DNA擴增產物快速檢測方法與流程

本發明屬于核酸檢測領域，特別是一種快速檢測DNA擴增產物的方法。
背景技術：
：DNA聚合酶鏈反應(PCR)是擴增DNA片段最常用的方法，每個擴增周期由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等幾步反應組成，循環進行，目的DNA迅速擴增，1-2小時就能擴增幾百萬倍。PCR因其擴增特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等優點而被廣泛應用于各種核酸檢測中。常被用于核酸的基礎研究，在醫學上的應用也十分廣泛，它也是目前核酸檢測的金標準。PCR產物都是產生平末端雙鏈產物，如今的檢測方法一般包括瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等，隨后需要借助染色和紫外透射成像進行分析。這些分析操作步驟繁瑣、耗時長，且依賴儀器及特殊訓練的專業人員，不利于實時檢測和偏遠地區使用。另外還有通過核酸試紙條對PCR產物進行檢測的方法，該技術一般都需要對PCR引物序列進行雙修飾或者其他特殊的處理，常見的有以下兩種：一、雙修飾引物：常用于標記的小分子有Biotin，Digoxin，FITC，Cy3等，且為了在試紙條上進行夾心法檢測都需要進行雙修飾。這些小分子都是修飾在引物的末端，當引物與模板退火延伸時，小分子也標記在產物上，從而達到標記PCR產物的目的。在試紙條上固定有標記分子的抗體，利用抗原-抗體特異性結合的原理實現對PCR產物的快速檢測。二、雙修飾加高溫變性處理：PCR擴增產物一般都是平末端雙鏈，如果不在末端進行分子修飾的話，則沒有突出的粘性末端用于雜交；高溫變性可以將雙鏈分離而得到單鏈，用于跟標記在納米粒子表面的核酸互補配對而固定到納米粒子表面。這樣通過雙重化學修飾再加上高溫變性才能用試紙條進行夾心法檢測，成本高且變溫來產生單鏈，效率低，影響檢測靈敏度。另外，上述方法均需利用試紙條，因此成本偏高。而且，制備試紙條需要特殊的載體材料、儀器和專門的干燥室，例如玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜以及劃膜噴金儀，且制備過程比較繁瑣。技術實現要素：針對以上DNA擴增產物檢測方法繁瑣復雜、成本高、靈敏度低的問題，本發明提出一種快速檢測DNA擴增產物的方法，DNA擴增后得到的產物可直接用標記膠體金溶液進行檢測，從而達到準確、快速、靈敏、低成本、操作簡易的檢測需求。一種DNA擴增產物快速檢測方法，包括以下步驟：(1)設計用于擴增目的DNA的上游引物F和下游引物R序列，并在上游引物F和下游引物R序列的5’端分別加上Tag1和Tag2序列，上游引物F序列和Tag1序列之間、下游引物R序列和Tag2序列之間分別用帶有兩個羥甲基的芳香族化合物隔開，得到F-Tag1和R-Tag2，兩個羥甲基分別與相鄰兩個核苷酸的磷酸基形成磷酸二酯鍵；所述帶有兩個羥甲基的芳香族化合物為以下結構式化合物中的一種：(2)分別設計與Tag1和Tag2互補的序列C-Tag1和C-Tag2，并分別在C-Tag1和C-Tag2的5’端用巰基(-SH)修飾；將修飾過后的C-Tag1和C-Tag2分別通過金硫鍵(Au-S)結合到膠體金粒子上，得到AuNPDNA1和AuNPDNA2；將AuNPDNA1和AuNPDNA2按C-Tag1和C-Tag2摩爾比1:1混勻制備成紅色透明的標記膠體金溶液，備用；(3)以待檢測DNA為模板、F-Tag1和R-Tag2為擴增引物，混合PCR反應體系置于PCR儀中進行反應，得到PCR產物；(4)將PCR產物加入到標記膠體金溶液中混勻，肉眼觀察進行檢測及判斷，標記膠體金溶液無變化則檢測結果為陰性，標記膠體金溶液變渾濁則檢測結果為陽性。進一步地，步驟(1)中上游引物和下游引物序列長度分別為18-25nt，Tag1和Tag2序列長度都為15-20nt。所述上游引物和下游引物根據引物設計規則隨機進行設計即可，也可根據具體實驗需要對引物的長度、GC含量等進行限定，也可根據實際需要在引物上添加接頭或進行修飾。本發明選擇引物長度18-25nt更利于PCR反應的正常進行。Tag1和Tag2序列可進行隨機設計，長度選擇15-20nt既可滿足堿基互補檢測的要求，也可有效控制成本。另外，Tag1和Tag2序列可以通用。進一步地，Tag1和Tag2序列為：Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’，上述Tag1和Tag2序列已證實可以在各種PCR產物檢測中通用。