一種檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針的制作方法

本發明涉及一種用于檢測細胞內半胱氨酸的新型熒光探針，屬于分析化學技術領域。

背景技術：

半胱氨酸（Cys）是一種生物體內常見的氨基酸，是組成蛋白質的20多種氨基酸中惟一具有還原性基團巰基的氨基酸。半胱氨酸除主要分布在肝、脾、腎中外，還大量積聚在人體表面包括皮膚、粘膜等，在生物體內具有強化生物體自身的防衛能力、調整生物體的防御機構生理功能。例如具有抱合作用，實驗證明半胱氨酸對甲醛、氯仿、鉛、鎘、氯甲汞、河豚毒等有毒物質具有一定的解毒作用，并可以有效地預防和治療放射性傷害。半胱氨酸可在皮膚蛋白的角蛋白生成中維持重要的琉基酶的活性，維持皮膚的正常代謝，以及調節表皮最下層的色素細胞生成的底層黑色素。此外，半胱氨酸可改善炎癥、過敏引起的琉基酶活性降低，減緩炎癥和過敏的皮膚癥狀，并具有防止生物體衰老的功能。但是，生物體內半胱氨酸濃度異常時，經常會導致造血功能下降、生長緩慢等。血漿中的半胱氨酸含量較高時，會損害內皮細胞和誘導血管損傷。因此，檢測生物體內的半胱氨酸含量具有很重要的意義。

相比于傳統的電化學方法，熒光成像分析法具有靈敏度高、選擇性好、響應迅速、操作簡單等優點，并且對生物樣品基本沒有損傷，已廣泛用于各種生物體內的小分子檢測。因此開發新的具有高選擇性、高靈敏度、光穩定性及透膜性好，能夠實時快速檢測生物體內半胱氨酸的熒光探針具有重要的意義。

技術實現要素：

針對以上現有技術的不足，本發明提供了一種新型檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針。

本發明提供的檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針為羅丹明衍生物，其特征在于：所述熒光探針的化學結構通式如式（ ）所示，其中丙烯酸酯部分為半胱氨酸的響應位點：

式（）

本發明所述檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針的制備方法為：將式（Ⅱ）所示的化合物 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（2 mmol）、1-羥基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL) 加入到50 mL單口燒瓶中，室溫攪拌16小時，過濾，烘干。將所得固體進行柱層析純化，得到深紅色的產物即為本發明所述檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針。

式（Ⅱ）

本發明所述的熒光探針可應用于細胞內半胱氨酸的檢測評價。該探針作為細胞內半胱氨酸的特異性探針，在半胱氨酸存在的環境下，可以將丙烯酸酯水解為羥基，生成具有高熒光發射能力的熒光物質，通過檢測不同的熒光強度來測定細胞內的半胱氨酸。

具體測定方法為：室溫條件下，配制5 μM熒光探針乙醇溶液，加入到具有不同濃度的半胱氨酸溶液系中，測定溶液熒光強度作為半胱氨酸濃度的評價指標。

本發明所述的熒光探針在半胱氨酸存在的條件下，羅丹明衍生物染料部分的丙烯酸酯水解為羥基，此時熒光探針可以發射羅丹明衍生物染料的紅色熒光（峰值約為630 nm）。可采用熒光檢測器實現產物的快速靈敏檢測；檢測條件為：激發波長為580 nm，在590~700 nm之間進行熒光發射光譜的檢測。

熒光探針在生物成像應用研究的主要內容有探針對活細胞的毒性、染色能力、活細胞和活組織熒光成像。采用MTT比色法，通過分析細胞在加入熒光探針之后的存活率，討論熒光探針對細胞的毒性。在此基礎上，應用本發明所述的熒光探針對活細胞內的半胱氨酸進行快速檢測。

本發明的有益效果為：

本發明所述的檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針可經化學合成獲得，合成工藝簡單易行，原料廉價易得，制備成本低，易于推廣。

本發明所述的檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針具有高特異性，在進行相應半胱氨酸檢測過程中基本不受其他組分的干擾，可用于活細胞內半胱氨酸的實時測定，具有廣闊的應用前景。

