆噬菌斑于3mlOD600＝0.6的BLT5403宿主菌中進行液體裂解法擴增，離心，上清于4℃保存，即為單克隆噬菌體；ELISA板每孔加入2ugHPVl6E7蛋白包被，置于4℃過夜，第二天0.5％BSA室溫封閉1h；實驗組每孔加入單克隆噬菌體，對照組加入等量的野生型T7噬菌體，室溫孵育1-2h；200ulTBST洗去未結合的噬菌體，共洗5次，然后加入兔抗T7噬菌體10A抗體，室溫孵育1-2h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入HRP標記的羊抗兔抗體，室溫孵育1h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入顯色液，避光反應10min，ELISA板置于酶標儀上，測吸光值，當實驗孔與對照孔吸光值比值大于2時，判定其為陽性克隆；提取陽性克隆噬菌體的DNA進行測序。ELISA鑒定結果顯示，獲得30個陽性克隆。然后對其進行DNA測序，獲得2種核苷酸序列；對其氨基酸序列進行分析，這兩種序列均具有典型的納米抗體結構，由框架區(FR1，FR2，FR4，FR4)和互補決定區(CDR1，CDR2和CDR3)構成。這兩株單克隆噬菌體的核苷酸序列，氨基酸序列如下：HPVl6E7的VHH1：核苷酸序列(SEQIDNO.17)：CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTACACCAGCAGTAGCTGCAGCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTTTTGCGGATGGTAGGACACGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAACACGGATGCACATGGCTCTTATAGTGACTATGACTGTGTGAATTGGAATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA氨基酸序列(SEQIDNO.15)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSSSCSMGWYRQAPGKERELVATIFADGRTRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCNTDAHGSYSDYDCVNWNNYWGQGTQVTVSS框架區(FR1-FR4)和互補決定區(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQIDNO.1)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASCDR1(SEQIDNO.5)：GYTSSSCSMGFR2(SEQIDNO.2)：WYRQAPGKERELVATCDR2(SEQIDNO.6)：IFADGRTRFR3(SEQIDNO.3)：YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCCDR3(SEQIDNO.7)：NTDAHGSYSDYDCVNWNNYFR4(SEQIDNO.4)：WGQGTQVTVSSHPVl6E7的VHH2：核苷酸序列(SEQIDNO.18)：GATGTGCAGCTGGTCAATACCATGAGTAACGAGAAGCTGGATGTAGAAGGCGTTACCAGCAAGTATGGGGTACGCCCAGATCAGATTATCGATTATTTAATGCTGATTGGCGACACTTCGGACAATATTCCCGGCGTTCCCAAGGTGGGGCCCAAGACGGCCGCCAAGTGGTTGGGCGAATATGGCAGTCTGGATGAACTGTTGCAGCATGCCGACAAAATCAAGGGGGTGGCCGGCCAGAATCTGGCCGGCAGCAGCTCCAACTTTGAAATGACGCGCAAACTGGTCACCGTCTCCTCA氨基酸序列(SEQIDNO.16)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRPDQIIDYLMLIGDTSDNIPGVPKVGPKTAAKWLGEYGSLDELLQHADKIKGVAGQNLAGSSSNFEMTRKLVTVSS框架區(FR1-FR4)和互補決定區(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQIDNO.8)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRCDR1(SEQIDNO.12)：PDQIIDYLMLFR2(SEQIDNO.9)：IGDTSDNIPGVPKVGCDR2(SEQIDNO.13)：PKTAAKWLFR3(SEQIDNO.10)：GEYGSLDELLQHADKIKGVAGQCDR3(SEQIDNO.14)：NLAGSSSNFFR4(SEQIDNO.11)：EMTRKLVTVSS實施例5：HPVl6E7蛋白納米抗體的誘導表達和純化(1)HPVl6E7蛋白納米抗體的誘導表達首先將HPVl6E7蛋白納米抗體的基因序列用TAKARA公司的EcoRI和HindⅢ內切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收酶切產物，分別將其插入到pET28a中，成功構建HPVl6E7蛋白納米抗體的表達載體；將HPVl6E7蛋白納米抗體的表達載體轉化到BL21(DE3)中，涂卡那霉素抗性LB平板培養基，挑單克隆菌株，培養過夜。以1:100的比例將HPVl6E7蛋白納米抗體表達菌加入到培養基中，37℃培養至OD600為0.6-0.8時，IPTG誘導表達。離心菌液獲得菌體沉淀，用裂解緩沖液重懸，置于冰盒內超聲破碎，離心收集上清。