進一步地，步驟(2)中在-SH和C-Tag1之間、-SH和C-Tag2之間，添加10-12個核苷酸T(胸腺嘧啶核苷酸)，這樣可以增加膠體金與C-Tag之間的空間，利于Tag與其互補序列C-Tag的結合，使C-Tag1和C-Tag2更容易標記于膠體金上。進一步地，步驟(2)中膠體金粒子的制備方法為：將0.01wt％的氯金酸與1wt％的檸檬酸三鈉混勻制成，氯金酸與檸檬酸三鈉的體積比為0.5-4:100。膠體金粒子的直徑大小會隨著氯金酸與檸檬酸三鈉體積比的不同而有所變化，常規的1.5mL/100mL可制備出的膠體金的粒徑在40nm左右，隨著還原劑檸檬酸三鈉溶液體積的增加，制備的膠體金粒徑會越來越小，在本發明中膠體金粒子大小直徑范圍在5nm到100nm之間。進一步地，步驟(2)中標記膠體金溶液中納米金的濃度為0.001-0.01wt％，以納米金表面固定的寡核苷酸計濃度為1-100nM。進一步地，步驟(4)中加入的PCR產物的量與標記膠體金溶液的體積比為1:1-4。本發明的另外一個目的是提供一種快速檢測DNA擴增產物的試劑盒，包括引物和標記膠體金溶液；所述引物包括F-Tag1和R-Tag2，F-Tag1從5'-端開始依次含有Tag1序列、帶有兩個羥甲基的芳香族化合物和目的DNA上游引物序列，R-Tag2從5'-端開始依次含有Tag2序列、帶有兩個羥甲基的芳香族化合物和目的DNA下游引物序列；所述膠體金溶液主要由AuNPDNA1和AuNPDNA2按C-Tag1和C-Tag2摩爾比1:1混勻得到，AuNPDNA1由Tag1的互補序列C-Tag1與膠體金連接而成，AuNPDNA2由Tag2的互補序列C-Tag2與膠體金連接而成。進一步地，上述試劑盒中還含有陽性對照溶液，所述陽性對照溶液為用F-Tag1和R-Tag2擴增目的DNA得到的陽性PCR產物。該陽性對照溶液用于驗證試劑盒中的標記膠體金溶液是否有效可用。本發明的原理如下：在序列設計時，上下游引物的5’端分別帶有不同的Tag1和Tag2標簽序列，且兩段序列中間用帶有兩個羥甲基的芳香族化合物進行修飾(該化合物通過兩個羥甲基與磷酸骨架相結合，完成對核酸序列的修飾)。PCR反應時，由于修飾化合物會在空間上對核酸堿基的配對有很強的阻隔作用，DNA聚合酶的延伸就會在此修飾位置停止，因此PCR產物的兩個5’末端就會分別帶上Tag1和Tag2標簽。由于膠體金溶液在單鏈核酸標記時能穩定保持分散狀態，呈透明紅色；當PCR產物與標記膠體金溶液混合后，產物兩端的Tag序列分別與不同膠體金上的標記核酸互補雜交配對，從而將多個膠體金橋聯成網狀結構而產生絮凝沉淀，通過明顯的絮凝現象(變渾濁)，肉眼即可判斷檢測結果，從而完成對擴增產物的快速檢測。本發明具有以下有益效果：(1)本發明通過在引物的5’添加標簽序列，并在引物和標簽序列之間進行修飾，PCR反應時阻礙DNA聚合酶的延伸，使得到的PCR產物帶有單鏈末端，該PCR產物可直接加入到標記膠體金序列中，通過觀察混合物狀態的變化判斷PCR產物的有無，具有足夠高的檢測靈敏度，方便、快捷，幾秒鐘便可通過肉眼觀察得知結果，對技術的專業性要求低，不需專業設備，有效節省了檢測成本。(2)經過合理序列設計，Tag標簽序列可以通用，只需要改變引物序列，就可以對不同目的DNA進行檢測，具有良好的通用性。附圖說明圖1為帶有兩個羥甲基的芳香族化合物的化學結構式；圖2為帶有兩個羥甲基的芳香族化合物對核酸分子的修飾機理；圖3為被修飾的上下游引物的結構簡圖；圖4為圖1A化合物的合成過程示意圖；圖5為圖1B化合物的合成過程示意圖；圖6為標記膠體金制備簡圖；圖7為本發明的流程示意圖；圖8為本發明實施例1的PCR產物檢測結果圖；圖9為本發明實施例1的PCR產物電泳圖；圖10為本發明實施例2的PCR產物檢測結果圖；圖11為本發明實施例2的PCR產物電泳圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。實施例1本實施例以結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的gyrB基因(GenBank登錄號：JQ684012.1)為檢測對象。(1)設計gyrB基因的上下游引物gyr-F和gyr-R，目的產物長度為112bp。分別在gyr-F和gyr-R的5’加上Tag1和Tag2序列，并在gyr-F和Tag1之間、gyr-R和Tag2之間分別用圖1A所示的帶有兩個羥甲基的芳香族化合物進行修飾，修飾機理如圖2A所示，得到用于PCR擴增的引物序列gyr-F-Tag1和gyr-R-Tag2，如圖3所示，序列信息如下所示，其中一個x即代表一個羥甲基的芳香族化合物分子。圖1A所示的帶有兩個羥甲基的芳香族化合物的具體合成方法如圖4所示：a).