一種引發溶血性輸血反應的ABO血型變異型的SNP位點的制作方法

本發明屬于基因診斷制品技術領域，具體涉及一種用于檢測ABO血型系統中A型變異型血型基因引發的急性或者遲發性溶血性輸血反應的SNP位點。

背景技術：

正常的ABO血型分為A型、B型、AB型與O型四種血型，但是在ABO血型基因發生變異的情況下如SNP、缺失、插入、重復等，造成ABO血型紅細胞表面抗原與血漿中的抗體發生變化，例如本發明中發現的這例ABO血型系統中A型變異型血型基因，紅細胞上A抗原比正常A型人要弱，但是血漿中存在抗-A1細胞的抗體，一旦輸注A型人血液，極易發生輸血性溶血反應。

溶血性輸血反應(Hemolytic Transfusion Reaction；HTR)分為急性與遲發性溶血性輸血反應，ABO系統不相合的輸血一般為急性溶血性輸血反應，危害極大。一般在輸血后24h內發生，多于輸血后立即發生，是最嚴重的輸血副反應，一旦發生需立即搶救，否則致死率很高。只要輸入5～10ml ABO不相容血液即可出現明顯癥狀；輸血量超過200ml，將會造成嚴重后果。臨床上常表現為血管內溶血，患者有發熱、寒戰、惡心、背痛，隨后出現血紅蛋白尿，血紅蛋白血癥，低血壓休克，均應考慮為急性血管內溶血性輸血反應，應迅速停止輸血并進行各項檢查。同時這一過程會引起補體激活，啟動凝血系統，釋放緩激肽和兒茶酚胺，誘發DIC；甚至發生循環與腎功能衰竭；因此通常把低血壓休克、DIC、急性腎衰竭稱為急性血管內溶血三聯癥。

無論是在國內或是國外，ABO血型的錯誤輸注是引起急性溶血性輸血反應最為常見的因素，根據美國FDA報告，急性溶血反應死亡159例中139例是ABO血型不合的輸血所致。其次比較常見的是A變異型，患者因免疫性因素(輸血、妊娠或流產)產生抗A1抗體，如果再次輸入A型血液就造成急性或遲發性免疫性溶血反應。2012年Transfusion報道了一例A型變異型的患者錯誤輸注A型血液，患者發生急性輸血性溶血反應而造成死亡，針對此種情況，必須強調預防的重要性。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種ABO血型系統A型變異型血型基因引發的急性溶血性輸血反應的SNP位點，從而彌補現有技術的不足。

申請人對一個呈常染色體9q34.1-9q34.2顯性遺傳的A型變異型血型基因的家系成員進行了測序，找到了該家系成員A型變異型基因存在遺傳上的致病突變，造成了A抗原數量和質量的改變，并且通過免疫刺激產生抗-A1抗體，一旦發生錯誤血型的輸注(輸注A型血)，很有可能發生致命的危害。為了避免其通過輸血造成急性溶血性輸血反應，從而促成了本項發明。

本發明提供一種用于檢測ABO血型系統A型變異型血型基因引發的急性溶血性輸血反應的SNP位點，為ABO血型基因編碼區域由起始密碼子起的第692位堿基，為C＞A的突變；

本發明還提供上述SNP位點的用途，是用于制備檢測急性或者遲發性溶血性輸血反應的制品；

所述的制品，為檢測ABO血型系統A型變異型血型變異的制品；

所述的制品，優選為分子檢測試劑盒；

本發明再一個方面提供一種檢測ABO血型系統A型變異型血型變異的制品；所述的制品至少包含有檢測上述SNP位點的分子標記；

作為實施例的優選，所述的分子標記為PCR擴增用的引物對或檢測探針；

其中用于檢測上述SNP位點的直接擴增及測序引物信息如下：

ABO-E7F:5'-CCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3' SEQ ID NO:1

ABO-E7R:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3' SEQ ID NO:2

用于檢測上述SNP位點單倍型測序引物信息如下：

ABO-E7W-F：5'-CTGCTGCTCTAAGCCTTCCAA-3' SEQ ID NO:3

ABO-E7W-R：5'-TTACTCACAACAGGACGGACAAA-3' SEQ ID NO:4。

本發明提供了ABO血型A型變異型基因檢測的新用途，從而提供了一種有效的避免急性溶血性輸血反應發生的基因診斷、產前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應用效果表明本發明所提供的基因的SNP位點及檢測引物可以有效的用于臨床患者外周血進行ABO血型A型變異型基因突變位點的快速檢測。

附圖說明

圖1：ABO血型A型變異型基因先證者基因突變位點測序圖，正常A型參考序列，參比序列來源于BGMUT(國際血型基因突變庫)；

圖2：先證者直接測序圖；

圖3：先證者克隆測序圖，先證者ABO基因編碼區域由起始密碼子起第692位堿基發生了突變(nt692C＞A)。

具體實施方式

申請人在一個ABO血型A型變異型基因家系中發現致病性SNP位點，并證實該基因的突變是導致A型血型發生變異導致紅細胞A抗原比正常A型人紅細胞A抗原要弱，并且血漿中產生同種抗-A1抗體。一旦輸入A型血液，很可能引發急性溶血性輸血反應，為了做到及時檢測和預防，從而促成了本發明。

A變異型位于染色體9q34.1-9q34.2，可轉錄成大約1065bp的mRNA(NCBI登錄號為NM_020469.2)，直接翻譯形成355個氨基酸組成的蛋白質。