本發明所述的檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針靈敏度高，具有良好的熒光發射光譜特性（590~700 nm），可以實現對細胞中的半胱氨酸快速準確檢測的目的。

附圖說明

圖1是熒光探針的¹H NMR圖譜。

圖2是熒光探針在不同濃度半胱氨酸條件下的熒光光譜。

圖3是熒光探針與半胱氨酸濃度的線性關系數據。

圖4是熒光探針與不同物質反應后的熒光光譜。

圖5是熒光探針在活細胞中的成像應用。

A圖：只加10 μM探針的細胞明場照片；B圖：只加10 μM探針的細胞紅色通道熒光照片；C圖：A圖和B圖的疊加照片；D圖：加入10 μM探針和50 μM半胱氨酸的細胞明場照片；E圖：加入10 μM探針和1 mM N-乙基馬來酰亞胺（NEM）的細胞紅色通道熒光照片；F圖：D圖和E圖的疊加照片。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明做進一步說明，但本發明保護內容不僅限于此。

實施例1

本發明所述檢測癌細胞內半胱氨酸的熒光探針的制備

將式（Ⅱ）所示的化合物（1 mmol）、(1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（2 mmol）、1-羥基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL) 加入到50 mL單口燒瓶中，室溫攪拌16小時，冷卻至室溫，加入到水中，過濾，烘干。將所得固體進行柱層析(二氯甲烷:甲醇 = 15:1 ) 純化，得到深紅色產物，即為本發明所述檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針，產率43%。

上述檢測細胞內半胱氨酸的熒光探針的¹H NMR圖譜見圖1。

實施例2

本發明所述熒光探針在不同半胱氨酸濃度下的熒光光譜

采用半胱氨酸在水溶液中供應半胱氨酸。預先準備10份5mL的 5 μM探針緩沖溶液，含5%甲醇，所加入的半胱氨酸濃度為0到150 μM。然后進行熒光檢測（λ_Ex = 580 nm）；計算各體系中熒光強度；通過分析630 nm處的熒光強度與半胱氨酸濃度的關系，評估該探針對半胱氨酸的響應性能（見圖2和圖3）。圖2表明，隨著半胱氨酸濃度的增大，溶液的熒光強度逐漸增強。圖3表明，當硫化鈉濃度在40~200 μM范圍內，溶液的熒光強度和半胱氨酸的濃度呈較好的線性關系，可采用公式Y = 23.7 * X – 95.1表示，其中Y為630 nm出的熒光強度，X為半胱氨酸的濃度。

實施例3

熒光探針與不同物質反應后的熒光光譜

預先準備10份5mL的 5 μM探針緩沖溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，然后分別向該體系中依次加入50 μL濃度為200 μM的Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、Cys、GSH、NaNO₂、VC等小分子的PBS溶液。然后進行熒光檢測（λ_Ex= 580 nm）；計算各體系中熒光強度；評估該不同物質對熒光探針溶液的干擾性（見圖4）。從圖中看出，當然探針溶液中加入Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、GSH、NaNO₂、VC等小分子時，只有半胱氨酸可以導致溶液產生顯著的熒光，而加入其他小分子時溶液的熒光基本沒有變化，這表示該探針只對半胱氨酸有響應，而基本不受其他小分子的干擾。

實施例4

熒光探針在活細胞中的成像應用

將Hela細胞放在培養基(DMEM培養液和10%胎牛血清)中，放置于條件為37℃、5% CO₂和20% O₂的培養箱中培養24 -48h。用微量進樣器吸取本發明所述熒光探針(10 μM)注入含有Hela細胞的培養基中，繼續在培養箱中培養30 min。加入1 mM N-乙基馬來酰亞胺（NEM）溶液，繼續培養30 min。之后用PBS (磷酸鹽緩沖溶液)沖洗培養細胞3次，進行熒光成像。

結果見圖5。從A、B和C圖中看出，只加入探針時，細胞有紅色熒光；從D、E和F圖中看出， 1 mM N-乙基馬來酰亞胺（NEM）之后，再加入10 μM探針，細胞無明顯的熒光產生，這表示該探針可用于檢測癌細胞中的半胱氨酸。