化合物(1)氨基間苯二甲酸二甲酯(6.00g28.68mmol)與NaNO2(3.96g57.36mmol)溶于34.2mL水中，再加入7.8mL鹽酸(濃度為2M)，在0℃下攪拌反應1h；再加入碘化鉀溶液(9.54g溶于138mL水中)，在室溫下攪拌反應1h，反應結束后，經過分離純化后得到化合物(2)5-碘衍生物4.42g，產物得率為48％。b).化合物(2)5-碘衍生物(2.76g8.64mmol)與硼氫化鋰(0.96g44.10mmol)溶于48mL四氫呋喃中，在室溫下攪拌反應24h，再于0℃下加入飽和NaHCO3溶液6mL，在室溫下再攪拌反應1h，反應結束后，經過分離純化后得到白色固體化合物(3)，其質量為1.74g，產物得率為76％。c).取化合物(3)(1.62g6.18mmol)、TBDMSCl(2.04g13.62mmol)、咪唑(1.86g27.18mmol)混合于24mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，在室溫下攪拌反應2h，再加入6mL乙醇，混合攪拌10分鐘，反應結束后，經過分離純化得到化合物(4)，其質量為3.0g，產物得率為97％。d).取化合物(4)(2.80g5.64mmol)溶于28mL乙醚中，再緩慢加入丁基鋰溶液(1.6M溶于己烷)，在-78℃下攪拌反應1h，再往混合溶液中緩慢加入硼酸三甲酯(2.48mL22.2mmol)，再緩慢加熱至室溫，并保溫攪拌反應12h，反應結束后，經過分離純化得到白色固體化合物(5)，其質量為1.38g，產物得率為60％。e).取化合物(5)(1.00g2.44mmol)溶于24mL的THF/H2O(體積比5:1)中，將化合物(6)1’-碘代萘(0.62g2.44mmol)與PdCl2(dppf)·CH2Cl2(0.122g0.149mmol)溶于12mL的THF/H2O(體積比5:1)中，將上述兩種溶液混合，并加入3.66mLNaOH溶液(2M)，在65℃下攪拌反應24h，反應結束后，經過分離純化得到化合物(7)。f).將化合物(7)溶于7.3mL四氫呋喃(THF)中，再滴加入7.3mL的四丁基氟化氨溶液(1.0M溶于THF)中，在室溫下攪拌反應1h，反應結束后，經過分離純化得到聯芳化合物(8)，其質量為0.55g，產物得率為84％。g).將聯芳化合物化合物(8)(0.55g2.05mmol)與DMTrCl(0.91g2.68mmol)溶于10mL的吡啶中，在室溫下攪拌反應4h，反應結束后，經過分離純化得到聯芳化合物(9)，其質量為0.43g，產物得率為37％。h).將化合物(9)(0.43g0.76mmol)、2-氰乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺(0.48mL2.75mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.35mL1.57mmol)溶于7mL四氫呋喃(THF)中，在室溫下攪拌反應1h，反應結束后，將混合物經過分離純化得到化合物(10)，其質量為0.51g，產物得率為88％。經過純化得到的化合物(10)用乙腈溶解，按照常規方法通過DNA合成儀添加到引物上，生成修飾引物。(2)分別設計與Tag1和Tag2互補的序列C-Tag1和C-Tag2，并分別在C-Tag1和C-Tag2的5’端加10個胸腺嘧啶核苷酸(T)，然后用巰基(-SH)修飾5’端。將修飾過后的C-Tag1和C-Tag2分別通過金硫鍵(Au-S)結合到膠體金粒子上，其過程如圖6所示，一個膠體金上一般能結合多條核酸序列，得到AuNPDNA1和AuNPDNA2。將AuNPDNA1和AuNPDNA2按C-Tag1和C-Tag2摩爾比1:1混勻制備成紅色透明的標記膠體金溶液，使納米金表面固定的寡核苷酸的濃度為10nM，備用。其中膠體金粒子的制備方法為：將0.01wt％的氯金酸與1wt％的檸檬酸三鈉混勻制成，氯金酸與檸檬酸三鈉的體積比為1:100。gyr-F：5’-GCTGCGTCTATCACCATTCTC-3’21ntgyr-R：5’-CGACCACCTCCCAAATGAGA-3’20ntTag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’17ntTag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’17ntgyr-F-Tag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACTxGCTGCGTCTATCACCATTCTC-3’38ntgyr-R-Tag2：5’-CCATGTCTAATGCTGATxCGACCACCTCCCAAATGAGA-3’37ntgyrB基因擴增片段：5’