使用CRISPR/Cas9技術靶向敲除水稻矮桿基因SD1的方法與流程

本發明屬于植物分子生物學與生物技術領域，具體涉及一種基于cripsr/cas9基因組編輯技術靶向敲除水稻矮桿基因sd1的方法。

背景技術：

水稻原產于中國，是世界主要糧食作物之一。中國水稻播種面占全國糧食作物的1/4，而產量則占一半以上，為我國重要糧食作物。

人類在大約一萬年前開始馴化水稻時，就選擇出了一個與高產有關的重要基因。這個基因叫做半矮稈基因sd1，它使水稻長得較矮，從而能結出更多谷粒，并且抗倒伏的能力更強。圍繞這個基因進行的水稻矮化育種，是20世紀中期全球第一次綠色革命的關鍵內容。

sd1參與赤霉素的生物合成，編碼由389個氨基酸組成的ga20氧化酶(ga20ox)。ga20ox是赤霉素合成途徑中的關鍵酶，催化ga53轉換為ga20。sd1基因的突變引起的ga20ox活性的下降，會使水稻植株矮化。

crispr/cas9系統是近年來發展起來的一種基因組dna編輯技術，它的原理是利用一段靶基因序列特異的sgrna，引導cas9核酸內切酶，對靶基因的dna進行切割、編輯。crispr/cas9技術已經被證明可以非常有效的在第一代轉基因水稻中編輯靶基因序列，并且編輯后的序列可以穩定的遺傳。crispr/cas9系統與zfns(鋅指核酸酶)和talens(轉錄激活因子樣效應物核酸酶)等基因編輯技術相比，具有設計和構建簡單、突變效率高、多靶點同時編輯等優點。

過去，水稻矮化育種主要通過誘變獲得矮化水稻品種，或者通過雜交的方法將矮桿基因導入到其它的水稻品種中，這兩個方法獲得矮桿水稻株系的周期較長、工作量大、成本高。通過crispr/cas9基因編輯系統直接對水稻的sd1基因進行定點突變，創制水稻矮桿株系，可以大大的縮短矮桿育種的周期。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，提供一種基于crispr/cas9系統的水稻sd1基因定點敲除的方法，及利用該方法在不同水稻品種中創制矮桿水稻株系的應用。本發明利用sd1基因編碼的ga20氧化酶是赤霉素合成途徑中的關鍵酶的特點及crispr/cas9系統基因組定點編輯功能，定點突變sd1基因的核苷酸序列，改變sd1基因編碼的ga20氧化酶活性，從而得到矮桿的水稻株系。

使用crispr/cas9技術靶向敲除水稻矮桿基因sd1的方法，其特征在于，包括如下步驟：

a)選擇sd1基因編碼區第108至127核酸序列作為crispr/cas9系統的靶序列(seqidno.1)：aggatggagcccaagatcc；

根據靶序列設計兩條單核苷酸引物：

sd1-f1(seqidno.2)：tgtgtgaggatggagcccaagatcc

sd1-r1(seqidno.3)：aaacggatcttgggctccatcctca；

b)將單核苷酸引物sd1-f1和sd1-r1混合，通過退火反應形成二聚體結構，然后與載體片段bgk03進行連接，構建得到含有水稻sd1基因靶序列的質粒bgk03-sd1；

c)用含有bgk03-sd1質粒的根癌農桿菌eha105侵染水稻的愈傷組織，通過潮霉素篩選，再生獲得轉基因水稻植株；

d)利用如seqidno.4和seqidno.5所示的水稻sd1基因的特異引物，擴增基因組片段進行測序，篩選突變植株；

seqidno.4：gggtcattgattcgaccatc

seqidno.5：gtgctcggacacctggaagaac。

進一步地，所述水稻品種為申繁17、申繁24、申9b或申武1b。

crispr/cas9系統采用的靶序列為sd1編碼序列中包括5’-gn(19)ngg-3’的核酸序列，其中n為a、t、g、c中的任意一個堿基。靶序列(seqidno.1)：aggatggagcccaagatcc在水稻的基因組中是唯一的。

本發明根據crispr/cas9的設計原則，在水稻sd1基因編碼區確定crispr/cas9系統編輯的靶位點，根據靶位點的序列設計引物，構建crispr/cas9載體，用農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷組織，通過篩選鑒定，最后獲得sd1突變的不含轉基因dna片段的矮桿水稻品系。該方法應用于矮桿水稻品種的選育，可以免去雜交選育的工作，大大縮短矮桿品種選育的周期。

附圖說明

圖1是突變植株sd1測序圖。

圖2是潮霉素基因pcr檢測電泳圖。其中“m”是dl2000分子標記，“+”是質粒陽性對照，1-6是選取的部分t1代轉基因株系。

圖3是水稻野生型與sd1基因敲除突變植株的主莖高度對比圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明的技術方案做進一步詳細說明。

