一種低成本純化六勝肽的方法與流程

本發明屬于多肽純化領域，具體涉及一種六勝肽的純化方法。

背景技術：

六勝肽又稱六元勝肽，它廣泛分布于人體各處，是人體自身存在且必須的活性物質，它具有肉毒素的全部功能，但避免了肉毒素必須采用注射應用方式和使用成本高昂的缺點。

六勝肽現已成為風靡世界的抗皺化妝品原料，許多高端化妝品均應用了六勝肽成分用于抗皺。瑞士傳奇集團護膚實驗室于2010年研發的MAGIC CARE魔法護理六勝肽平皺緊致原液是六勝肽美容產品的尖端代表。六勝肽做為化妝品原料時純度要求≥95％,然而合成的六勝肽含有大量的雜質，需進一步純化才可以作為化妝品原料。

在第201310593375.9號中國專利申請“一種六勝肽的液相分段合成方法”中，公開了一種六勝肽的純化方法，其中在合成粗品六勝肽后，用反相高效液相色譜純化粗品六勝肽以得到六勝肽。該方法的有機試劑用量過高，成本也高并且還需要進一步用弱陰離子交換柱轉鹽才可得到合格的醋酸六勝肽。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于克服現有六勝肽純化方法存在的缺點，提供一種成本低、純度高，適合產業化的醋酸六勝肽純化方法。

本發明提供一種純化六勝肽的方法，所述方法采用聚合物反相色譜柱通過反相高效液相色譜法純化六勝肽粗品水溶液，其中將六勝肽粗品水溶液上樣后，先用堿性流動相沖洗，然后再用含醋酸的酸性流動相梯度洗脫得到醋酸六勝肽溶液。

在本發明的一個實施方案中，所述聚合物反相色譜柱的填料為F型SBC MCI GEI反相色譜填料。優選地，所述F型0SBC MCI GEI反相色譜填料的粒徑為30～50μm。

在本發明的一個實施方案中，六勝肽粗品水溶液通過將六勝肽粗品溶解于水溶液，調節pH值至6-9，用濾膜過濾并收集濾液來制備。優選地，所述六勝肽粗品與水的質量百分比為1:5-1:30，更優選為1:20。優選地，將溶解后得到的溶液的pH調節為8.5，更優選地用氨水調節溶解后得到的溶液的pH。

在本發明的一個實施方案中，所述六勝肽粗品為通過固相合成方法得到的六勝肽粗品。

在本發明的一個實施方案中，堿性流動相由堿性流動相A和堿性流動相B組成，所述堿性流動相A為pH值為7.6-8.5的水溶液，所述堿性流動相B為7.6-8.5的甲醇溶液。在堿性上樣時，堿性流動相A與堿性流動相B的比例為(99-98):(1-2)，優選地，堿性流動相A與堿性流動相B的比例為99:1(實施例1和2中所采用的比例)。優選地，所述堿性流動相的流速為10-300ml/分鐘，更優選為50-150ml/分鐘。

在本發明的一個實施方案中，所述含醋酸的酸性流動相由酸性流動相A和酸性流動相B組成，所述酸性流動相A為含0.1-5％(體積百分比)醋酸的水溶液，所述酸性流動相B為含0.1-5％(體積百分比)醋酸的甲醇溶液。優選地，用酸性流動相A和酸性流動相B進行梯度洗脫，所用洗脫梯度為酸性流動相A與酸性流動相B的比例由(98.5-99.5):(0.5-1.5)到(93-95)：(5-7)。優選地，洗脫梯度為酸性流動相A與酸性流動相B的比例由99:1到95:5，或由99:1到93:7。優選地，所述酸性流動相的流速為10-300ml/分鐘，更優選為50-150ml/分鐘。

在本發明的一個實施方案中，酸性流動相的洗脫梯度為在0-(50-150)分鐘，優選0-(100-130)分鐘內酸性流動相A與酸性流動相B的比例由(98.5-99.5):(0.5-1.5)到(93-95)：(5-7)。優選地，在0-100分鐘酸性流動相A與酸性流動相B的比例由(98.5-99.5):(0.5-1.5)到(93-95)：(5-7)。

在本發明的一個實施方案中，在用酸性流動相進行梯度洗脫之后，用含5％(體積百分比)醋酸的甲醇溶液恒流洗脫。優選地，恒流洗脫的流速為50ml/min。

在本發明的一個實施方案中，還包括將醋酸六勝肽溶液濃縮并干燥得到純度大于95％醋酸六勝肽的步驟。

在本發明的實施方案中，其中堿性上樣和酸性洗脫時的柱溫為35-45℃，優選40℃。

本發明的有益效果為：

1、本發明方法打破了多種柱子交替使用的傳統多肽純化方法，僅用反相聚合物色譜柱，即可得到純度大于95％的六勝肽，同時也除去了多肽切割過程中帶來的三氟乙酸，極大地縮短了純化時間，降低了純化難度。

2、本發明方法節省了整個純化過程中流動相的成本，且純化工藝較為環保。傳統純化過程中所使用的流動相乙腈，用量大且價格昂貴，而本方法純化過程中主要使用pH值為7.6～8.5的水溶液做流動相，僅用小量的甲醇溶液，即可得到合格的六勝肽，價格低廉，對環境污染小。

