本發明涉及一種虎奶菇菌絲體自溶蛋白質的制備方法。
背景技術：
虎奶菇,為擔子菌綱側耳科植物虎奶菌的菌核。富含蛋白質、多糖等活性物質和鉀、鈣、鎂等礦質元素。且含有高達77．4％的膳食纖維，因此在食品工業中具有非常廣闊的應用開發前景。目前已報道幺幺狀真菌在自溶過程中會產生細胞溶酶，該酶能降解細胞壁多糖和細胞質物質，此時應用差異蛋白質組學方法希望能夠鑒定出并驗證虎奶菇菌絲體自溶過程出現的關鍵水解酶。為進一步研究虎奶菇菌絲體自溶機制提供依據，雙向電泳技術是目前分離蛋白質的關鍵技術，能夠有效分離高度復雜的蛋白混合物。虎奶菇是大型食用真菌，其體內除含有植物組織的多種次生代謝物質外，還含有大量多糖，其蛋白質提取較其他植物更為困難。
技術實現要素：
本發明提出一種虎奶菇茵絲體自溶蛋白質的制備方法。
一種虎奶菇茵絲體自溶蛋白質的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）將菌種轉移到PDA固體培養基上，置恒溫暗培養箱中，30℃培養7 d，在40℃環境下保存備用；
（2）將上述平板培養基上的菌絲用組織搗碎機搗碎后，吸取培養基體積l％的量接種于GPY培養基中，振蕩培養14 d后，以4800r/min，在4℃環境下離心收集菌絲體，將收集的菌絲體先用自來水沖洗，再用蒸餾水洗滌3次備用；
（3）取l g虎奶菇菌絲置于預冷過的缽體中，加入液氮，快速研磨；待菌絲體成粉末狀時，快速轉移菌絲體至離心管中，加入10 mL丙酮(含10％TCA和0．07％B一巰基乙醇)，搖勻，沉淀過夜，ll 000 r·min。離心30 min后棄上清，以100％丙酮(含0．07％B一巰基乙醇)洗滌沉淀1次，11 000 r·min’1離心30 min后棄上清，再以80％丙酮(含0．07％13一巰基乙醇)洗滌沉淀1次，以ll 000 r·min離心30 min后棄上清液；將沉淀物真空干燥，于-70℃至-20℃環境下保存后備用；
（4）將經溫度處理后的菌絲體濾去，濾液離心取上清，加入1／10體積100％TCA，沉淀過夜，1l 000 r·min離心30 min后棄上清，重復以上操作，收集全部蛋白質沉淀，加入5 mL 80％冷丙酮(含0．07％一巰基乙醇，一20℃預冷)，振蕩．放置-20℃冰箱中5 h后，11 000 r·min離心30min，棄上清，所述沉淀物即為虎奶菇茵絲體自溶蛋白質，將其干燥后儲存于-70℃至-20℃的環境中。
優選地，所述步驟(3)加入10 mL丙酮，所述丙酮含10％TCA和0．07％B一巰基乙醇。
優選地，所述步驟以100％丙酮洗滌沉淀1次步驟中丙酮含有0．07％B一巰基乙醇。
本發明所述方法制備的虎奶菇茵絲體自溶蛋白質，方法簡單，蛋白產產量高，可工業化生產，實用性強。
具體實施方式
實施例1。
一種虎奶菇茵絲體自溶蛋白質的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）將菌種轉移到PDA固體培養基上，置恒溫暗培養箱中，30℃培養7 d，在40℃環境下保存備用；
（2）將上述平板培養基上的菌絲用組織搗碎機搗碎后，吸取培養基體積l％的量接種于GPY培養基中，振蕩培養14 d后，以4800r/min，在4℃環境下離心收集菌絲體，將收集的菌絲體先用自來水沖洗，再用蒸餾水洗滌3次備用；
（3）取l g虎奶菇菌絲置于預冷過的缽體中，加入液氮，快速研磨；待菌絲體成粉末狀時，快速轉移菌絲體至離心管中，加入10 mL丙酮(含10％TCA和0．07％B一巰基乙醇)，搖勻，沉淀過夜，ll 000 r·min。離心30 min后棄上清，以100％丙酮(含0．07％B一巰基乙醇)洗滌沉淀1次，11 000 r·min’1離心30 min后棄上清，再以80％丙酮(含0．07％13一巰基乙醇)洗滌沉淀1次，以ll 000 r·min離心30 min后棄上清液；將沉淀物真空干燥，于-70℃至-20℃環境下保存后備用；
（4）將經溫度處理后的菌絲體濾去，濾液離心取上清，加入1／10體積100％TCA，沉淀過夜，1l 000 r·min離心30 min后棄上清，重復以上操作，收集全部蛋白質沉淀，加入5 mL 80％冷丙酮(含O．07％一巰基乙醇，一20℃預冷)，振蕩．放置-20℃冰箱中5 h后，11 000 r·min離心30min，棄上清，所述沉淀物即為虎奶菇茵絲體自溶蛋白質，將其干燥后儲存于-70℃至-20℃的環境中；
（5）所述步驟(3)加入10 mL丙酮，所述丙酮含10％TCA和0．07％B一巰基乙醇。
實施例2。
一種虎奶菇茵絲體自溶蛋白質的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）將菌種轉移到PDA固體培養基上，置恒溫暗培養箱中，30℃培養7 d，在40℃環境下保存備用；
（2）將上述平板培養基上的菌絲用組織搗碎機搗碎后，吸取培養基體積l％的量接種于GPY培養基中，振蕩培養14 d后，以4800r/min，在4℃環境下離心收集菌絲體，將收集的菌絲體先用自來水沖洗，再用蒸餾水洗滌3次備用；
（3）取l g虎奶菇菌絲置于預冷過的缽體中，加入液氮，快速研磨；待菌絲體成粉末狀時，快速轉移菌絲體至離心管中，加入10 mL丙酮(含10％TCA和0．07％B一巰基乙醇)，搖勻，沉淀過夜，ll 000 r·min。離心30 min后棄上清，以100％丙酮(含0．07％B一巰基乙醇)洗滌沉淀1次，11 000 r·min’1離心30 min后棄上清，再以80％丙酮(含0．07％13一巰基乙醇)洗滌沉淀1次，以ll 000 r·min離心30 min后棄上清液；將沉淀物真空干燥，于-70℃至-20℃環境下保存后備用；
（4）將經溫度處理后的菌絲體濾去，濾液離心取上清，加入1／10體積100％TCA，沉淀過夜，1l 000 r·min離心30 min后棄上清，重復以上操作，收集全部蛋白質沉淀，加入5 mL 80％冷丙酮(含O．07％一巰基乙醇，一20℃預冷)，振蕩．放置-20℃冰箱中5 h后，11 000 r·min離心30min，棄上清，所述沉淀物即為虎奶菇茵絲體自溶蛋白質，將其干燥后儲存于-70℃至-20℃的環境中；
（5）所述步驟(3)加入10 mL丙酮，所述丙酮含10％TCA和0．07％B一巰基乙醇；
所述步驟以100％丙酮洗滌沉淀1次步驟中丙酮含有0．07％B一巰基乙醇。