一種生產低聚木糖和抗菌肽的益生飼用釀酒酵母的制作方法

本發明涉及基因工程和發酵工程等領域，更具體地，涉及一種生產低聚木糖和抗菌肽的益生飼用釀酒酵母。
背景技術：
：麥稈、谷殼、糠麩等農副產品含有抗營養因子——木聚糖，它是由β-1，4-糖苷鍵連接而成的木糖聚合物，是構成細胞壁的主要成分之一。木聚糖酶則是能夠降解木聚糖的最主要酶之一，如果將木聚糖酶加以合理利用，則可提高木質纖維素的利用率。而木聚糖則是飼料中主要抗營養因子之一。通過在日糧中添加木聚糖酶就是其中比較簡便而有效的方法。木聚糖酶可將木聚糖水解為木二糖和木二糖以上的低聚木糖，以及少量木糖和阿拉伯糖，因而消除木聚糖的抗營養作用。木聚糖經木聚糖降解酶降解產物——低聚木糖(xylo-oligosaccharides，XOs)又稱木寡糖，是由2～7個木糖以β-1，4-糖苷鍵結合而成的直鏈低聚糖的總稱，其有效成分一般為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等，其中以木二糖(xylobiose，X2)和木三糖(xylotriose，X3)為主。目前，用于飼料添加劑的功能性低聚糖主要有低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚甘露糖以及低聚木糖等，其中效果最好的是低聚木糖。低聚木糖相比其他低聚糖，具有以下優點：①高選擇性促進雙歧桿菌增殖；②不易被體內的消化酶消化；③攝入量少、配伍性好，可與其他成分配伍而不被影響；④對酸和熱等穩定。同時，低聚木糖還具有如下益生作用：①調節腸道菌群結構；②抑制病原菌的繁殖、減少有害物質的產生；③提高機體的免疫力；④促使機體合成其他營養物質。本發明通過釀酒酵母系統將木聚糖降解酶類進行表達，可補充木聚糖酶等，并輔助降解木聚糖獲得功能性低聚木糖，發揮益生作用；同時將具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌特點及抑殺致病菌、擇性免疫激活和調節功能的抗菌肽基因進行共表達，實現多種功能協同促進。因而，發明中重組釀酒酵母將應用到飼料添加、動物養殖以及餐廚廢棄物降解中，可以有效發揮其協同作用，發揮益生作用。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是，為了克服現有技術的上述不足，提供一種能分泌等木聚糖降解酶及抗菌肽，能夠應用酵母培養物、木聚糖降解等領域等中的益生飼用的基因重組酵母。本發明所要解決的技術問題是，為了克服現有技術的上述不足，提供一種能夠應用酵母培養物、木聚糖降解等領域等中能分泌β-1,4-內切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase)基因、β-木糖苷酶(β-xylosidase)基因等木聚糖降解酶及抗菌肽基因同時連入釀酒酵母表達載體pTEGC-BsmBI，轉入釀酒酵母，并成功分泌表達，獲得降解木聚糖生產低聚木糖和分泌抗菌肽的多功能重組釀酒酵母。本發明的目的在于提供一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體及其構建方法。本發明的另一目的在于提供一種能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母及其構建方法。本發明所采取的技術方案是：一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體，該載體中含有β-1,4-內切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因、抗菌肽基因；所述β-1,4-內切木聚糖酶基因的堿基序列如SEQIDNO：1所示；所述β-1,4-木糖苷酶基因的堿基序列如SEQIDNO：2所示。進一步的，所述抗菌肽基因選自東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T、異色瓢蟲抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T、鯰魚抗菌肽突變體、脆皮蛙抗菌肽突變體Lf-cath-T；所述東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T的堿基序列如SEQIDNO：3所示；所述異色瓢蟲抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T的堿基序列如SEQIDNO：4所示；所述鯰魚抗菌肽突變體的堿基序列如SEQIDNO：5所示；所述脆皮蛙抗菌肽突變體Lf-cath-T的堿基序列如SEQIDNO：6所示。進一步的，所述抗菌肽基因上游存在α-信號肽基因序列，α-信號肽基因的堿基序列如SEQIDNO：7所示。進一步的，所述β-1,4-內切木聚糖酶基因的啟動子為pgk1-1，其堿基序列如SEQIDNO：8所示，終止子為pgkt1-1，其堿基序列如SEQIDNO：9所示；所述β-1,4-木糖苷酶基因的啟動子為pgk1-2，其堿基序列如SEQIDNO：10所示，終止子為pgkt1-2，其堿基序列如SEQIDNO：11所示；所述抗菌肽基因的啟動子為pgk1-3，其堿基序列如SEQIDNO：12所示，終止子為pgkt1-3，其堿基序列如SEQIDNO：13所示。