基于人RNA聚合酶I系統的腸道病毒68型微復制子體系及其構建方法與流程

本發明屬于生物工程領域，更具體的，本發明公開了一種基于人RNA聚合酶I(hPolI)系統的腸道病毒68型微復制子的構建及應用。

背景技術：

腸道病毒68型(EV-D68)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒D組。EV-D68基因組為單股正鏈RNA，長度約為7.5Kb，由單一的開放讀碼框(ORF)及其兩側非翻譯區(5’UTR和3’UTR)構成。EV-D68基因組編碼一條多聚蛋白，該蛋白被病毒自身編碼的蛋白酶水解為Pl、P2和P3三種前體蛋白，其中P1被進一步加工成病毒的結構蛋白VPl～VP4；P2和P3被加工成7個非結構蛋白。

自1962年首次發現后，該病毒的分離鑒定罕有報道。1970-2005年間，在美國只有26例臨床分離株被報道，占所有報道的EV家族病例的0.1％，流行病學數據極其有限。然而近年來，日本(2005-2010)，中國(2006-2012)，泰國(2006-2011)，意大利(2008-2009)，英國(2008-2010)，肯尼亞(2008-2011)，法國(2009)，菲律賓(2009-2011)，美國(2009-2010)，新西蘭(2010)，荷蘭(2010)都有EV-D68爆發，而且出現嚴重的呼吸困難，四肢癱瘓為主要癥狀的重癥患者，甚至發現死亡的病例。患者的主要年齡群集中在一歲到四歲的兒童，但有近四分之一的感染者為成年人。因此推斷，隨著檢測數據的增加，EV-D68最終可能被認定為全年齡組的呼吸系統病原體。因此，EV-D68引起國際衛生組織的廣泛關注。但是，目前仍缺乏特效的治療手段。因此繼續深入開展相關研究，如病毒的分子生物學特征、復制機制、致病機理，將有利于人類更加全面透徹的了解EV-D68，從而設計有效的藥物、準確的診斷方法以及良好的疫苗提供理論依據。

隨著分子生物學的不斷發展，科學家可以通過反向遺傳學的手段定向改造病毒，為深入開展相關病毒的研究提供了良好的工具。

病毒微復制子是將部分的病毒基因組替換為報告基因的病毒cDNA結構。由于微復制子結構簡單且為DNA形式，可方便的用于對RNA病毒順式作用元件和反式作用蛋白質的分析，也可用于抗病毒藥物的篩選。微復制子本身安全無危害，不需要特殊的實驗場所和設備，為不同實驗室研究病毒復制相關機制提供了一個工具。

目前，單鏈正股RNA病毒反向遺傳系統一般基于T7 RNA聚合酶來實現，將病毒cDNA克隆于T7啟動子下游，通過體外轉錄的方法，獲得病毒的RNA，再將病毒RNA轉染細胞以獲得重組病毒。這種方法費時費力，并且在操作過程中有對cDNA體外轉錄、RNA提純的過程，易被RNA酶污染，造成實驗失敗。pHH21質粒上帶有人RNA聚合酶I(hPolI)啟動子，可以在細胞中直接誘導轉錄，省去了體外轉錄的過程，大大節省了操作步驟。

目前尚未有對EV-D68微復制子構建的報道。

技術實現要素：

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種基于Pol1系統的腸道病毒68型微復制子體系及其構建方法及其應用，克服現有技術中傳統的病毒感染系統時間長，病毒滴度檢測繁瑣，精確度低的問題。

本發明的技術方案為：一種基于Pol1系統的腸道病毒68型微復制子體系的構建方法，包括以下步驟：

(1)合成EV-D68Fermon病毒株的5’UTR cDNA；所述Fermon的5’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3為引物，PCR擴增得到腸道病毒68型毒株Fermon的5’UTR片段；

(3)以實驗室保存pGL3-basic質粒為模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5為引物，PCR擴增得到螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase，f-Luc)基因片段；

(4)以步驟(2)得到的PCR產物和步驟(3)得到的PCR產物為模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7為引物進行overlapping-PCR擴增；回收混合PCR產物；

(5)以步驟(4)得到的PCR產物為模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8為引物進行PCR擴增；回收PCR產物；

