本發明涉及一種從瘤胃液中獲取硝酸鹽還原菌的方法，屬于微生物研究技術領域。
背景技術：
目前報道的具有還原硝酸鹽能力的瘤胃厭氧細菌包括反芻獸新月單胞菌(Selenomonas ruminantium)、韋榮氏球菌(Veillonella parvula)、產琥珀酸沃廉氏菌(Wolinella succinogenes)、彎曲桿菌(Campylobacter fetus)和曼海姆產琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)。其中，反芻獸新月單胞菌是優勢菌，在瘤胃中的數量最多，是最主要的瘤胃硝酸鹽還原菌。硝酸鹽在瘤胃內可以提供氮，并降低甲烷的排放量，而這個過程需要硝酸鹽還原菌的參與，因此，如何培養獲得硝酸鹽還原菌，并進行深入研究，是該領域需要解決的重點問題。
目前對于硝酸鹽還原菌的培養研究和報道，大多數集中在土壤和水體中，同時多使用牛肉膏蛋白胨培養基MRS(馬莎莎等，2011，化學與生物工程28(4)：32-35)。土壤和水體中的硝酸鹽還原菌通常將硝酸鹽還原成N2和N2O；而瘤胃中的硝酸鹽還原菌通常將硝酸鹽還原成氨態氮，被微生物再利用合成菌體蛋白。可見，瘤胃硝酸鹽還原菌具有其特殊性。同時，瘤胃硝酸鹽還原菌必須在厭氧的條件下才能繁殖，而使用Na2S作為去氧溶劑，易導致菌液出現黑色顆粒，或滅菌后出現絮狀沉淀等問題，影響菌的純度和生長，并且生長的溫度與土壤、水體的溫度大不相同。目前沿用土壤或水體的培養方法，無法得到瘤胃硝酸鹽還原菌。
技術實現要素：
為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種瘤胃硝酸鹽還原菌的制備方法，具體為利用選擇性培養基，特定去氧劑，獲得瘤胃硝酸鹽還原菌的方法。
本發明所述的瘤胃硝酸鹽還原菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備瘤胃硝酸鹽還原菌純培養發酵液
首先配制基礎培養基：在超純水中加入氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化錳、硫酸亞鐵、氯化鋅、氯化鈷、酵母提取物、刃天青，其中超純水與氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化錳、硫酸亞鐵、氯化鋅、氯化鈷、酵母提取物、刃天青的質量比為100：110～130：10～12：8～10：3～5：2～4：1～2：0.3～0.5：19～23：19～23。待完全溶解后，2.5％半胱氨酸鹽酸鹽、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸，與上述溶液總體積的比例為1～2：0.18～0.19：0.06～0.07：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：100。用食堿調整pH為6.8～7.0，整個配制過程持續通入無氧CO2,在分裝前加入2％的硝酸鉀，待溶解后，按15ml體積，分裝入50ml厭氧培養管，用丁基橡膠塞密封，鋁蓋封口后，在121～123℃溫度條件下滅菌處理30分鐘，冷卻到38±1℃接入瘤胃液1～3ml，在39℃發酵20小時，制得對數期硝酸鹽還原菌發酵液。將該菌液純化轉代培養至5～7代后，即可進行下一步富集培養。
(2)制備富集培養液
制備富集擴繁培養液，配方同(1)。將所有成分按相對比例加入厭氧發酵罐中，該罐內持續通入無氧CO240～60分鐘。用蠕動泵以0.22μm濾膜負壓過濾至滅菌后的空發酵瓶中，制備富集培養液。
(3)將步驟(1)制備的對數期發酵液轉入步驟(2)的富集培養液中，對數發酵液的加入量為5％(v/v)。通無氧CO2，接種后快速密封，與38±1℃培養，培養至20小時，達到對數生長期，此時每毫升含活菌數達≥106。