進一步的，上述載體的篩選基因中含有G418抗性基因。進一步的，上述載體的骨架為pGAPZaA質粒。進一步的，上述載體中含有釀酒酵母菌的25srDNA基因片段，其堿基序列如SEQIDNO：15所示。一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母，該重組釀酒酵母基因組中插入有上述任一所述的多基因共表達載體。上述任一所述一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體的構建方法，包括以下步驟：S1整合表達載體pTEGC-BsmBI構建：S1.1將G418抗性基因連入pGAPZaA質粒載體的多克隆位點MscI和EcoRV之間，獲得載體pGAPZaA-G418；S1.2將堿基序列如SEQIDNO：15所示的rDNA基因序列的連入載體pGAPZaA-G418多克隆位點BamHI和EcoRI之間，獲得載體pGAPZaA-G418-rDNA；S1.3將載體pGAPZaA-G418-rDNA經BglII和EcoRI雙酶切后，回收大片段產物，得到線性化載體pTEGC，將堿基序列如SEQIDNO：16所示的BsmBI-2片段與線性化載體pTEGC連接，得整合表達載體pTEGC-BsmBI；S2啟動子、終止子的擴增S2.1啟動子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別用引物對PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分別擴增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3啟動子片段；S2.2終止子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別用引物對PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分別擴增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3終止子片段；S3α-信號肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的獲得S3.1含BsmBI酶切位點的β-1,4-內切木聚糖酶基因的獲得：以含β-1,4-內切木聚糖酶基因序列的T載體為模板，通過引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI進行擴增，得xynA1基因片段，即含有β-1,4-內切木聚糖酶基因的片段；S3.2含BsmBI酶切位點的β-1,4-木糖苷酶基因的獲得：以含β-1,4-木糖苷酶基因序列的T載體為模板，通過引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI進行擴增，得xyl-1基因片段，即含有β-1,4-木糖苷酶基因的片段；S3.3α-信號肽-抗菌肽基因的獲得：分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含抗菌肽的T載體為模板，通過重疊延伸PCR將α-信號肽序列定向連入無信號肽的抗菌肽基因的5’端，擴增出mfa-amp基因片段，即含有α-信號肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段；所述重疊延伸PCR過程中，通過引物將擴增產物mfa-amp的兩端引入切割方向相反的BsmBI的切割序列；S4釀酒酵母多基因共表達載體的構建將上述獲得的β-1,4-內切木聚糖酶基因表達盒元件pgk1-1、xynA1、pgkt1-1；β-1,4-木糖苷酶基因表達盒元件pgk1-2、xyl-1、pgkt1-2；抗菌肽基因表達盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性內切酶BsmBI進行酶切，純化回收；同時，利用IIs型限制性內切酶BsmBI切割上述整合表達載體pTEGC-BsmBI，將其線性化；將所用這些片段通過一步法定向連入線性化的整合表達載體pTEGC-BsmBI中，即得釀酒酵母多基因共表達載體；上述所述引物的堿基序列如下：PGK1F1-BsmBI：CGTCTCAgatcGAAGTACCTTCAAAGPGK1R1-BsmBI：CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAAPGK1F2-BsmBI：CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAGPGK1R2-BsmBI：CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAAPGK1F3-BsmBI：CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAGPGK1R3-BsmBI：CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAAPGKT1F1-BsmBI：CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R1-BsmBI：CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAGPGKT1F2-BsmBI：CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R2-BsmBI：CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAGPGKT1F3-BsmBI：CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R3-BsmBI：CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAGxynF-BsmBI：CGTCTCAgctaATGAAGGTTACTGCTGCTxynR-BsmBI：CGTCTCAgtacTTAAGAAGAGATAGTAACAxylF-BsmBI：CGTCTCAgcatATGCCAGGTGCTGCTTCTATCGTTGCTxylR-BsmBI：CGTCTCAtacgTTATTGTGGAGCGATCAATTGTTCT。一種能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建方法，將上述構建的釀酒酵母多基因共表達載體轉化釀酒酵母宿主，篩選出陽性單克隆菌落，并測序驗證正確，即得能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母。本發明的有益效果是：本發明基因重組釀酒酵母是可以同時分泌出木聚糖降解相關酶類，如β-1,4-內切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶，以及抗菌肽的多功能重組酵母。其中β-1,4-內切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶能夠輔助降解木聚糖生成的低聚木糖(木糖)是重要的益生元，能夠促進機體內腸道中益生菌的增殖；同時還可以補充機體中木聚糖酶的不足。而選取的抗菌肽也可以抑制雜菌或致病菌。因而其應用產品如酵母培養物等，能夠更有效促進機體的免疫力提高，促進機體的生長，也可以應用到餐廚廢棄物降解中，促進廢棄物中半纖維素成分的降解和雜菌的生長。可以應用到飼料添加、動物養殖以及餐廚廢棄物降解利用等多個領域。附圖說明圖1為剛果紅染色法驗證實施例2構建的重組釀酒酵母的木聚糖酶活性。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例1整合表達載體pTEGC-BsmBI構建一、整合表達載體pTEGC-BsmBI構建1)G418抗性基因的獲得PCR擴增目的基因，以載體pPIC9k為模板，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物(表1)擴增G418抗性基因。PCR反應條件：98℃10s，55℃15s，72℃50s，30個循環，72℃10min。經2％瓊脂糖凝膠電泳驗證。目的基因回收、純化、轉化大腸桿菌、驗證、送樣測序。回收純化目的片段，保存于-20℃備用。將得到的G418抗性基因與T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α菌株，37℃培養，提取其質粒DNA，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物進行菌落PCR篩選陽性菌株，將陽性克隆送至英濰捷基測序驗證基因的正確性。測序結果表明：G418抗性基因及其酶切位點正確連入T載，未發生突變，G418抗性基因的堿基序列如SEQIDNO：14所示。表1擴增G418抗性基因引物注：下劃線處字母為限制性內切酶的識別/切割序列。2)載體pGAPZaA-G418的構建在37℃下，利用限制性內切酶MscI和EcoRV切割pGAPZaA質粒，并在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳驗證；利用限制性內切酶切割MscI和EcoRV切割pMD-G418載體，獲得G418抗性基因，在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳驗證；回收純化上述酶切產物中的pGAPZaA載體、G418抗性基因，利用T4連接酶將G418抗性基因連入載體pGAPZaA，獲得載體pGAPZaA-G418。3)rDNA基因擴增以釀酒酵母基因組DNA為模板，采用引物rDNAF和rDNAR引物(見表2)PCR擴增rDNA基因；PCR擴增條件為：98℃10s，55℃15s，72℃60s，30個循環，72℃10min；在1％瓊脂糖凝膠電泳驗證，并在上下游分別引入EcoRI和BamHI酶切位點。