(2)HPVl6E7蛋白納米抗體的純化通過Ni-IDA親和層析的方法獲得純化的HPVl6E7蛋白納米抗體。層析柱首先用菌體緩沖液清洗，加入Ni-IDA填充層析柱；將上述HPVl6E7蛋白納米抗體表達菌菌體超聲上清加入鎳柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床體積的清洗緩沖液(40mmol/L咪唑)洗掉雜蛋白；用等體積的洗脫緩沖液(250mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。然后用15％SDS-PAGE電泳檢測HPVl6E7納米抗體的表達純化情況。(見圖6)。SDS-PAGE電泳檢測結果：圖6結果顯示，誘導后的HPVl6E7蛋白納米抗體1表達菌與其未誘導的表達菌相比較，在20KD處有一條帶，且符合目的蛋白的預期分子量；通過灰度分析，純化所得的HPVl6E7蛋白納米抗體的純度大于90％。實施例6:HPVl6E7蛋白納米抗體的免疫印跡親和性分析對pSUMO-HPVl6E7質粒表達得到的HPV16E7蛋白及對照空質粒表達蛋白進行WesternBlot鑒定，結果表明HPVl6E7蛋白納米抗體與HPVl6E7蛋白具有較好的結合能力，與空載體表達的蛋白不能結合，DAB顯色后在大約35kDa位置有清晰的目標條帶(圖7)。實施例7:HPVl6E7蛋白納米抗體的ELISA法親和性分析以HPVl6E7蛋白和pSUMO空質粒表達蛋白包被酶標板，包被濃度10ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被過夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封閉液，室溫封閉一小時。丟棄封閉液并用TBST洗3次，加入HPVl6E7納米抗體，或對照wasabi納米抗體，室溫孵育一小時。TBST洗板3次后，加入1:1000稀釋的兔抗HA單克隆抗體，200μl/孔，室溫孵育一小時。TBST洗板3次，加入1:2000稀釋的HRP標記羊抗兔二抗，200μl/孔，室溫孵育一小時。TBST洗板3次，每孔加入100ul的TMB顯色液，ELISA板置于酶標儀上，測450nm吸光值。結果見表2，ELISA檢測結果顯示：HPVl6E7納米抗體對HPVl6E7的結合活性遠遠高于wasabi納米抗體對照組及pSUMO空質粒表達蛋白組.。表2ELISA檢測HPVl6E7納米抗體的親和性SEQUENCELISTING<110>東南大學<120>HPV16E7蛋白納米抗體及其制備方法與應用<130>SG20161130001<160>18<170>PatentInversion3.5<210>1<211>25<212>PRT<213>VHH1的FR1序列<400>1GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSer2025<210>2<211>15<212>PRT<213>VHH1的FR2序列<400>2TrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuValAlaThr151015<210>3<211>37<212>PRT<213>VHH1的FR3序列<400>3TyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAla151015LysAsnThrValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThr202530AlaMetTyrTyrCys35<210>4<211>11<212>PRT<213>VHH1的FR4序列<400>4TrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer1510<210>5<211>10<212>PRT<213>VHH1的CDR1序列<400>5GlyTyrThrSerSerSerCysSerMetGly1510<210>6<211>8<212>PRT<213>VHH1的CDR2序列<400>6IlePheAlaAspGlyArgThrArg15<210>7<211>19<212>PRT<213>VHH1的CDR3序列<400>7AsnThrAspAlaHisGlySerTyrSerAspTyrAspCysValAsnTrp151015AsnAsnTyr<210>8<211>25<212>PRT<213>VHH2的FR1序列<400>8AspValGlnLeuValAsnThrMetSerAsnGluLysLeuAspValGlu151015GlyValThrSerLysTyrGlyValArg2025<210>9<211>15<212>PRT<213>VHH2的FR2序列<400>9IleGlyAspThrSerAspAsnIleProGlyValProLysValGly151015<210>10<211>22<212>PRT<213>VHH2的FR3序列<400>10GlyGluTyrGlySerLeuAspGluLeuLeuGlnHisAlaAspLysIle151015LysGlyValAlaGlyGln20<210>11<211>11<212>PRT<213>VHH2的FR4序列<400>11GluMetThrArgLysLeuValThrValSerSer1510<210>12<211>10<212>PRT<213>VHH2的CDR1序列<400>12ProAspGlnIleIleAspTyrLeuMetLeu1510<210>13<211>8<212>PRT<213>VHH2的CDR2序列<400>13ProLysThrAlaAlaLysTrpLeu15<210>14<211>9<212>PRT<213>VHH2的CDR3序列<400>14AsnLeuAlaGlySerSerSerAsnPhe15<210>15<211>125<212>PRT<213>VHH1的氨基酸序列<400>15GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrSerSerSerCys202530SerMetGlyTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuVal354045AlaThrIlePheAlaAspGlyArgThrArgTyrAlaAspSerValLys505560GlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyrLeu65707580GlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAsn859095ThrAspAlaHisGlySerTyrSerAspTyrAspCysValAsnTrpAsn100105110AsnTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>16<211>100<212>PRT<213>VHH2的氨基酸序列<400>16AspValGlnLeuValAsnThrMetSerAsnGluLysLeuAspValGlu151015GlyValThrSerLysTyrGlyValArgProAspGlnIleIleAspTyr202530LeuMetLeuIleGlyAspThrSerAspAsnIleProGlyValProLys354045ValGlyProLysThrAlaAlaLysTrpLeuGlyGluTyrGlySerLeu505560AspGluLeuLeuGlnHisAlaAspLysIleLysGlyValAlaGlyGln65707580AsnLeuAlaGlySerSerSerAsnPheGluMetThrArgLysLeuVal859095ThrValSerSer100<210>17<211>375<212>DNA<213>VHH1的核苷酸序列<400>17caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60tcctgtgcagcctctgggtacaccagcagtagctgcagcatgggctggtaccgccaggct120ccagggaaggagcgcgagttggtcgcaactatttttgcggatggtaggacacgctatgca180gactccgtgaagggccgattcaccatctcccgagacaacgccaagaacacggtgtatctg240caaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtattactgtaacacggatgcacat300ggctcttatagtgactatgactgtgtgaattggaataactactggggccaggggacccag360gtcaccgtctcctca375<210>18<211>300<212>PRT<213>VHH2的核苷酸序列<400>18GlyAlaThrGlyThrGlyCysAlaGlyCysThrGlyGlyThrCysAla151015AlaThrAlaCysCysAlaThrGlyAlaGlyThrAlaAlaCysGlyAla202530GlyAlaAlaGlyCysThrGlyGlyAlaThrGlyThrAlaGlyAlaAla354045GlyGlyCysGlyThrThrAlaCysCysAlaGlyCysAlaAlaGlyThr505560AlaThrGlyGlyGlyGlyThrAlaCysGlyCysCysCysAlaGlyAla65707580ThrCysAlaGlyAlaThrThrAlaThrCysGlyAlaThrThrAlaThr859095ThrThrAlaAlaThrGlyCysThrGlyAlaThrThrGlyGlyCysGly100105110AlaCysAlaCysThrThrCysGlyGlyAlaCysAlaAlaThrAlaThr115120125ThrCysCysCysGlyGlyCysGlyThrThrCysCysCysAlaAlaGly130135140GlyThrGlyGlyGlyGlyCysCysCysAlaAlaGlyAlaCysGlyGly145150155160CysCysGlyCysCysAlaAlaGlyThrGlyGlyThrThrGlyGlyGly165170175CysGlyAlaAlaThrAlaThrGlyGlyCysAlaGlyThrCysThrGly180185190GlyAlaThrGlyAlaAlaCysThrGlyThrThrGlyCysAlaGlyCys195200205AlaThrGlyCysCysGlyAlaCysAlaAlaAlaAlaThrCysAlaAla210215220GlyGlyGlyGlyGlyThrGlyGlyCysCysGlyGlyCysCysAlaGly225230235240AlaAlaThrCysThrGlyGlyCysCysGlyGlyCysAlaGlyCysAla245250255GlyCysThrCysCysAlaAlaCysThrThrThrGlyAlaAlaAlaThr260265270GlyAlaCysGlyCysGlyCysAlaAlaAlaCysThrGlyGlyThrCys275280285AlaCysCysGlyThrCysThrCysCysThrCysAla290295300當前第1頁1 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