(6)Pst1和Not1雙酶切經步驟(5)得到的PCR產物和載體，連接，轉化，篩選陽性克隆；

(7)以步驟(6)得到的陽性克隆為模板，以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10為引物，PCR擴增，PCR產物經DpnI酶37℃處理30分鐘，轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選獲得無BsmB1酶切位點的f-Luc微復制子片段；

(8)以步驟(7)得到的無BsmB1酶切位點的f-Luc微復制子為模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12為引物，PCR擴增得到帶有BsmB1酶切位點的f-Luc微復制子；

(9)BsmB1酶切步驟(8)得到的PCR產物和載體，連接，轉化，篩選陽性克隆，即為RNA聚合酶I系統的腸道病毒68型f-Luc微復制子：pHH21-EV-D68-f-Luc；

(10)以步驟(9)得到的pHH21-EV-D68-f-Luc為模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14為引物，PCR擴增，PCR產物經DpnI酶37℃處理30分鐘，轉化感受態大腸桿菌DH5α，得到5’UTR 108-207堿基缺失的EV-D68微復制子突變體：pHH21-EV-D68_Δ180-207-f-Luc。

在其中一個實例中，步驟(4)中所述overlapping-PCR的程序為95℃30s，53℃30s，72℃1.5min，五個循環，之后95℃30s，53℃30s，72℃1min，25個循環。

在其中一個實例中，步驟(6)所述載體為VR1012載體。

在其中一個實例中，步驟(9)所述載體為pHH21載體。

在其中一個實例中，步驟(7)和(10)中所述PCR的程序為95℃20s，55℃20s，72℃5min，18個循環。

一種基于RNA聚合酶I系統的腸道病毒68型微復制子體系的構建方法得到的腸道病毒68型微復制子體系。

本發明還提供了包含上述微復制子的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α；

本發明的有益效果是：本發明合成腸道病毒68型毒株Fermon5，-UTR基因，采用重疊PCR技術，建立了帶有螢火蟲熒光素酶f-Luc報告基因的EV D68微復制子報告系統，可以定性和定量檢測螢火蟲熒光素酶表達情況以模擬EV D68復制和蛋白表達；獲得的微復制子在轉染細胞24小時就可以檢測到明顯的報告熒光，是一個穩定、安全的熒光報告體系；獲得的微復制子不會產生完整的病毒，可以在普通實驗室進行實驗檢測，為針對EV D68病毒的復制機制研究以及疫苗、藥物的研發提供了一個簡單、快速、安全、靈敏的檢測平臺。

本發明是基于人RNA聚合酶I(hPolI)系統來實現的，hPolI是人的RNA聚合酶I，通過這個系統可以在細胞中直接將DNA轉錄為RNA，從而使得病毒RNA在細胞內直接產生，無需體外轉錄先合成病毒RNA,再將病毒RNA轉染細胞，節省實驗步驟和試劑，避免RNA污染，極大簡化實驗流程。本發明使用的pHH21質粒帶有hPolI序列以及mTer序列，hPolI為人的RNA聚合酶I啟動子，用來啟動微復制子的轉錄；mTer為鼠源終止子，是給予RNA聚合酶I轉錄終止信號的DNA序列。

附圖說明

圖1中A為EV-D68基因組結構示意圖，B為微復制子結構示意圖，C為微復制子在pHH21質粒中位置示意圖(hPol1為人Pol1啟動子，mTer為45S RNA終止子)；

圖2為微復制子全長PCR結果；

圖3中A為轉染293T細胞24h單報告檢測結果，B為轉染RD細胞24h單報告檢測結果；

圖4中A和B分別為微復制子和微復制子突變體的RNA結構預測圖(mfold軟件預測)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進一步說明。

以下實施例僅用于說明本說明，但不用來限制本發明的包含范圍，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形人在本發明的保護范圍內。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞

所用細胞為人橫紋肌肉瘤細胞(rhabdomyosarcoma cells，RD，ATCC No.CCL-136)，人胚腎細胞(Human Embryonic Kidney 293T cells，293T，ATCC No.CRL-3216)。