將得到的rDNA基因與T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α菌株，37℃培養，提取其質粒DNA，利用rDNAF和rDNAR引物進行菌落PCR篩選陽性菌株。測序結果表明：rDNA基因及其酶切位點正確連入T載，未發生突變，rDNA基因的堿基序列如SEQIDNO：15所示。表2擴增rDNA基因引物注：下劃線處字母為限制性內切酶的識別/切割序列。4)載體pGAPZaA-G418-rDNA構建利用限制性內切酶BamHI和EcoRI分切下上述T載體上的rDNA片段、切割質粒pGAPZaA-G418，回收純化pGAPZaA-G418載體骨架，利用T4連接酶將rDNA連入線性化后的載體pGAPZaA-G418，獲得重組載體pGAPZaA-G418-rDNA。5)整合表達載體pTEGC-BsmBI構建限制性內切酶切割BglII和EcoRI切割質粒pGAPZaA-G418-rDNA，切除該載體上BglII到EcoRI酶切位點間的GAP啟動子、a-信號肽等序列，回收大片段產物，得到線性化載體pTEGC。以pMD19-Tsimple載體為模板，通過引物PMDF-BsmBI和PMDR-BsmBI(見表3)擴增出含有2個BsmBI酶切位點識別序列，約233bp的片段BsmBI-2，連入T載體，送至英濰捷基測序，測序正確，未發生突變，BsmBI-2的堿基序列如SEQIDNO：16所示。利用限制性內切酶切割BglII和EcoRI切下重組后的T載體，回收約233bp的DNA片段BsmBI-2，然后利用T4連接酶將其正確連入線性化載體pTEGC，獲得整合表達載體pTEGC-BsmBI。表3擴增含BsmBI骨架DNA引物注：下劃線處的大寫字母為BglII或EcoRI酶切位點；小寫字母為IIs型限制性內切酶BsmBI酶的識別序列。二、啟動子、終止子的擴增1)啟動子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI引物(見表4)擴增出pgk1-1啟動子片段(其堿基序列如SEQIDNO：8所示)，用作表達β-1,4-內切木聚糖酶基因的啟動子。同理，以釀酒酵母基因DNA為模板，利用PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI引物(見表4)擴增出pgk1-2啟動子片段(其堿基序列如SEQIDNO：10所示)，用作表達β-1,4-木糖苷酶基因的啟動子。同理，以釀酒酵母基因DNA為模板，利用PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI引物(見表4)擴增出pgk1-3啟動子片段(其堿基序列如SEQIDNO：12所示)，用作表達抗菌肽基因的啟動子。上述擴增所得啟動子基因片段均分別連入到pMD19-TSimple載體中，測序驗證，保留正確的陽性克隆。2)終止子的擴增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI(見表4)擴增pgkt1-1終止子(其堿基序列如SEQIDNO：9所示)，用于表達β-1,4-內切木聚糖酶基因的終止子。以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI(見表4)擴增pgkt1-2終止子(其堿基序列如SEQIDNO：11所示)，用于表達β-1,4-木糖苷酶基因的終止子。以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI(見表4)擴增pgkt1-3終止子(其堿基序列如SEQIDNO：13所示)，用于表達抗菌肽基因的終止子。上述擴增得到終止子基因片段均連入到pMD19-TSimple載體中，測序驗證，保留正確的陽性克隆。表4擴增釀酒酵母啟動子、終止子的引物注：下劃線處大寫字母為IIs型限制性內切酶BsmBI的識別序列，下劃線小寫粗體字母為IIs型限制性內切酶BsmBI的切割序列。三、α-信號肽基因、β-1,4-內切木聚糖酶基因(xynA1)、β-1,4-木糖苷酶基因(xyl-1)以及抗菌肽基因(amp)的獲得1)α-信號肽基因的獲得：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用MfaF和MfaR引物(見表5)擴增得到Mfa-BsmBI(即含有α-信號肽基因序列的片段是嗎？)片段，擴增程序如下：98℃10s，55℃15s，72℃30s，30個循環，72℃10min；連入T載體，送樣測序，挑選正確的陽性克隆，從而將α-信號肽基因(其堿基序列如SEQIDNO：7所示)保存至T載體中。表5擴增α-信號肽基因、β-1,4-內切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因和抗菌肽基因的引物注：下劃線處大寫字母為IIs型限制性內切酶BsmBI的識別序列，下劃線處小寫粗體字母為IIs型限制性內切酶BsmBI的切割序列。2)β-1,4-內切木聚糖酶基因的獲得：通過人工合成優化后的β-1,4-內切木聚糖酶基因xynA1的堿基序列如SEQIDNO：1所示。