本發明所述瘤胃硝酸鹽還原菌的制備方法，避免了使用硫化鈉可能產生的黑色沉淀顆粒，同時實現了菌的富集擴繁，提高了總菌含量，為科研提供材料。
具體實施方式
實施方式1
(1)瘤胃液制備
通過帶有永久性瘤胃瘺管的成年山羊的瘤胃內，獲取瘤胃食糜，以4層滅菌紗布過濾后，獲得瘤胃液。
(2)制備瘤胃硝酸鹽還原菌純培養發酵液
首先配制基礎培養基：在超純水中加入氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化錳、硫酸亞鐵、氯化鋅、氯化鈷、酵母提取物、刃天青，取100ml超純水，分別加入110mg氯化鈉、10mg氯化鎂、8mg氯化鈣、3mg氯化錳、2mg硫酸亞鐵、1mg氯化鋅、0.3mg氯化鈷、19酵母提取物、19mg刃天青，待完全溶解后，再加入1ml 2.5％半胱氨酸鹽酸鹽溶液，180μl乙酸，60μl丙酸，丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸各15μl。用食堿調整pH為6.9，整個配制過程持續通入無氧CO2,在分裝前加入2.5g硝酸鉀，待溶解后，按15ml體積，分裝入50ml厭氧培養管，用丁基橡膠塞密封，鋁蓋封口后，在121℃溫度條件下滅菌處理30分鐘，冷卻到38℃接入瘤胃液2ml，在39℃發酵20小時，制得對數期硝酸鹽還原菌發酵液。將該菌液純化轉代培養至6代，即可進行下一步富集培養。
(3)制備富集培養液
制備富集擴繁培養液，配方同步驟(2)。
將所有成分按相對比例加入厭氧發酵罐中，該罐內持續通入無氧CO250分鐘。用蠕動泵以0.22μm濾膜負壓過濾至滅菌后的培養瓶中，制備富集培養液。
(4)富集培養
將步驟(2)制備的對數期發酵液轉入步驟(3)5富集培養液中，每100ml富集培養液加入5ml對數發酵液。通無氧CO2，接種后快速密封，與38℃培養，培養至20小時，此時每毫升含硝酸鹽還原菌活菌數達≥106。
實施方式2
(1)瘤胃液制備
通過帶有永久性瘤胃瘺管的成年山羊的瘤胃內，獲取瘤胃食糜，以4層滅菌紗布過濾后，獲得瘤胃液。
(2)制備瘤胃硝酸鹽還原菌純培養發酵液
首先配制基礎培養基：在超純水中加入氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化錳、硫酸亞鐵、氯化鋅、氯化鈷、酵母提取物、刃天青，取100ml超純水中含有130mg氯化鈉、12mg氯化鎂、10mg氯化鈣、5mg氯化錳、4mg硫酸亞鐵、2mg氯化鋅、0.5mg氯化鈷、23mg酵母提取物、23mg刃天青。待完全溶解后，再加入2ml的2.5％半胱氨酸鹽酸鹽溶液，190μl乙酸，70μl丙酸，丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸各18μl。用食堿調整pH為7.0，整個配制過程持續通入無氧CO2,在分裝前加入2.3g硝酸鉀，待溶解后，按15ml體積，分裝入50ml厭氧培養管，用丁基橡膠塞密封，鋁蓋封口后，在121℃溫度條件下滅菌處理30分鐘，冷卻到38℃接入瘤胃液2ml，在39℃發酵20小時，制得對數期硝酸鹽還原菌發酵液。將該菌液純化轉代培養至6代后，即可進行下一步富集培養。
(3)制備富集培養液
制備富集擴繁培養液，配方同(2)。將所有成分按相對比例加入厭氧發酵罐中，該罐內持續通入無氧CO240分鐘。用蠕動泵以0.22μm濾膜負壓過濾至滅菌后的培養瓶中，制備富集培養液。
(4)富集培養
將步驟(2)制備的對數期發酵液轉入步驟(3)的富集培養液中，每100ml富集培養液加入5ml對數發酵液。通無氧CO2，接種后快速密封，與38±1℃培養，培養至20小時，此時每毫升含硝酸鹽還原菌活菌數達≥106。