1.1.2實驗試劑

所用主要試劑為DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒(QIAGEN公司)；高保真酶TransStart Fastpfu DNA Polymerase、Dpn1酶(Transgen公司)；限制性內切酶、轉染試劑、細胞培養基(Thermo公司)；血清(Gbico公司)；基因與引物合成以及測序由蘇州GENEWIZ公司完成。

2實施例

實施例1 EV D68F-Luc微復制子的構建

1、擴增引物的設計與合成

從genebank中選取EV D68Fermon毒株的基因組序列，根據基因組5’UTR序列，設計EV D68Fermon的保守引物5’UTR F2、5’UTR R和5’UTR F1，根據f-Luc基因序列和Fermon基因組序列，設計f-Luc的引物f-Luc F和f-Luc R1、f-Luc R2、f-Luc R3，由GENEWIZ公司合成。具體引物序列如下：

5’UTR F1：5’-aaaactgcagttaatacgactcactataggttaaaacagctctg-3’(SEQ ID NO:6)

5’UTR F2:5’-gactcactataggttaaaacagctctggggttgttcccac tc-3’(SEQ ID NO:2)

5’UTR R:：5’-gtttttggcgtcttccattgttataaataagtttaaac-3’(SEQ ID NO:3)

f-Luc F:5’-gtttaaacttatttataacaatggaagacgccaaaaac-3’(SEQ ID NO:4)

f-Luc R1:5’-gaaagtaactgtaacttgggtttcaattagagttatttacacggcgatctttccgcc-3’(SEQ ID NO:5)

f-Luc R2:5’-ggtccccaagtgaccaaaatttacctctaagtgaaagtaactgtaacttgggtttc-3’(SEQ ID NO:7)

f-Luc R3:5’-ttttccttttgcggccgctttttttttttttttttttttttttggtccccaagtgaccaaaatttac-3’(SEQ ID NO:8)

G394C F：5’-ctcatggtgaaaaccatcagacgctagacatgaac-3’(SEQ ID NO:9)

G394C R：5’-gttcatgtctagcgtctgatggttttcaccatgag-3’(SEQ ID NO:10)

pHH21F：5’-atcggtctcctattttaaaacagctctggggttg-3’(SEQ ID NO:11)

pHH21R：5’-atcgcgtctccgggatttttttttttttttttttttttttggtccccaagtgaccaaaatttacc-3’(SEQ ID NO:12)

5’UTR 180-207F：5’-gagcaagcacttctgtctacggttgaaaacaactta-3’(SEQ ID NO:13)

5’UTR 180-207R：5’-taagttgttttcaaccgtagacagaagtgcttgctc-3’(SEQ ID NO:14)

2、PCR擴增與克隆

得到公司合成的病毒基因組5’UTR cDNA后，PCR擴增的引物為正向引物5’UTR F2和反向引物5’UTR R，按照TransStart Fastpfu DNA Polymerase(Transgen公司)說明書構建50μL反應體系，擴增得到EV D68的5’UTR片段。

以實驗室保存pcDNA3.1-f-Luc質粒為模板，f-Luc F和f-Luc R1為引物，擴增得到f-Luc片段，再用f-LUC F和f-Luc R2為引物，擴增得到PCR產物，最后以F-Luc F和f-Luc R3為引物，擴增得到f-Luc-3’UTR片段。

以得到的5’UTR片段和f-Luc-3’UTR片段，5’UTR F1和f-Luc R3為引物，overlapping-PCR擴增得到完整的f-Luc微復制子片段(5’UTR-f-Luc-3’UTR-polyA)(如圖2所示)。

將f-Luc微復制子片段與VR1012質粒進行Pst1和Not1雙酶切，酶切片段回收后，進行T4連接獲得VR1012-f-Luc微復制子。

以VR1012-f-Luc微復制子為模板，利用G394C F和G394C R引物進行點突變，使5’UTR區的BsmB1酶切位點消失。

以突變后的VR1012-f-Luc微為模板，pHH21 F和pHH21 R為引物，擴增得到帶有BsmB1酶切位點的f-Luc微復制子片段。

將帶有BsmB1酶切位點的f-Luc微復制子片段與pHH21質粒進行BsmB1酶切，酶切片段回收，連接，轉化，獲得EV-D68微復制子：pHH21-EV-D68-f-Luc(如圖1所示)。