下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。

實施例1：從ABO血型A型變異型基因先證者基因檢測確認A型變異型的突變位點。

1、提取外周血基因組DNA：

在符合國家相關政策規定，并在取樣對象同意的基礎上，抽取ABO血型A型變異型基因家系成員外周靜脈血2-5ml，放入EDTA-Na₂抗凝管內，-80℃凍存備用；DNA提取使用LIFE公司的DNA提取試劑盒，具體操作流程如下：

凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500ul放于離心管，加入等體積的紅細胞裂解液(pH8.0)，渦旋混勻5分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄上清。重復加入紅細胞裂解液500ul渦旋混勻5分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄上清。

沉淀物渦旋混勻5分鐘，加入核裂解液50ul，渦旋混勻5分鐘，置于56℃金屬浴15分鐘。從水浴中取出樣品，加入蛋白清除液135ul。渦旋充分混勻，至于4℃30分鐘。

室溫下12000rpm離心5分鐘，吸取上清液(約200ul)至一新離心管中。加入冰乙醇500ul，反復震蕩離心管，直至白色DNA沉淀物析出。室溫12000rpm離心2分鐘，棄上清。向DNA沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室溫12000rpm離心3分鐘，棄上清，置于室溫中揮發剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8.0)，4℃過夜溶解DNA。

對提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測DNA純度及濃度。

2、直接測序法尋找先證者A變異型基因的突變位點

PCR擴增目的片段：反應條件與反應體系：

(1)PCR反應條件：95℃預變性10分鐘；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10個循環；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25個循環；72℃延伸10min，擴增產物10℃保溫。

(2)反應體系：(TAKARA Ex-Taq polymerase)

應用該反應體系進行先證者的基因組DNA模板與上述ABO-E7F、ABO-E7R引物的擴增反應。

PCR產物測序：應用常規Sanger測序法對上述PCR產物進行測序，其中應用引物對ABO-E7F:5'-ATCCGCCTGCCTTGCAGATA-3'；ABO-E7R:5'-AGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAACA-3'在先證者發現ABO血型A基因編碼區域由起始密碼子起第692位堿基發生了突變，第692位堿基出現AC雜合序列。多次測序結果表明該突變位點的確存在該突變，并不是因為擴增或測序錯誤引進的(圖2)。

實施例2SNP位點的驗證

3、對ABO基因第7外顯子進行單倍型測序，確定先證者A變異型基因的突變位點

PCR擴增目的片段引物：ABO-E7F:5'-ATCCGCCTGCCTTGCAGATA-3'；ABO-E7R:5'-AGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAACA-3'。

PCR擴增引物也可以選用其它能擴增上述SNP位點的引物對。

PCR擴增目的片段的反應條件與反應體系：

(1)PCR反應條件：95℃預變性5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40個循環；72℃延伸5min，擴增產物10℃保溫。

(2)反應體系：(TAKARA LA-Taq polymerase)

應用該反應體系分別進行每名家系成員的基因組DNA模板與發明者設計的克隆測序的引物進行擴增反應。將PCR產物克隆入T載體，挑取多個菌落進行單倍型序列測定，單倍型測序引物使用ABO-E7W-F：5'-CTGCTGCTCTAAGCCTTCCAA-3'；ABO-E7W-R：5'-TTACTCACAACAGGACGGACAAA-3'(測序引物也可以選用從A型變異基因上設計的，能擴增SNP位點的其它引物)確定樣本的單倍型序列(圖3)。該突變為一新發現的突變。該突變不存在于下面的三個數據庫中：單核苷酸多態性數據庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，血型基因突變庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi？cmd＝b gmut/systems_info&system＝abo)，表明該突變非常罕見，該突變導致了編碼A血型的蛋白組成的核苷酸發生改變，A基因編碼區域由起始密碼子起第692位堿基由C＞A，導致了第231位氨基酸由蘇氨酸變為天冬氨酸；氨基酸的突變從而引起了此A變異型的個體A抗原表位發生缺失抗原減弱，導致這種個體不需要免疫刺激就能夠產生血漿中能夠產生同種的抗-A1抗體(天然免疫)，當輸注正常人的A型血液時就會發生急性溶血性輸血反應，從而危及患者生命。而在近430余例正常當地人群的外周血基因組DNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發現該突變。

在青島市中心血站輸血醫學研究所收集的先證者家系成員，提取他們的外周血基因組DNA，應用上述DNA作為模板與ABO-E7F、ABO-E7R引物進行PCR目的片段的擴增，常規Sanger測序法應用上述這對引物對PCR產物進行直接測序，發現該先證者的兩名家系成員的ABO血型A基因存在本發明中發現的SNP突變，即編碼區域由起始密碼子起第692位堿基發生了AC雜合突變。繼續對發現SNP突變的兩位家系成員進行ABO基因第6,7外顯子及第6內含子的單倍型測序，應用上述提取的一名家系成員(先證者父親)的基因組DNA作為模板與ABO-E6mo、ABO-E7mo引物進行PCR目的片段的擴增，將PCR產物克隆入T載體，挑取多個菌落進行單倍型序列測定，單倍型測序引物使用上述引物，確定樣本的單倍型序列。單倍型測序發現，兩位家系成員A基因編碼區域第692位堿基由C＞A，導致了第231位氨基酸由蘇氨酸變為天冬氨酸，與先證者完全一致，而且這一名家系個體血漿中都存在同種抗-A1抗體。

通過上述的分析，證明發明者設計的引物可以用來檢測個體ABO血型基因是否發生A基因突變，從而有潛在的發生輸血后急性輸血型溶血反應的危險。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島市中心血站

<120> 一種引發溶血性輸血反應的ABO血型變異型的SNP位點

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

ccccgtccgc ctgccttgca g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gggcctaggc ttcagttact c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

ctgctgctct aagccttcca a 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

ttactcacaa caggacggac aaa 23