3)β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1的獲得：通過人工合成優化后的β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1的堿基序列如SEQIDNO：2所示；4)抗菌肽基因的獲得：本研究選用的抗菌肽有以下4種：人工合成優化后的東方鈴蟾Bombinaorientalis的抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T(堿基序列如SEQIDNO：3所示)，BLP-2-T的氨基酸序列為GIGSKILSAGKGALKGLAKGLAEHFAN(SEQIDNO:45)；人工合成優化后的異色瓢蟲Harmoniaaxyridis的抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T(堿基序列如SEQIDNO：4所示)，Haxy-Col1-T的氨基酸序列為SLQGGAPNFPQPGQEKQEGWKFDPSLTRGEDGNTRGSINIHHTGPNHEVGANWDKVIRGPNKAKPTYSIHGSWRW(SEQIDNO:46)；人工合成優化后的鯰魚抗菌肽突變體，其氨基酸序列為KGRGKQGGKVRKSS(SEQIDNO:47)，堿基序列如SEQIDNO：5所示；人工合成優化后的脆皮蛙的抗菌肽突變體Lf-cath-T(堿基序列如SEQIDNO：6所示)，Lf-cath-T的氨基酸序列為GKCNVLGQRKQLLRSIGSGSHIGSVVLPRG(SEQIDNO:48)。本實施例選用東方鈴蟾的抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T作為抗菌肽，用于后續釀酒酵母多基因共表達載體的構建。將上述所得β-1,4-內切木聚糖酶基因(xynA1)、β-1,4-木糖苷酶基因(xyl-1)、抗菌肽基因序列分別保存于pMD19-TSimple質粒中，備用。5)含BsmBI酶切位點的β-1,4-內切木聚糖酶基因片段：以含β-1,4-內切木聚糖酶基因片段(xynA1)的T載體為模板，用特異引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI(見表5)進行擴增，獲得含有BsmBI的切割位點的β-1,4-內切木聚糖酶基因片段xynA1。6)含BsmBI酶切位點的β-1,4-木糖苷酶基因片段：以含β-1,4-木糖苷酶基因片段的T載體為模板，用特異引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI(見表5)進行擴增，獲得含有BsmBI的切割位點的β-1,4-木糖苷酶基因片段xyl-1。7)α-信號肽-抗菌肽基因的獲得：分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T基因的T載體為模板，用引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampR、Mfa-ampF以及Mfa-ampR-BsmBI(見表5)通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)將α-信號肽序列定向連入無信號肽的抗菌肽基因的5’端，擴增出mfa-blp基因片段(含有α-信號肽基因序列和抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T基因)。上述擴增得到基因片段均連入到pMD19-Simple載體中，測序驗證，保留正確的陽性克隆。四、能生產低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達載體的構建將上述“二”和“三”中獲得的β-1,4-內切木聚糖酶基因表達盒元件pgk1-1(啟動子)、xynA1(含有β-1,4-內切木聚糖酶基因xynA1)、pgkt1-1(終止子)；β-1,4-木糖苷酶基因表達盒元件pgk1-2(啟動子)、xyl-1(含有β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1)、pgkt1-2(終止子)；抗菌肽基因表達盒元件pgk1-3(啟動子)、mfa-blp(含有α-信號肽基因序列和抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T基因)、pgkt1-3(終止子)利用IIs型限制性內切酶BsmBI分別從T載體切下，純化回收；同時，利用IIs型限制性內切酶BsmBI切割上述“一”中構建的整合表達載體pTEGC-BsmBI，將其線性化。利用T4連接酶將上述片段一次連接反應定向連入整合表達載體pTEGC-BsmBI，獲得釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-xynA1-xyl-1-blp，轉化大腸桿菌DH5a，挑選轉化子，測序驗證，獲得正確連接的陽性轉化子，提取質粒，即得能生產低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達載體pTEGC-xynA1-xyl-1-blp。