實施例2 EV-D68微復制子突變體構建。

經mfold軟件分析發現5UTR 180-207缺失會使RNA結構發生變化(如圖4所示)，因此突變5UTR 180-207區域可能會使5UTR功能發生變化。以pHH21-EV-D68-f-Luc為模板，5UTR 180-207 F(SEQ ID NO:13)和5UTR 180-207 R(SEQ ID NO:14)為引物，PCR反應，條件如下：95℃20s，55℃20s，72℃5min，18個循環。PCR產物經DpnI酶37℃處理30分鐘，轉化感受態大腸桿菌DH5α，獲得5’UTR 108-207堿基缺失的EV-D68微復制子突變體：pHH21-EV-D68_Δ180-207-f-Luc。

實施例3 EV-D68微復制子活性檢測

使用PEI轉染試劑將1μg pHH21、EV-D68微復制子和EV-D68微復制子突變體分別轉染細胞。轉染24或48小時后，收集轉染細胞，用PBS輕輕漂洗兩次，每孔加入500μLPBS吹起細胞并收集到離心管中。取100μL上清液加入96孔板。按照Luciferase Assay System(Promeg,Cat No:N1120)說明書操作步驟，使用LB960多功能檢測儀檢測熒光素酶數值，分析firefly luciferase數據，獲得報告基因活化值(如圖3所示)。

實施例4 EV-D68 5’UTR RNA二級結構預測

使用mfold軟件(網址)對微復制子和微復制子突變體的RNA結構進行預測。

序列表

<110> 天津大學

<120> 基于RNA 聚合酶I系統的腸道病毒68型微復制子的構建及應用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaaaacagc tctggggttg ttcccactca agggcccacg tggcggctag tactctggta 60

tctcggtacc tttgtacgcc tgttttaatt ccctccccaa cgtaacttag aagcttttaa 120

accaaagctc aataggtgga gcgcaaacca gcgctcttat gagcaagcac ttctgtctcc 180

ccggtgtggt tgtatagact gtccccacgg ttgaaaacaa cttatccgtt aaccgctata 240

gtacttcgag aaacctagta ttgccttcgg agtgttgatg cgttgcgctc agcacactaa 300

cccgtgtgta gcttgggtcg atgagtctgg acgtacccca ctggcgacag tggtccaggc 360

tgcgttggcg gcctactcat ggtgaaaacc atgagacgct agacatgaac aaggtgtgaa 420

gagtctattg agctgctata gagtcctccg gcccctgaat gcggctaatc ctaaccatgg 480

agcaagtgct cacaaaccag tgagttactt gtcgtaacgc gcaagtccgt ggcggaaccg 540

actactttgg gtgtccgtgt ttcacttttt acttttatga ctgctaatgg tgacaattta 600

atattgttac catttggctt gtcgaattga tcacataaga tctatagttt tgttcactga 660

tttgctttga aataatctca cctcaaaacc tccagtacat aacatttaaa gagtttaaac 720

ttatttataa ca 732

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactcactat aggttaaaac agctctgggg ttgttcccac tc 42

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttttggcg tcttccattg ttataaataa gtttaaac 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtttaaactt atttataaca atggaagacg ccaaaaac 38

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaagtaact gtaacttggg tttcaattag agttatttac acggcgatct ttccgcc 57

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaactgcag ttaatacgac tcactatagg ttaaaacagc tctg 44

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtccccaag tgaccaaaat ttacctctaa gtgaaagtaa ctgtaacttg ggtttc 56

<210> 8

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttttcctttt gcggccgctt tttttttttt tttttttttt tttggtcccc aagtgaccaa 60

aatttac 67

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcatggtga aaaccatcag acgctagaca tgaac 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttcatgtct agcgtctgat ggttttcacc atgag 35

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcggtctcc tattttaaaa cagctctggg gttg 34

<210> 12

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atcgcgtctc cgggattttt tttttttttt tttttttttt ggtccccaag tgaccaaaat 60

ttacc 65

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gagcaagcac ttctgtctac ggttgaaaac aactta 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taagttgttt tcaaccgtag acagaagtgc ttgctc 36