lncRNA作為生物標志物在肺腺癌診治中的應用的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域，涉及lncrna作為生物標志物在肺腺癌診治中的應用，所述lncrna生物標志物為loc101930114。

背景技術：

肺癌在世界范圍內的死亡率居于首位。目前在中國，肺癌的發病率呈逐年上升的趨勢。肺癌按照臨床病理類型的不同可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)兩類。其中，非小細胞肺癌在肺癌中最常見，約占肺癌中的85％，肺腺癌又是其中最主要的部分。對于非小細胞肺癌而言，手術治療仍是臨床治療的首選，對于早期的非小細胞肺癌患者(i和ii期，以及較理想的iiia期患者)，肺癌根治術仍是首要的治療方法。相關文獻報道，iiia期患者術后的1,2,5年生存率明顯高于非手術治療組。對于失去肺癌根治手術時機的晚期患者來說，治療應以化療為主。近些年來，隨著精確放療技術發展，通過減少放療次數，增加單次放療的劑量，放療的療效有了很大的提高。

隨著人類對腫瘤在基因和分子水平的深入認識，分子靶向藥物由于它的準確性和較低的藥物毒副作用，越來越受到醫療界人士的重視和關注，成為當今肺癌研究領域的熱點。如目前在非小細胞治療領域最為成熟的tkt(小分子酪氨酸激酶抑制劑)。該類藥物通過與egfr的細胞內磷酸化酶作用位點相結合，抑制磷酸化酶的活化，從而抑制egfr和下游信號通路的活化。當前分子靶向治療的研究重點主要是尋找更高效的癌癥編碼及調控基因，通過對其作用機制的研究，進而調節和控制基因的表達，抑制腫瘤的發展。

rna按照經典分類方法可分為信使rna(mrna)、轉運rna(trna)和核糖體rna。除此之外，按照是否能夠具有編碼蛋白功能可分為編碼rna和非編碼rna(non-codingrna)。早期，人們對于rna的研究僅限于編碼rna，但經過研究發現，該部分rna僅占基因組的1％，剩下的均為非編碼rna。于是，對于非編碼rna功能的挖掘成為了近些年來科學家們關注的重點。而ncrna根據所含堿基數量的多少又可以分為小分子非編碼rna(mirna，microrna)和長鏈非編碼rna(lncrna，longnon-codingrna)。其中，mirna經過這些年的研究已經取得了長足的進步，一些mirna已經成為腫瘤靶向治療的新藥運用于臨床。但lncrna的研究目前剛處于起步階段，在這一領域，還有很大的空白需要研究人員去填補。

這些年來，在人類各種腫瘤中，不斷有新的異常表達的lncrna被挖掘。從目前的研究來看，lncrna在腫瘤中的作用貫穿腫瘤的整個發生和發展的過程中。既可對癌細胞的周期、凋亡、轉移等產生影響，也可在表觀遺傳的層面上宏觀調控腫瘤細胞的很多特征。由于lncrna與腫瘤的發生和發展有重要關系，人們看到了它在腫瘤的診治中可能具有的重大潛力。診斷方面，在腫瘤組織中往往有lncrna的異常表達，其可能成為重要的腫瘤標志物，尤其在一些腫瘤的早期，由于腫瘤組織很小，傳統的影像學方法很難發現。而通過檢測血液中的某種lncrna水平，卻可以方便快速了解病人患某種腫瘤的可能性。治療方面，對lncrna在癌癥中作用和機制的研究可以找到新的腫瘤治療靶點，研制出新的高效、精準、低毒副作用的抗癌新藥。

目前，lncrna的研究還處于起步階段，對其機制和功能的認識也還在探索之中。lncrna不僅在生物體中發揮各種重要的生物學功能，同時也參與多種疾病的發生和發展。在腫瘤研究領域，lncrna仍是一個相對未知的領域，我們需要通過對lncrna的不斷研究來為腫瘤的診治提供新的契機。

技術實現要素：

為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可用于肺腺癌診治的lncrna生物標志物，本發明所提供的lncrna生物標志物對于人肺腺癌具有較高的靈敏度和特異性，可作為新型生物標志物用于肺腺癌的檢測。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種肺腺癌的生物標志物，所述標志物為loc101930114，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發明提供了上述的loc101930114基因及其表達產物在制備診斷肺腺癌的產品中的應用。