實施例2能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母一、重組釀酒酵母的篩選與驗證在釀酒酵母進行電轉化之前，對釀酒酵母進行抗性篩選標記G418的敏感性實驗，結果發現在G418濃度為200μg/ml的YPD平板上酵母被抑制不能生長，選取200μg/ml以上的抗性濃度進行篩選，如300μg/ml。將實施例1構建的釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-xynA1-xyl-1-blp用限制性內切酶HpaI線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉化法轉入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養48h以上，挑取長出的單菌落為轉化子。經PCR驗證后的轉化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉化子，即得能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母，簡稱為Glam-x1。二、重組釀酒酵母Glam-x1的木聚糖酶活性檢測1)剛果紅染色法鑒定重組釀酒酵母的木聚糖酶活性實驗方法：將本實施例構建的重組釀酒酵母Glam-x1轉接含1％木聚糖的YP(配方如下：5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨)瓊脂平板中，培養72h以上。然后，加入10mL0.1％剛果紅染色液，常溫染色40min，再用1MNaCl溶液脫色30min，觀察水解圈。實驗結果：觀察結果如圖1所示，從中可以看出，本實施例構建的重組釀酒酵母的不同單克隆周圍均有明顯的水解圈出現，說明本實施例構建的重組釀酒酵母具有很好的木聚糖酶活性。2)DNS法測定重組釀酒酵母的木聚糖酶活性及pNP法測定重組釀酒酵母β-木糖苷酶活性實驗方法：參考國標GB/T23874-2009飼料添加劑木聚糖酶活力測定對本實施例構建的重組釀酒酵母Glam-x1的木聚糖酶酶活進行測定；重組酵母Glam-x1的β-木糖苷酶酶活測定參考LackeAH的方法：吸取200μL用50mmol/LpH7.0磷酸緩沖溶液配制的5mmol/L底物(pNP-X)，在55℃預熱3min,加入50μL適當稀釋的酶液,反應10min，再加入750μL2mol/L碳酸鈉溶液終止反應,冷卻后測定A410,以pNP為標準計算酶活力。實驗結果：實施例2構建的重組釀酒酵母的木聚糖酶的活性檢測結果如表6所示，從中可以看出，實施例2重組釀酒酵母Glam-x1的總木聚糖酶酶活約在0.5U/ml以上，顯著高于對照組宿主釀酒酵母。表6實施例2構建的重組釀酒酵母的木聚糖酶酶活測定組別木聚糖酶酶活(U/ml)宿主釀酒酵母0.01實施例2重組釀酒酵母Glam-x10.53實施例2構建的重組釀酒酵母的β-木糖苷酶的活性檢測結果如表7所示，從中可以看出，實施例2重組釀酒酵母Glam-x1的β-木糖苷酶酶活約在3.58U/ml以上，顯著高于對照組宿主釀酒酵母。表7實施例2構建的重組釀酒酵母的β-木糖苷酶的活性測定組別β-木糖苷酶酶活(U/ml)宿主釀酒酵母0.01實施例2重組釀酒酵母Glam-x13.58三、重組釀酒酵母的抑菌效果檢測實驗方法：①將大腸桿菌CICC10899、銅綠假單胞菌CICC10419作為受試菌，受試菌經液體培養基中培養至在OD600nm＝0.4，適當稀釋、混勻、均勻涂布至MH培養基中平板上(培養基配方為：5g/l牛肉膏浸粉、17.5g/l酪素水解物、1.5g/l淀粉、瓊脂粉20g/l)。②將適量體積的本實施例所得重組釀酒酵母菌的發酵液，加入牛津杯中，以滅菌水為陰性對照，以氨芐青霉素(1.5μg)為陽性對照，在37℃培養16-18h。③觀察，統計抑菌圈情況。實驗結果：實驗結果如表8所示，從中可以看出，本實施例構建的重組釀酒酵母菌的發酵液對大腸桿菌CICC10899、銅綠假單胞菌CICC10419均有明顯的抑菌圈，說明所得重組釀酒酵母菌Glam-x1成功分泌出抗菌肽。表8重組菌抑菌效果注：“-”無抑菌效果，“+”抑菌圈直徑在7到14mm，“++”抑菌圈直徑在14mm以上。實施例3能生產低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達載體的構建本實施例構建釀酒酵母多基因共表達載體的方法同實施例1，除了連入載體的抗菌肽基因替換為異色瓢蟲Harmoniaaxyridis的抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T基因(堿基序列如SEQIDNO：4所示)外，其他均與實施例1相同，本實施例構建的釀酒酵母多基因共表達載體命名為pTEGC-xynA1-xyl-col。實施例4能生產低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達載體的構建本實施例構建釀酒酵母多基因共表達載體的方法同實施例1，除了連入載體的抗菌肽基因替換為鯰魚抗菌肽突變體基因(堿基序列如SEQIDNO：5所示)外，其他均與實施例1相同，本實施例構建的釀酒酵母多基因共表達載體命名為pTEGC-xynA1-xyl-1-par。