-GCTGCGTCTATCACCATTCTCGAAGGGCTGGAGGCCGTCCGCAAACGTCCCGGCATGTACATTGGCTCGACCGGTGAGCGCGGTTTACACCATCTCATTTGGGAGGTGGTCG-3’112ntC-Tag1：5’-SH-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’27ntC-Tag2：5’-SH-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’27ntAuNPDNA1：Au-S-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’AuNPDNA2：Au-S-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’(3)以結核桿菌基因組DNA為模板，gyr-F-Tag1/gyr-R-Tag2為引物混合PCR反應體系，同時設置不加模板DNA的對照及采用未修飾引物的對照，如表1所示。混好的PCR反應體系置于PCR儀中進行反應，PCR循環反應參數：95℃預變性3min；95℃15s、58℃20s、72℃40s，40個循環擴增；72℃5min擴增，得到PCR產物。表1實施例1的PCR反應體系(20μL)：對照組A對照組B實驗組C基因組DNA2μL2μLgyr-F/gyr-R各0.5μLgyr-F-Tag1/gyr-R-Tag2各0.5μL各0.5μL1×PCRbuffer2μL2μL2μLDNA聚合酶0.5μL0.5μL0.5μLdNTPs2μL2μL2μLddH2O14.5μL12.5μL12.5μL總體積20μL20μL20μL(4)將10μLPCR產物加入到20μL標記膠體金溶液中，震蕩混勻，片刻后，肉眼觀察即可判斷結果。實驗結果如圖8所示，A管為空白對照擴增產物，B管為未修飾引物的擴增產物，C管為修飾引物的擴增產物，D管為核酸標記膠體金溶液，A+、B+、C+管分別對應三種擴增產物加到標記膠體金后的混合物。圖中顯示A+、B+管中的顏色及狀態相比于D管沒有發生變化，呈現紅色且透明，C+管中的溶液狀態發生了變化，產生了絮狀沉淀，以上結果說明只有修飾引物的擴增產物能使標記膠體金發生絮凝沉淀，充分證明了該設計的合理性。(5)對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，染色并成像，如圖9中顯示，A組空白對照中無產物生成，而B、C兩管中均有產物生成，且產物長度為112bp。將B、C組的PCR產物回收測序顯示序列正確。實施例2本實施例以副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的mutS基因(GenBank登錄號：EU652256.1)為檢測對象。(1)設計mutS基因的上下游引物mutS-F和mutS-R，目的產物長度為200bp。分別在mutS-F和mutS-R的5’加上Tag1和Tag2序列，并在mutS-F和Tag1之間、mutS-R和Tag2之間分別用圖1B所示的化合物進行修飾，修飾機理如圖2B所示，得到用于PCR擴增的引物序列mutS-F-Tag1和mutS-R-Tag2，如圖3所示，序列信息如下所示，其中一個x即代表一個羥甲基的芳香族化合物分子。圖1B所示的帶有兩個羥甲基的芳香族化合物的具體合成方法如圖4所示：a).化合物(1)氨基間苯二甲酸二甲酯(6.00g28.68mmol)與NaNO2(3.96g57.36mmol)溶于34.2mL水中，再加入7.8mL鹽酸(濃度為2M)，在0℃下攪拌反應1h；再加入碘化鉀溶液(9.54g溶于138mL水中)，在室溫下攪拌反應1h，反應結束后，經過分離純化后得到化合物(2)5-碘衍生物4.42g，產物得率為48％。b).化合物(2)5-碘衍生物(2.76g8.64mmol)與硼氫化鋰(0.96g44.10mmol)溶于48mL四氫呋喃中，在室溫下攪拌反應24h，再于0℃下加入飽和NaHCO3溶液6mL，在室溫下再攪拌反應1h，反應結束后，經過分離純化后得到白色固體化合物(3)，其質量為1.74g，產物得率為76％。c).取化合物(3)(1.62g6.18mmol)、TBDMSCl(2.04g13.62mmol)、咪唑(1.86g27.18mmol)混合于24mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，在室溫下攪拌反應2h，再加入6mL乙醇，混合攪拌10分鐘，反應結束后，經過分離純化得到化合物(4)，其質量為3.0g，產物得率為97％。d).