進一步，上面所述的產品能夠通過檢測樣本中的loc101930114基因的表達水平來診斷患者是否患有肺腺癌，loc101930114在肺腺癌患者中表達下調。

進一步，所述診斷肺腺癌的產品包括芯片、制劑或試劑盒。

本發明提供了一種芯片、制劑或試劑盒，其含有上述的loc101930114。

進一步，所述芯片可用于檢測包括loc101930114基因在內的多個基因(例如，與肺腺癌相關的多個基因)的表達水平；所述試劑盒可用于檢測包括loc101930114基因在內的多個基因(例如，與肺腺癌相關的多個基因)的表達水平。

本發明提供了上面所述的芯片、制劑或試劑盒在制備診斷肺腺癌的產品中的應用。

本發明提供了上述的loc101930114在篩選人肺腺癌診治藥物中的用途。

本發明提供了loc101930114在制備預防或治療肺腺癌的藥物組合物中的應用。

進一步，所述藥物組合物包括loc101930114基因和/或其表達產物的促進劑。

本發明提供了一種用于預防或治療肺腺癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的上面所述的促進劑。

進一步，所述藥物組合物還包括與所述促進劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

本發明的藥物還可與其他治療肺腺癌的藥物聯用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。

還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據癥狀的嚴重程度、復發的頻率和治療方案的生理應答，調整本發明藥物組合物的劑量。

本發明的優點和有益效果：

本發明首次發現了loc101930114的差異表達與肺腺癌的發生發展相關，通過檢測受試者樣本中loc101930114的表達，可以判斷受試者是否患有肺腺癌，從而指導臨床醫師給受試者提供預防方案或者治療方案。

本發明發現了一種肺腺癌的新的生物標志物-loc101930114，利用生物標志物來預防或治療肺腺癌，更為敏感、特異。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測loc101930114基因在肺腺癌組織中的表達情況圖；

圖2是利用qpcr檢測loc101930114在肺腺癌細胞中的轉染情況圖；

圖3是用cck-8法檢測loc101930114基因對肺腺癌細胞增殖的影響圖；

圖4是用流式細胞儀檢測loc101930114基因對肺腺癌細胞凋亡的影響圖；

圖5是利用transwell小室檢測loc101930114對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響圖；其中圖a是loc101930114對肺腺癌細胞遷移的影響圖；圖b是loc101930114對肺腺癌細胞侵襲的影響圖。

具體的實施方式

本發明經過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次發現了肺腺癌中loc101930114呈現特異性低表達。實驗證明，通過特異提高loc101930114的表達平或表達產物的活性，能夠有效地抑制肺腺癌細胞的生長和侵襲，從而達到抑制肺腺癌的效果。

生物標志物

術語“生物標志物”是其在組織或細胞中的表達水平與正常或健康細胞或組織的表達水平相比發生改變的任何基因。

本領域技術人員將認識到，本發明的實用性并不局限于對本發明的標志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標志物基因可具有seqidno.1指定的核苷酸序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cdna序列諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cdna序列。

本發明可以利用本領域內已知的任何方法測定基因表達。本領域技術人員應當理解，測定基因表達的手段不是本發明的重要方面。可以在轉錄水平上檢測生物標志物的表達水平。

在一些實施方案中，在轉錄水平上檢測生物標志物的表達水平。利用核酸雜交技術進行具體dna和rna測量的多種方法是本領域技術人員已知的。一些方法涉及電泳分離(例如，用于檢測dna的southern印跡和用于檢測rna的northern印跡)，但是也可以在不利用電泳分離的情況下進行dna和rna的測量(例如，通過斑點印跡)。基因組dna(例如，來自人)的southern印跡可用于篩選限制性片段長度多態性(rflp)，以檢測影響本發明多肽的遺傳病癥的存在。可以檢測所有形式的rna。

芯片

本發明的所述的lncrna芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于loc101930114所示的部分或全部序列。

具體地，可根據本發明所述的lncrna，設計出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個可尋址位置均含有一個與其相連的特征性寡核苷酸。根據需要，可將寡核苷酸陣列分成多個亞陣。

術語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的分子。除非另有指出，術語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結合的多核苷酸探針。根據雜交條件的嚴格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

術語“互補的”或“互補性”用于指代通過堿基配對原則相關的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-a-g-t-3'”與序列“3'-t-c-a-5'”互補。互補性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的堿基根據堿基配對原則匹配。或者，也可在核酸之間存在“完全”或“總”互補性。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間的雜交效率和強度具有顯著的影響。這在擴增反應以及依賴核酸之間的結合的檢測方法中尤其重要。