實施例5能生產低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達載體的構建本實施例構建釀酒酵母多基因共表達載體的方法同實施例1，除了連入載體的抗菌肽基因替換為脆皮蛙的抗菌肽突變體Lf-cath-T(堿基序列如SEQIDNO：6所示)外，其他均與實施例1相同，本實施例構建的釀酒酵母多基因共表達載體命名為pTEGC-xynA1-xyl-cath。實施例6能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建將實施例3構建的釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-xynA1-xylcol用限制性內切酶線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉化法轉入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養48h以上，挑取長出的單菌落為轉化子。經PCR驗證后的轉化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉化子，即可獲得能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建，將本實施例所得的重組釀酒酵母簡稱為Glam-x2。實施例7能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建將實施例4構建的釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-xynA1-xyl-par用限制性內切酶線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉化法轉入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養48h以上，挑取長出的單菌落為轉化子。經PCR驗證后的轉化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉化子，即可獲得能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建，將本實施例所得的重組釀酒酵母簡稱為Glam-x3。實施例8能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建將實施例5構建的釀酒酵母多基因共表達載體pTEGC-xynA1-xyl-cath用限制性內切酶線性化，采用醋酸鋰介導的電穿孔轉化法轉入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養48h以上，挑取長出的單菌落為轉化子。經PCR驗證后的轉化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養基中篩選，獲得陽性單克隆菌落，測序驗證，獲得正確連接的陽性重組酵母轉化子，即可能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建，將本實施例所得的重組釀酒酵母簡稱為Glam-x4。實施例9抗菌肽突變體與原抗菌肽的抗菌性能對比通過生物公司合成東方鈴蟾Bombinaorientalis的抗菌肽BLP-2及其突變體BLP-2-T(堿基序列如SEQIDNO：3所示)、異色瓢蟲Harmoniaaxyridis的抗菌肽Haxy-Col1及其突變體Haxy-Col1-T(堿基序列如SEQIDNO：4所示)、鯰魚抗菌肽及其突變體(堿基序列如SEQIDNO：5所示)、脆皮蛙的抗菌肽Lf-cath及其突變體Lf-cath-T(堿基序列如SEQIDNO：6所示)。以沙門氏菌CMCC50071、大腸桿菌CICC10899和金黃色葡萄球菌ATCC22023作為指示菌，檢測各種抗菌肽突變前后對上述指示菌的最小抑菌濃度(MIC)。檢測結果如表9所示，經過改造后的抗菌肽突變體均優于未突變的抗菌肽。其中東方鈴蟾的抗菌肽BLP-2及其突變體BLP-2-T、異色瓢蟲抗菌肽及其突變體Haxy-Col1-T的抗菌性能較好(MIC低)。表9抗菌肽抗菌性能對比表下面對上述不同實施例制備的重組釀酒酵母作進一步的性能檢測。一、不同重組釀酒酵母酶解木聚糖活性的檢測實驗方法：挑選經剛果紅染色鑒定的各實施例中的最大水解圈的單克隆，分別取等量的活化后的實施例2、6、7、8構建的重組釀酒酵母菌(Glam-x1、Glam-x2、Glam-x3、Glam-x4)和未經改造的原始宿主釀酒酵母菌，分別接入含0.15％的木聚糖的YPD液體培養中，按照10％(v/v)接種量進行接種，培養條件為30℃，200rpm，培養時間為96h以上。在0h、48h和96h取樣，樣品在10000rpm，離心15min，取上清，用HPLC(流動相0.05MH2SO4，進樣量20μl)檢測分析培養基的木糖和低聚木糖的含量(以木二糖和木三糖為例)。