取化合物(4)(2.80g5.64mmol)溶于28mL乙醚中，再緩慢加入丁基鋰溶液(1.6M溶于己烷)，在-78℃下攪拌反應1h，再往混合溶液中緩慢加入硼酸三甲酯(2.48mL22.2mmol)，再緩慢加熱至室溫，并保溫攪拌反應12h，反應結束后，經過分離純化得到白色固體化合物(5)，其質量為1.38g，產物得率為60％。e).取化合物(5)(1.00g2.44mmol)溶于24mL的THF/H2O(5:1)中，將化合物(11)1’-溴芘(0.69g2.44mmol)與PdCl2(dppf)·CH2Cl2(0.13g0.15mmol)溶于12mL的THF/H2O(5:1)中，將上述兩種溶液混合，并加入3.66mL的NaOH溶液(2M)，在65℃下攪拌反應48h，反應結束后，經過分離純化得到化合物(12)。f).將化合物(12)溶于45mLTHF/CH2Cl2(體積比1:1)中，再滴加入1.14mL的四丁基氟化氨(TBAF)溶液(1.0M溶于THF中)中，在室溫下攪拌反應1h，反應結束后，將混合物經過分離純化得到聯芳化合物(13)，其質量為0.42g，產物得率為54％。g).將聯芳化合物(13)(0.41g1.21mmol)與DMTrCl(0.46g1.36mmol)溶于10mL的吡啶中，在室溫下攪拌反應4h，反應結束后，經過分離純化得到聯芳化合物(14)，其質量為0.45g，產物得率為58％。h).將化合物(14)(0.44g0.687mmol)、2-氰乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺(0.31mL1.38mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.57mL3.24mmol)溶于4mL的四氫呋喃(THF)中，在室溫下攪拌反應1h，反應結束后，經過分離純化得到化合物(15)，其質量為0.54g，產物得率為93％。經過純化得到的化合物(15)用乙腈溶解，按照常規方法通過DNA合成儀添加到引物上，生成修飾引物。(2)分別設計與Tag1和Tag2互補的序列C-Tag1和C-Tag2，并分別在C-Tag1和C-Tag2的5’端加10個胸腺嘧啶核苷酸(T)，然后用巰基(-SH)修飾5’端。將修飾過后的C-Tag1和C-Tag2分別通過金硫鍵(Au-S)結合到膠體金粒子上，其過程如圖6所示，一個膠體金上一般能結合多條核酸序列，得到AuNPDNA1和AuNPDNA2。將AuNPDNA1和AuNPDNA2按C-Tag1和C-Tag2摩爾比1:1混勻制備成紅色透明的標記膠體金溶液，使納米金表面固定的寡核苷酸的濃度為100nM，備用。其中膠體金粒子的制備方法為：將0.01wt％的氯金酸與1wt％的檸檬酸三鈉混勻制成，氯金酸與檸檬酸三鈉的體積比為4:100。mutS-F：5’-TCCTGAGCTTAAAGAGCATGAAGACAA-3’27ntmutS-R：5’-GGCGGCAATAATCCAATGAGTCTG-3’24ntTag1：5’-CGTCTCTGTACGAGACT-3’17ntTag2：5’-CCATGTCTAATGCTGAT-3’17ntmutS-F-Tag1:5’-CGTCTCTGTACGAGACTxTCCTGAGCTTAAAGAGCATGAAGACAA-3’44ntmutS-R-Tag2:5’-CCATGTCTAATGCTGATxGGCGGCAATAATCCAATGAGTCTG-3’41ntmutS基因擴增片段：5’-TCCTGAGCTTAAAGAGCATGAAGACAAGGTGCTGAACTCAAAATCAAAAGCACTAGCATTAGAGAAAAAGCTGTGGGAAGAGCTGTTCGATCTGTTAATGCCTCATCTTGAGCAAATGCAAAACTTGGCTTCTGCCGTTTCTCAGATGGACGTGTTACAAAATCTCGCGGAACGCGCAGACTCATTGGATTATTGCCGCC-3’200ntC-Tag1：5’-SH-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’27ntC-Tag2：5’-SH-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’27ntAuNPDNA1：Au-S-TTTTTTTTTTAGTCTCGTACAGAGACG-3’AuNPDNA2：Au-S-TTTTTTTTTTATCAGCATTAGACATGG-3’(3)以副溶血弧菌基因組DNA為模板，mutS-F-Tag1/mutS-R-Tag2為引物混合PCR反應體系，同時設置不加模板DNA的對照及采用未修飾引物的對照，如表2所示。