實施例1

水稻sd1基因的編碼區序列如seqidno.6所示。

本實施例crispr/cas9編輯靶序列長度為20bp，位于sd1編碼區的第108至127堿基位，編輯的靶序列為seqidno.1：aggatggagcccaagatcc。

根據靶序列合成兩條單核苷酸引物：

sd1-f1(seqidno.2)：tgtgtgaggatggagcccaagatcc

sd1-r1(seqidno.3)：aaacggatcttgggctccatcctca；

通過退火反應使得引物sd1-f1和sd1-r1形成二聚體結構，然后與bgk03載體片段進行連接，構建成含有水稻sd1基因靶序列的質粒bgk03-sd1。

用電激法將bgk03-sd1質粒轉化如農桿菌eha105，將含有bgk03-sd1質粒的農桿菌eha105在含有kan(50μg/μl)的lb平板上劃線，獲得單菌落。挑單菌落接種到3ml含利福平(25mg/l)和kan(50mg/l)的lb液體培養基中28℃搖菌培養過夜；第二天將菌液按1:20的比例接種于含利福平(25mg/l)、kan(50mg/l)和乙酰丁香酮(20mg/l)的ab液體培養基中，28℃，200rpm搖菌培養大約4h。離心收集農桿菌，加等體積含乙酰丁香酮(20mg/l)的aam液體培養基重懸，即可用于轉化水稻的受體材料。

本實施例以粳稻3系雜交稻的恢復系申繁17和申繁24，保持系申9b和申武1b為受體材料進行農桿菌轉化。每個品種去成熟的種子1000粒左右，去殼后用75％的乙醇浸泡1分鐘，倒掉75％乙醇后用30％安替福民溶液消毒30分鐘，用無菌水洗6次，用滅菌紗布吸干水分后將種子種到含2,4d(2mg/l)的nb培養基上26℃避光培養2周。將誘導出的愈傷組織切下，放入新的含2,4d(2mg/l)的nb培養基上，26℃培養7天。挑取狀態較好的愈傷組織，于備好的農桿菌菌液中浸泡8min，期間不時搖晃。吸出或倒掉菌液，將愈傷組織用無菌濾紙吸干，接種于共培養中(含100μm乙酰丁香酮)28℃暗培養72h。取出愈傷組織，轉入含有25mg/l潮霉素的篩選培養基上培養，2周后轉入含有50mg/l潮霉素的篩選培養基上繼續篩選。2周后將愈傷轉入預分化培養基上培養1周后，再轉入分化培養基光照培養，分化成苗后將小苗用1/2ms培養基生根壯苗獲得t0代植株，移入田間種植。

取t0代植株葉片提取dna，根據sd1基因的序列設計引物擴增，對pcr產物進行測序，確定靶序列發生突變的植株，所用引物序列為：

sd1-f5(seqidno.4)：gggtcattgattcgaccatc

sd1-r3(seqidno.5)：gtgctcggacacctggaagaac。

突變植株sd1測序圖如圖1所示。

將t0代檢測到有突變的植株收種，然后種植t1代。采集t1代植株的葉片提取dna，用引物sd1-f5和sd1-r3擴增測序，確定靶序列突變類型為純合突變或雜合突變；同時根據潮霉素基因序列設計引物，檢測潮霉素基因序列的存在，以此確定外源t-dna片段是否存在。選擇靶序列突變為純合突變同時潮霉素檢測為陰性的植株進行收種。所用的潮霉素基因檢測引物序列為：

hptf(seqidno.11)：cgttatgtttatcggcactttg

hptr(seqidno.12)：ttggcgacctcgtattgg。

圖2是潮霉素基因pcr檢測電泳圖。其中“m”是dl2000分子標記，“+”是質粒陽性對照，1-6是選取的部分t1代轉基因株系。

表1是水稻野生型與sd1基因敲除突變植株的主莖高度記錄表，圖3是水稻野生型與sd1基因敲除突變植株的主莖高度對比圖。

從表1和附圖3可以看出，水稻突變體主莖明顯縮短。

本發明通過本發明根據crispr/cas9的設計原則，在水稻sd1基因編碼區確定crispr/cas9系統編輯的靶位點，根據靶位點的序列設計引物，構建crispr/cas9載體，用農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷組織，通過篩選鑒定，最后獲得sd1突變的不含轉基因dna片段的矮桿水稻品系。該方法應用于矮桿水稻品種的選育，可以免去雜交選育的工作，大大縮短矮桿品種選育的周期。

sequencelisting

<110>上海市農業科學院

<120>使用crispr/cas9技術靶向敲除水稻矮桿基因sd1的方法

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<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>sd1基因編碼區108-127核酸序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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aaacggatcttgggctccatcctca25

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<211>20

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<213>水稻sd1基因編碼區

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<213>申繁17突變植株sd1基因突變序列

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<213>申武1b突變植株sd1基因突變序列

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