實驗結果：檢測結果如表10所示，從中可以看出，在48h和96h吸取上清液進行HPLC分析發現，Glam-x1經發酵酶解生成木二糖和木三糖的濃度明顯高于Glam-x2、Glam-x3以及Glam-x4生成的，其中Glam-x1、Glam-x3、Glam-x4、Glam-x2的木二糖和木三糖生成量依次降低。木糖的生成量，Glam-x1在48h也高于其他實施例的重組菌，在96h均被釀酒酵母吸收、消耗部分。表10不同重組釀酒酵母酶解木聚糖的活性檢測二、不同重組釀酒酵母對含木聚糖原料進行固態發酵的效果檢測實驗方法：分別取等量的活化后的實施例2、6、7、8構建的重組釀酒酵母菌(Glam-x1、Glam-x2、Glam-x3、Glam-x4)和未經改造的原始宿主釀酒酵母菌對含木聚糖原料進行發酵，其具體方法如下：1)斜面復蘇：將不同重組釀酒酵母接種YPD瓊脂斜面上，30℃培養2d，復蘇活化。2)種子液活化：從斜面上挑取單菌落，接種至全營養的50ml的YPD液體培養基中，30℃、220rpm振蕩培養。3)三級放大液體發酵。分別按照500mL到5L，再到30L的三級放大，接種量分別為10％(v/v)、10％(v/v)、16.7％(v/v)，接種確保各組釀酒酵母的用量相同，從而快速獲得大量的菌體。液體發酵培養基如下：糖蜜為碳源，三級放大濃度分別為15g/l→50g/l→100g/l；玉米漿為氮源，三級放大濃度分別為0.4％(v/v)→0.6％(v/v)→0.8％(v/v)；無機鹽包括0.1％(w/v)硫酸鎂、0.05％(w/v)氯化鈣、0.1％(w/v)磷酸二氫鉀、0.1％(w/v)磷酸氫二鈉；初始pH調整在6.0。4)高密度有氧固態發酵。按照如下配方進行：按照甘蔗渣：麩皮：玉米粉：豆粕：木聚糖比例為41.9：25：18：15：0.1加入配比，其中料水比為1：1.44。其中水包括液體發酵液及部分補充的蒸餾水(比例為0.44:1)，種子液接種量為44％(v/m，L/kg)。每隔8h進行翻料，翻料后2h內增加通風，翻料后灑水或緩沖液補充濕度、調節pH接近6.0。通過淺層高密度固態發酵時間為3d。5)深層厭氧發酵破壁。將高密度固態發酵料堆疊，增加料層厚度，補加Hcl稀釋液降低發酵料的pH至5.5，溫度至28℃，深層發酵厭氧48h；然后，補加Hcl稀釋液降低發酵料的pH至4.0，同時發酵溫度升至55℃進行破壁20h。酵母破壁率可達95％，無活酵母。6)參考GB/T6432-1994“飼料中粗蛋白測定”的凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參考國標GB/T6434-2006“飼料中粗纖維的含量測定”；參考國標GB/T22492-2008“大豆肽粉”提取并測定酸溶蛋白含量；參考GB/T13093-2006“飼料中細菌總數的測定”檢測細菌數，利用HPLC分析低聚木糖，對重組菌的酵母培養物進行粗蛋白、酸溶蛋白、粗纖維、木二糖、木三糖、細菌數(雜菌數)等指標，并與市售產品對比。實驗結果：檢測結果如表11所示，對比發現，本發明的酵母培養物的各指標皆優于市售產品，且提供了足量低聚木糖(以木二糖和木三糖為例)，同時本發明的酵母培養物的除酵母菌外的雜菌數明顯小于市售產品和對照組。其中，實施例2的重組釀酒酵母(Glam-x1)指標優于市售產品和其他實施例的重組釀酒酵母的酵母培養物。表11不同重組釀酒酵母對含木聚糖原料進行發酵的產物成分檢測上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>廣州格拉姆生物科技有限公司<120>一種生產低聚木糖和抗菌肽的益生飼用釀酒酵母<130><160>48<170>PatentInversion3.5<210>1<211>636<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaaggttactgctgctttcgcttctttgttgttgactgctttcgctgctccagctcca60gaaccagttttggtttctagatctgctggtatcaactacgttcaaaactacaacggtaac120ccaggtgacttcacttacgacgaatctgctggtactttctctatgtactgggaagacggt180gtttcttctgacttcgttatcggtttgggttggactactggttcttctaagtctatcact240tactctgctcaatactctgcttcttcttcttcttcttacttggctgtttacggttgggtt300aattctccacaagctgaatactacatcgttgaagactacggtaactacaacccatgttct360tctgctacttctttgggtactgtttactctgacggttctacttaccaagtttgtactgac420actagaactaacgctccatctatcactggtacttctactttcactcaatacttctctgtt480agagaatctactagaacttctggtactgttactgttgctaaccacttcaacttctgggct540caacacggtttcggtaactctaacttcaactaccaagttatggctgttgaagcttg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