術語“嚴格性”用于指代進行核酸雜交所處的條件：溫度、離子強度和其他化合物(諸如有機溶劑)的存在。在“低嚴格條件”下，所關注的核酸序列將與其精確互補序列、具有單個堿基錯配的序列、密切相關的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)以及只有部分同源性的序列(例如，具有50-90％同源性的序列)雜交。在“中等嚴格性條件”下，所關注的核酸序列將只與其精確互補序列、具有單個堿基錯配的序列和密切相關的序列(例如，90％或更高同源性)雜交。在“高嚴格性條件”下，所關注的核酸序列將只與其精確互補序列和(取決于諸如溫度的條件)具有單個堿基錯配的序列雜交。換句話講，在高嚴格性條件下，可升高溫度以排除與具有單個堿基錯配的序列雜交。

本發明中針對loc101930114基因的寡核苷酸探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。

本發明中所述固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

所述的loc101930114芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dt串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發明的lncrna芯片。

試劑盒

本發明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測loc101930114的表達。

優選的，所述的制劑或試劑盒中還含有用于標記rna樣品的標記物，以及與所述標記物相對應的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取rna、pcr、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

藥物篩選

本發明提供了loc101930114在篩選人肺腺癌診治藥物中的用途。即：用候選物質處理表達loc101930114的體系；和檢測所述體系中loc101930114的表達或活性；若所述候選物質可促進loc101930114的表達或活性，則表明該候選物質是抑制肺腺癌的潛在物質。所述的表達loc101930114的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可以是內源性表達loc101930114的細胞；或可以是重組表達loc101930114的細胞。所述的表達loc101930114的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

loc101930114的促進劑和藥物組合物

基于本發明的發現，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含loc101930114的促進劑。

所述的loc101930114的促進劑是指任何可提高loc101930114基因或表達產物穩定性、上調loc101930114的表達、增加lncrnaloc101930114的有效作用時間或促進loc101930114基因的轉錄的物質，這些物質均可用于本發明，作為對于上調loc101930114基因的表達有用的物質，從而可用于預防或治療肺腺癌。

作為本發明的一種優選方式，所述的loc101930114的促進劑是一種含有loc101930114的表達載體。所述的表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。

本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發明所需的表達載體。這些方法包括體外重組dna技術、dna合成技術、體內重組技術等。所述的表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。

在本發明中，是本領域已知的各種載體，如市售的載體、包括質粒、粘粒、噬菌體、病毒等。表達載體向宿主細胞中的導入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、deae葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質體轉染、與細胞膜透過性肽的結合等周知的方法。

術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如cho細胞、cos細胞等。

藥物組合物

本發明中的藥物組合物包括loc101930114的促進劑、和/或與所述促進劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

術語“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。

本發明中，可以采用本領域熟知的多種方法來將所述的促進劑或其轉錄基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將loc101930114的促進劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶loc101930114的促進調劑的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，具體情況需視所述的促進劑的類型而定，這些均是本領域技術人員所熟知的。

本發明所述的loc101930114的促進劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于：所述的loc101930114的促進劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。

術語“樣本”以其最廣泛的含義使用。在一種含義中，意在包括從任何來源獲得的標本或培養物，以及生物和環境樣本。生物樣本可獲自動物(包括人)并涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液制品，諸如血漿、血清等。然而，此類樣本不應解釋為限制適用于本發明的樣本類型。

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與肺腺癌相關的基因標志物

1、樣品收集

各收集8例肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織樣本。肺腺癌腫瘤組織標本取材部位為主要腫瘤區域，位于腫瘤腫塊中外1/3與正常組織交接處，排除腫瘤中心明顯壞死、鈣化部分以及腫瘤外圍正常肺組織；癌旁正常肺組織標本取自腫瘤邊緣5cm以上的部位，肉眼觀察無明顯變化。上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備(利用e.z.n.a.kit進行操作)

在研缽中導入液氮，取上述獲得的組織放入研缽中，在液氮中剪碎并研磨成粉末，剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，隨后轉入玻璃勻漿器中；組織勻漿在玻璃勻漿器中加入trizol試劑，在冰上研磨組織。將勻漿后組織勻漿液轉入無rna酶的ep管中，室溫下靜置5min。按照試劑盒中的說明書提取分離rna。具體如下：

1)rna的分離：

在ep管中加入0.2m1氯仿，蓋緊ep管蓋，手動劇烈振蕩15s，使其充分混勻。室溫下孵化5min。然后在4℃下以14000g離心15min。離心后樣品分為三層，rna存在于上層水相中。