3、本發明方法步驟簡單，有效地彌補了多個柱子交替使用才能完全分離粗肽中不同結構、不同化學性質的雜質的缺點，得到的六勝肽純度高(大于95％)，且收率高。

4.本發明的方法僅需一步純化，即堿性上樣酸性洗脫即可得到合格醋酸六勝肽，不僅節省時間，且成本低、適合大工業生產。

附圖說明

圖1是實施例1純化后的醋酸六勝肽質譜圖。

圖2是實施例1純化后的醋酸六勝肽色譜圖，其中醋酸六勝肽純度為97.32％。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明并不限于這些實施例。除非另有說明，實施例中使用的原料和儀器均是商購獲得的，是本領域常規使用的儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

實施例1

1、溶樣

將100g固相合成所得六勝肽粗品溶解于1000ml水溶液中，用氨水調節pH值至8.5，超聲分散，待溶液完全澄清，用4號砂芯漏斗過濾，收集濾液。

2、純化

用反相高效液相色譜法對濾液進行純化，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為3000mL。進樣前反相聚合物色譜柱先用pH8.5的水溶液(用氨水調節pH)平衡至檢測器的電導率恒定不變，上樣，上樣量為100g，然后用堿性流動相沖洗100min，沖洗時堿性流動相A與堿性流動相B的比例為99:1，堿性流動相A為pH值為pH8.5(用氨水調節pH的甲醇溶液，堿性流動相B為Ph8.5的甲醇溶液，流速為50ml/min，柱溫40℃，用堿性流動相沖洗結束后再用酸性流動相酸性梯度洗脫得到醋酸六勝肽以去除六勝肽粗品中的雜質，酸性流動相A為含有1％(體積百分比)醋酸的水溶液，酸性流動相B為含有1％(體積百分比)醋酸的甲醇溶液，流速為50ml/min，流動相梯度選擇0到100分鐘酸性流動相A:酸性流動相B由99:1到95:5，然后用酸性流動相A和酸性流動相B恒流洗脫(酸性流動相A:酸性流動相B的比例為95:5)，柱溫為40℃，檢測波長為215nm,收集純化后的醋酸六勝肽溶液，將純化后的醋酸六勝肽溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于95％的醋酸六勝肽，六勝肽的純化收率為72％。其質譜表征結果見圖1，色譜圖見圖2。

實施例2

1、溶樣

將50g固相合成所得六勝肽粗品溶解于1000ml水溶液中，用氨水調節pH值至8.5，超聲分散，待溶液完全澄清，用4號砂芯漏斗過濾，收集濾液。

2、純化

用反相高效液相色譜法對濾液進行純化，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為3000mL。進樣前反相聚合物色譜柱先用pH8.5的水溶液(用氨水調節pH)平衡至檢測器的電導率恒定不變，上樣，上樣量為50g，然后用堿性流動相沖洗100min，沖洗時堿性流動相A與堿性流動相B的比例為99:1，堿性流動相A為pH值為8.5(用氨水調節pH)的甲醇溶液，堿性流動相B為Ph8.5的甲醇溶液。流速為50ml/min，柱溫為40℃；沖洗結束后再用酸性流動相進行酸性梯度洗脫得到醋酸六勝肽以去除六勝肽粗品中的雜質，酸性流動相A為含有1％(體積百分比)醋酸的水溶液，酸性流動相B為含有1％(體積百分比)醋酸的甲醇溶液，流速為50ml/min，流動相梯度選擇0到130分鐘酸性流動相A:酸性流動相B由99:1到95:5，然后用酸性流動相A和酸性流動相B恒流洗脫(酸性流動相A:酸性流動相B的比例為95:5)，柱溫為40℃，檢測波長為215nm,收集純化后的醋酸六勝肽溶液，將純化后的六勝肽溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于95％的醋酸六勝肽，六勝肽的純化收率為75％。其質譜表征結果見圖1，色譜圖見圖2。

實施例3

本實施例的純化步驟2中，流動相梯度選擇0到130分鐘A:B由99:1到93:7。其他步驟與實施例2相同，得到純度大于95％的醋酸六勝肽，純化收率為65％。

實施例4

1、溶樣

將300g固相合成所得六勝肽粗品溶解于1500ml水溶液中，用氨水調節pH值至8.5，超聲分散，待溶液完全澄清，用4號砂芯漏斗過濾，收集濾液。

2、純化

用反相高效液相色譜法對濾液進行純化，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為3000mL。進樣前反相聚合物色譜柱先用pH8.5的水溶液(用氨水調節pH)平衡至檢測器的電導率恒定不變，上樣，上樣量為300g，然后用堿性流動相沖洗100min，沖洗時堿性流動相A與堿性流動相B的比例為99:1，流動相A為pH值為8.5(用氨水調節pH)的甲醇溶液，堿性流動相B為pH8.5的甲醇溶液流速為150ml/min，柱溫為40℃；沖洗結束后再用酸性流動相酸性梯度洗脫得到醋酸六勝肽以去除六勝肽粗品中的雜質，酸性流動相A為含有1％醋酸的水溶液，酸性流動相B為含有1％醋酸的甲醇溶液，流速為150ml/min，流動相梯度選擇0到130分鐘酸性流動相A:酸性流動相B由99:1到95:5，然后用酸性流動相A和酸性流動相恒流洗脫(酸性流動相A:酸性流動相B的比例為95:5)，柱溫為40℃，檢測波長為215nm,收集純化后的醋酸六勝肽溶液，將純化后的醋酸六勝肽溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于95％的醋酸六勝肽，六勝肽的純化收率為70％。其質譜表征結果見圖1，色譜圖見圖2。