一種高胞內靈芝三萜含量的靈芝菌絲體發酵工藝的制作方法

本發明屬于生物
技術領域：
，更具體地，涉及一種高胞內靈芝三萜含量的靈芝菌絲體發酵工藝。
背景技術：
：靈芝三萜是在靈芝中發現的一類三萜類化合物，也就是說靈芝三萜是靈芝的主要化學和藥效成分。靈芝中所含靈芝三萜具有特別顯著的生理活性。在高度競爭的社會中，過度緊張的工作，生活方式的改變或因環境污染，導致對人體健康的嚴重損害，靈芝三萜有巨大的應用價值。對靈芝生理生化過程的研究表明，三萜類化合物(靈芝酸)屬于靈芝的二級代謝物。在靈芝生理生態和生活史研究中發現，菌絲體由一次菌絲、二次菌絲到三次菌絲后，才能紐結產生子實體。菌絲體期間只能累積足夠的三萜類化合物(靈芝酸)的前結構物質，而后才能出菇(即由無性繁殖轉為有性繁殖)，而產生子實體。在子實體的成熟過程中，三萜類物質才得以生物化合完善，成為具有生理活性的三萜類成分。可以說：靈芝三萜類是靈芝菌絲體一、二級代謝產物。所以，凡是靈芝菌絲體發酵制成的產品，由于沒有經過子實體后期——成熟過程，三萜類化合物含量幾乎沒有或非常非常微小。然而子實體人工大量繁殖難度較大，因此工業上量產靈芝三萜的主要問題是如何提高靈芝菌絲體液體發酵的胞內靈芝三萜含量。然而靈芝子實體培養難以大規模生產，因此開發經濟、安全、容易提取、純化從而適應工業化大規模生產的靈芝菌絲體發酵工藝，具有重要意義。技術實現要素：針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種靈芝菌絲體發酵工藝，其目的在于采用變溫控制和光照處理相結合的刺激，提高靈芝菌絲體胞內靈芝三萜含量，由此解決現有的靈芝三萜生產工藝中靈芝菌絲體發酵胞內靈芝三萜含量低、難以提取純化、不適應大規模生產的技術問題。為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種靈芝菌絲體發酵工藝，其特征在于，包括以下步驟：靈芝菌絲體種子培養階段以及擴大培養階段；所述擴大培養階段持續5至7天；其中每天配合變溫環境對靈芝菌絲體進行光照處理，具體如下：在光照條件下培養4小時至16小時，在變溫條件下培養1至3小時，所述變溫條件為避光且維持高溫或低溫。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述高溫在32℃至36℃之間；所述低溫在6℃至10℃之間。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述擴大培養階段第三天至結束，采用添加有誘導劑的培養基進行培養。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述誘導劑為木材降解物。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述誘導劑為D-半乳糖。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述擴大培養階段采用CYM培養基。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述CYM培養基每升含有：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述擴大培養階段第三天至結束，采用的CYM培養基含有質量份數0.25％至1％的D-半乳糖。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述種子培養階段采用多級種子發酵培養。優選地，所述靈芝菌絲體發酵工藝，其所述多級種子發酵培養具體步驟如下：(1)采用PDA液體培養基活化靈芝菌絲體，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養5至7天，獲得一級種子液；(2)將步驟(1)中獲得的一級種子液按照接種量體積比1:5，接種于第一靈芝種子培養基中，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養5天，獲得二級種子液；(3)將步驟(2)中獲得的二級種子液按照接種量體積比1:10，接種于第二靈芝種子培養基中，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養2天，獲得三級種子液。(4)將步驟(3)中獲得的三級種子液按照接種量體積比1:10，接種于CYM培養基中，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養1天，獲得靈芝菌絲體液體發酵體系。總體而言，通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，實現了靈芝胞內三萜含量的高水平積累，能夠在無需添加任何有害外源物質的前提下，廉價、安全、易操作，可顯著提高胞內靈芝三萜含量，適用于工業化生產靈芝三萜。同時本方法為菌絲體培養，相對于其他靈芝三萜生產方法，本工藝適合大規模生產，同時提純方便，適合工業化生產。優選方案，結合誘導劑，進一步提高了靈芝菌絲體胞內靈芝三萜的含量。附圖說明圖1是本發明提供的實施例1效果圖；圖2是本發明提供的實施例2效果圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。