2)rna沉淀

將分離得的水相取450μl移至新的無rna酶的ep管中，按照1:1的比例加入450μl異丙醇，上下顛倒混勻后在室溫下孵化10min，4℃14000g離心10min。

3)rna洗脫

離心后小心移去上清，加入1ml75％乙醇(滅酶處理，現用現配并在冰上預冷)沖洗rna，隨后4℃7500g離心5min。

4)rna再溶解

小心移去洗滌之后的上清，在超凈工作臺中打開ep管管蓋，在室溫下放置rna樣本5-10min，晾干。加入無rna酶處理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。

5)rna樣品的質量分析

分光光度計檢測：

nanodrop1000分光光度計檢測rna樣品，rna-seq測序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：

將上述提取的rna進行瓊脂糖凝膠電泳，agilenttechnologies2100bioanalyzer檢測rna樣品質量，觀察28srrna和18srrna主帶明顯、無降解、rna完整性指數合格、濃度達到要求，可以用于芯片的lncrna表達譜及篩選實驗。

3、逆轉錄和標記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉錄成cdna，同時用cy3分別標記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進行雜交。

5、數據分析

利用agilentgenespring軟件對芯片結果進行分析，篩選表達量具有顯著性差異(標準為該lncrna在癌與癌旁的表達量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncrna。

6、結果

結果顯示，loc101930114在肺腺癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織中的表達量。

實施例2qpcr測序驗證loc101930114基因的差異表達

1、對loc101930114基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織各50例。

2、rna提取步驟如實施例1所述。

3、逆轉錄

1)反應體系：

rna模板1μl，隨機引物1μl，雙蒸水加至12μl，混勻，低轉速離心，65℃5min，然后放在冰上冷卻。

繼續在12μl反應液中加入下列成分：

5×反應緩沖液4μl，rna酶抑制劑(20u/μl)1μl，10mmdntp混合液2μl，amv反轉錄酶(200u/μl)1μl；充分混勻并進行離心處理；

2)逆轉錄反應條件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶鏈反應

引物設計：

根據genebank中loc101930114基因和gapdh基因的序列設計qpcr擴增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

loc101930114基因：

正向引物為5’-ggagatgatggagagtat-3’(seqidno.2)；

反向引物為5’-ccacttattccacacttc-3’(seqidno.3)。

gapdh基因：

正向引物為5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.4)；

反向引物為5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.5)。

配制pcr反應體系：

2×qpcr混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反轉錄產物2.5μl，ddh2o8.0μl。

pcr反應條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40個循環，60℃5min延伸反應。75℃至95℃，每20s升溫1℃，繪制溶解曲線。以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、統計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統計軟件來進行統計分析的，癌與癌旁組織的配對比較采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。

6、結果

結果如圖1所示，與肺腺癌癌旁組織相比，loc101930114在肺腺癌組織中表達下調，差異具有統計學意義(p<0.05)，同芯片檢測結果一致。

實施例3loc101930114過表達

1、細胞培養

人肺腺癌細胞株a549，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培養基在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養箱中培養。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規消化傳代。

將培養瓶中的細胞用胰酶進行消化并接種在6孔板中，保證細胞數為2-8×10⁵個/孔，加入細胞培養基。過夜，第二天觀察細胞密度，細胞密度為70％以上可進行轉染。

2、基因過表達載體的構建

根據loc101930114的cdna序列(nr_134509.1，如seqidno.1所示)合成特異的pcr擴增引物，在5’端引物和3’端引物分別添加hindiii和xhoi兩個限制性酶切位點。以肺腺癌患者血液提取和反轉錄得到的cdna作為擴增模板，上述cdna序列經限制性內切酶hindiii和xhoi雙酶切后插入到經hindiii和xhoi雙酶切的真核細胞表達載體pcdna3.1中，連接獲得的重組載體pcdna3.1-1用于后續實驗。

3、轉染

將肺腺癌細胞分為3組，分別為對照組(a549)、空白對照組(轉染pcdna3.1-nc)、實驗組(轉染pcdna3.1-1)。使用脂質體2000進行載體的轉染，具體轉染方法按照說明書的指示進行。pcdna3.1空載體和pcdna3.1-1的轉染濃度均為0.5μg/ml。

