1.一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法,包括將毛囊干細胞誘導分化為原始生殖細胞、將原始生殖細胞再次誘導分化為卵母細胞兩個步驟,其特征在于:
1)將毛囊干細胞誘導分化為原始生殖細胞具體為:
①原始細胞準備:分別提取培養了1-2代綠色熒光轉移基因小鼠的毛囊干細胞與野生型小鼠成纖維細胞,并將野生型小鼠成纖維細胞采用絲裂霉素C處理,然后將毛囊干細胞與處理后的成纖維細胞按照數量比1:1的比例混合后待用;
②選用DMEM高糖培養基作為原始生殖細胞誘導培養基,并在該培養基內加入以DMEM高糖總質量計8%~12%質量分數的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25ng/ml骨形態發生因子、0.20mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸,1.5mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺,0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生長因子, 15ng/ml~25 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子;培養溫度35℃-38℃,濕度不低于80%,環境中CO2濃度4%-6%;
③將步驟①獲得的待用混合細胞植入步驟②準備的原始生殖細胞誘導培養基,然后將培養基放置在培養箱中,按常規方式進行培養8-10天,即獲得誘導分化出的原始生殖細胞;
2)將原始生殖細胞誘導分化為卵母細胞具體為:
①準備卵母細胞誘導培養基:選用DMEM/F12培養基作為卵母細胞誘導培養基,并在培養基內加入以DMEM/F12總質量計12%~18%質量分數的胎牛血清、0.8% ~1.2%質量分數的抗T細胞免疫毒素ITS、1.5%~2.5%質量分數的血清替代物B27、0.8%~1.2%質量分數的青鏈霉素、以DMEM/F12總體積計1200 IU/ml~1800 IU/ml白細胞抑制因子LIF、40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、8ng/ml~12 ng/ml表皮生長因子、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇;培養溫度35℃-38℃,濕度不低于80%,環境中CO2濃度4%-6%;
②將1)中步驟③獲得的原始生殖細胞稀釋至0.8×106個/L ~1.2×106個/L,然后植入24孔板表面并放置在步驟①獲得的卵母細胞誘導培養基中懸浮培養,培養至通過常規方法檢測出現尺寸不低于50μm的大細胞,且該類大細胞呈現典型卵母細胞形態、有類似透明帶結構出現、表達卵母細胞特異基因,則所述大細胞為所需卵母細胞。
2.根據權利要求1所述的一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法,其特征在于:在步驟1)將毛囊干細胞誘導分化為原始生殖細胞和步驟2)將原始生殖細胞誘導分化為卵母細胞之間還增加有原始生殖細胞專向培養步驟,具體為:將1)中步驟③獲得的原始生殖細胞放入專向培養基內進行培養,所述專向培養基具體為:以DMEM高糖培養基作為基礎,其內添加以DMEM高糖總質量計8%~12%質量分數的胎牛血清、15ng/ml~25 ng/ml骨形態發生因子、以DMEM高糖總體積計0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸,1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺,0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生長因子, 30ng/ml~50ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子;培養時間3-5天,溫度35℃-38℃,濕度不低于80%;環境中CO2濃度4%-6%。
3.根據權利要求1所述的一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法,其特征在于:將原始生殖細胞誘導分化為卵母細胞的培養周期為20天-25天。