本發明提供的靈芝菌絲體發酵工藝，包括：靈芝菌絲體種子培養階段以及擴大培養階段：種子培養階段，優選采用多級種子發酵培養，使得靈芝菌絲體能充分生長形成長勢良好適應能力強的靈芝菌絲體液體發酵體系，適應擴大培養階段的變溫處理及光照處理，具體步驟如下：(1)采用PDA液體培養基活化靈芝菌絲體，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養5至7天，獲得一級種子液；其中，每升所述PDA液體培養基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃滅菌25至40分鐘。(2)將步驟(1)中獲得的一級種子液按照接種量體積比1:5，接種于第一靈芝種子培養基中，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養5天，獲得二級種子液；每升所述第一靈芝種子培養基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氫鉀0.883g、七水硫酸鎂0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌25至40分鐘。(3)將步驟(2)中獲得的二級種子液按照接種量體積比1:10，接種于第二靈芝種子培養基中，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養2天，獲得三級種子液；每升所述第二靈芝種子培養基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀1.0g、七水合磷酸二氫鉀0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌25至40分鐘。(4)將步驟(3)中獲得的三級種子液按照接種量體積比1:10，接種于CYM培養基中，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養1天，獲得靈芝菌絲體液體發酵體系。每升所述CYM培養基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。擴大培養階段：采用光照和變溫刺激靈芝菌絲體，培養所述靈芝菌絲體液體發酵體系，持續5至7天；其中每天配合變溫環境對靈芝菌絲體進行光照處理，具體如下：在光照條件下培養4小時至16小時，在變溫條件下培養1至3小時，其他時間進行25℃至28℃避光條件下培養。所述變溫條件為避光維持高溫或低溫；所述高溫在32℃至36℃之間，所述低溫在6℃至10℃之間，優選8℃。擴大培養階段，采用CYM培養基，每升所述CYM培養基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。優選方案，在擴大培養第三天起至發酵結束，采用添加有誘導劑的培養基進行培養，所述誘導劑優選為木材降解物，例如微晶纖維素、D-半乳糖、D-鼠李糖；優選D-半乳糖，能溶于水，便于靈芝菌絲體的分離以及靈芝三萜的提取和純化。該階段，優選采用的CYM培養基含有質量份數0.25％至1％的D-半乳糖。目前一般認為靈芝菌絲體擴大培養階段不需要光照，光照可能影響目前普遍認為食藥用真菌營養生長階段不需要光誘導，一般在黑暗中進行，如上海交通大學鐘建江教授在《SignificanceoffungalelicitorsontheproductionofganodericacidandGanodermapolysaccharidesbythesubmergedcultureofmedicinalmushroomGanodermalucidum》中采用暗培養，另外也在田雪梅等人的文獻中涉及到光質對靈芝生長的影響，指出不論何種光質光量,都對靈芝MP-01菌株菌絲生長有一定的負面作用。僅采用光照處理對靈芝菌絲體體內靈芝三萜含量影響不明顯，同時抑制菌絲體生長，因此總靈芝三萜產量增長不多，甚至不增長或者負增長。本發明結合光照和變溫處理，刺激靈芝菌絲體大量積累靈芝三萜，產量增長在50％以上。優選方案，添加誘導劑的情況下，產量增長達到90％。同時該工藝靈芝菌絲體分離容易，靈芝三萜提取純化工藝簡單，肥腸適合大規模工業化應用。以下為實施例：實施例1靈芝菌絲體發酵工藝，包括：靈芝菌絲體種子培養階段以及擴大培養階段：種子培養階段，采用多級種子發酵培養，具體步驟如下：(1)采用PDA液體培養基活化靈芝菌絲體，28℃至30℃，搖床轉速120-150r/min培養7天，獲得一級種子液；其中，每升所述PDA液體培養基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃滅菌40分鐘。(2)將步驟(1)中獲得的一級種子液按照接種量體積比1:5，接種于第一靈芝種子培養基中，28℃至30℃，搖床轉速150r/min培養5天，獲得二級種子液；每升所述第一靈芝種子培養基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氫鉀0.883g、七水硫酸鎂0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌40分鐘。