4、qpcr檢測loc101930114基因的轉錄水平

4.1細胞總rna的提取

1)將6孔板中的細胞培養液倒掉，用pbs沖洗兩次，各孔加入1mltrizol試劑，室溫放置5min。

2)加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，4℃，12000g離心15min。

3)水相轉移到新管中，加入4.5m1異丙醇，室溫放置10min；4℃，10000g離心10min。

4)倒掉液體，用lml的75％乙醇洗ep管壁。4℃，7500g，離心5min。

5)倒掉清洗后的75％乙醇，室溫晾置5-10min。

6)加入25μ1無rna酶的depc水，-70℃保存。

4.2逆轉錄步驟同實施例2。

4.3qpcr擴增步驟同實施例2。

5、統計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統計軟件來進行統計分析的，loc101930114基因過表達組與對照組之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。

6、結果

結果如圖2顯示，與非轉染組與轉染空白質粒組相比，轉染loc101930114組中過表達loc101930114，差異具有統計學意義(p<0.05)。

實施例4loc101930114基因對肺腺癌細胞增殖的影響

采用cck-8實驗檢測loc101930114基因對肺腺癌細胞增殖能力影響。

1、細胞培養與轉染步驟同實施例3。

2、第二天將細胞取出，顯微鏡下觀察細胞生長情況，1ml/孔加入含edta的胰酶，進行細胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入細胞培養基混勻使細胞懸浮，然后進行細胞計數。

3、將細胞懸液濃度稀釋為15000個/ml，之后往96孔板中進行接種，每孔加入細胞懸液200μ1，細胞控制在3000個左右，接種8個復孔。設置pcdna3.1-1實驗組和pcdna3.1-nc對照組。共鋪4塊96孔板分別用于24h、48h、72h、96h4個檢測時間點。

4、24h后，將第一塊96孔板取出，每孔中加入10μ1的cck-8檢測液，將96孔板繼續放入細胞培養箱中孵育4h左右，用酶標儀檢測各孔在450nm波長處的吸光度值并記錄數據。

5、在48h、72h、96h后分別重復步驟4中的操作，最后統計出各時間點的吸光度值，作出生長曲線圖。

6、統計學分析

實驗都是按照重復3次來完成的，采用spss18.0統計軟件來進行統計分析，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。

7、結果

結果如圖3所示，與對照相比，實驗組在轉染pcdna3.1-1后，細胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統計學意義(p<0.05)說明loc101930114具有抑制細胞增殖的作用。

實施例5loc101930114基因對肺腺癌細胞凋亡的影響

使用流式細胞儀檢測loc101930114基因對細胞凋亡的影響。

1、細胞培養步驟同實施例3。

2、細胞轉染步驟同實施例3。

3、步驟

1)將3m110×上樣緩沖液用27m1蒸餾水稀釋。

2)收集細胞樣本并用預冷的pbs清洗。

3)將細胞加入lml1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml1×上樣緩沖液，將細胞懸液中細胞濃度調整為1×10⁶個/ml。

5)將細胞懸液取出100μ1，加入ep管中。

6)將5μl的annexinvfitc加入ep管中，混勻ep管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μ1pi染液，在室溫下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，輕輕混勻，1h內上流式細胞儀進行檢測。

3、統計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。

4、結果：

結果如圖4所示，實驗組與對照組相比，細胞凋亡率具有顯著的變化(p<0.05)，該結果說明，loc101930114對肺腺癌細胞的凋亡有明顯的影響。

實施例6細胞遷移及侵襲實驗

1、transwell小室制備

無菌條件下matrigel冰浴融化，用pbs進行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含bsa的無血清培養液對基底膜進行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細胞懸液

細胞撤血清饑餓處理12-24h，對細胞進行消化處理，終止消化后進行離心，去除上層培養液。用pbs對沉淀細胞進行清洗，加入含有bsa的無血清培養基對其進行重懸。調整細胞的密度至5×l0⁵個/ml。

3、細胞接種

取細胞懸液200μ1(遷移實驗為100μ1，侵襲實驗為200μ1)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μ1含fbs的1640培養基。把細胞放入細胞培養箱中培養24h。

4、染色

細胞在培養結束后使用dapi染色。把小室細胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室溫染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計數。

5、結果

結果如圖5所示，在肺腺癌細胞轉染質粒之后，與對照組相比，實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結果說明loc101930114能夠抑制肺腺癌的遷移及侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護范圍內。

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<110>河北醫科大學第四醫院

<120>lncrna作為生物標志物在肺腺癌診治中的應用

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