混好的PCR反應體系置于PCR儀中進行反應，PCR循環反應參數：95℃預變性3min；95℃15s、58℃20s、72℃40s，40個循環擴增；72℃5min擴增，得到PCR產物。表2實施例2的PCR反應體系(20μL)：對照組A對照組B實驗組C基因組DNA2μL2μLmutS-F/mutS-R各0.5μLmutS-F-Tag1/mutS-R-Tag2各0.5μL各0.5μL1×PCRbuffer2μL2μL2μLDNA聚合酶0.5μL0.5μL0.5μLdNTPs2μL2μL2μLddH2O14.5μL12.5μL12.5μL總體積20μL20μL20μL(4)將10μLPCR產物加入到10μL標記膠體金溶液中，震蕩混勻，片刻后，肉眼觀察即可判斷結果。實驗結果如圖10所示，A管為空白對照擴增產物，B管為未修飾引物的擴增產物，C管為修飾引物的擴增產物，D管為核酸標記膠體金溶液，A+、B+、C+管分別對應三種擴增產物加到標記膠體金后的混合物。圖中顯示A+、B+管中的顏色及狀態相比于D管沒有發生變化，呈現紅色且透明，C+管中的溶液狀態發生了變化，產生了絮狀沉淀，以上結果說明只有修飾引物的擴增產物能使標記膠體金發生絮凝沉淀，也充分證明了該設計的合理性。(5)對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，染色并成像，如圖11中顯示，A組空白對照中無產物生成，而B、C兩管中均有產物生成，且產物長度為200bp。將B、C組的PCR產物回收測序顯示序列正確。實驗結果如附圖8、10由于拍射角度及光線等原因，實施例中圖片顯示可能會有色差，但觀察結果主要取決于管中液體是否澄清透明，因此總體不影響對檢測結果的判斷。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施例，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>青島千卓分子生物科技有限公司<120>DNA擴增產物快速檢測方法<130>2016<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>Mycobacteriumtuberculosis<400>1gctgcgtctatcaccattctc21<210>2<211>20<212>DNA<213>Mycobacteriumtuberculosis<400>2cgaccacctcccaaatgaga20<210>3<211>17<212>DNA<213>ArtificialSequence<400>3cgtctctgtacgagact17<210>4<211>17<212>DNA<213>ArtificialSequence<400>4ccatgtctaatgctgat17<210>5<211>112<212>DNA<213>Mycobacteriumtuberculosis<400>5gctgcgtctatcaccattctcgaagggctggaggccgtccgcaaacgtcccggcatgtac60attggctcgaccggtgagcgcggtttacaccatctcatttgggaggtggtcg112<210>6<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<400>6ttttttttttagtctcgtacagagacg27<210>7<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<400>7ttttttttttatcagcattagacatgg27<210>8<211>27<212>DNA<213>Vibrioparahaemolyticus<400>8tcctgagcttaaagagcatgaagacaa27<210>9<211>24<212>DNA<213>Vibrioparahaemolyticus<400>9ggcggcaataatccaatgagtctg24<210>10<211>200<212>DNA<213>Vibrioparahaemolyticus<400>10tcctgagcttaaagagcatgaagacaaggtgctgaactcaaaatcaaaagcactagcatt60agagaaaaagctgtgggaagagctgttcgatctgttaatgcctcatcttgagcaaatgca120aaacttggcttctgccgtttctcagatggacgtgttacaaaatctcgcggaacgcgcaga180ctcattggattattgccgcc200當前第1頁1 2 3