(3)將步驟(2)中獲得的二級種子液按照接種量體積比1:10，接種于第二靈芝種子培養基中，28℃至30℃，搖床轉速150r/min培養2天，獲得三級種子液；每升所述第二靈芝種子培養基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀1.0g、七水合磷酸二氫鉀0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌25至40分鐘。(4)將步驟(3)中獲得的三級種子液按照接種量體積比1:10，接種于CYM培養基中，28℃至30℃，搖床轉速150r/min培養1天，獲得所述靈芝菌絲體液體發酵體系。每升所述CYM培養基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌40分鐘。擴大培養階段：采用光照和變溫刺激靈芝菌絲體，培養所述靈芝菌絲體液體發酵體系，持續6天；其中每天配合變溫環境對靈芝菌絲體進行光照處理，具體如下：在光照條件下培養4小時至16小時，在變溫條件下培養1至3小時，其他時間進行25℃至28℃避光條件下培養。培養條件如表1所示，擴大培養階段，采用CYM培養基，每升所述CYM培養基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。表1例如實驗1的具體操作步驟為：每天3小時在8℃避光條件下發酵，8小時在光照條件、常溫度即28℃至30℃條件下發酵，剩余13小時在避光、常溫度即28℃至30℃條件下發酵；如此循環培養共計144小時。發酵結束后，用布氏漏斗收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定靈芝三萜含量。取烘干的菌絲粉0.1g，置于試管中加入95％乙醇5ml，在超聲破碎儀中超聲破碎40min(重復3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸餾水懸浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞試管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混勻，70℃水浴25min，取出冰上冷卻5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表2、圖1。與比較例相比含量增加明顯，靈芝三萜含量增加百分比見表2。表2實驗編號胞內靈芝三萜含量mg/0.1DW含量提高百分比％12.55606527.068422.373338.794932.41006312.4681542.66498837.9606552.4494616.407962.82257853.7196572.77854549.316482.74957646.4195392.79013350.47515對比例2.2853810實施例2靈芝菌絲體發酵工藝，包括：靈芝菌絲體種子培養階段以及擴大培養階段：種子培養階段：步驟具體同實施例1。擴大培養階段：采用光照和變溫刺激靈芝菌絲體，培養所述靈芝菌絲體液體發酵體系，持續6天；其中每天配合變溫環境對靈芝菌絲體進行光照處理，具體如下：在光照條件下培養4小時至16小時，在變溫條件下培養2小時，其他時間進行25℃至28℃避光條件下培養。培養條件如表3所示，擴大培養階段，采用CYM培養基，每升所述CYM培養基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。第三天至結束，在所述CYM培養基中添加誘導劑D-半乳糖，質量分數如表3所示，結果如圖1所示。表3例如實驗1的具體操作步驟為：每天2小時在8℃避光條件下發酵，8小時在光照條件、常溫度即28℃至30℃條件下發酵，剩余14小時在避光、常溫度即28℃至30℃條件下發酵；在培養的第三天加入0.5％的D-半乳糖進行發酵，如此循環培養共計144小時。發酵結束后，用布氏漏斗收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定靈芝三萜含量。取烘干的菌絲粉0.1g，置于試管中加入95％乙醇5ml，在超聲破碎儀中超聲破碎40min(重復3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸餾水懸浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞試管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混勻，70℃水浴25min，取出冰上冷卻5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表4、圖2所示。與比較例相比含量增加明顯，靈芝三萜含量增加百分比見表4。表4實驗編號胞內靈芝三萜含量mg/0.1DW含量提高百分比％12.98410852.0882122.7963942.5209932.72338938.800443.71759689.4712453.00496553.1512363.50554578.6638272.73034139.1547483.36649571.5769993.57159482.03007對比例1.962090其中對比例種子培養階段與本例方法相同，擴大培養階段條件為：避光條件下常溫即28℃至30℃培養144小時，采用CYM培養基。本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3