一種鑒定黃瓜全雌性狀的分子鑒別方法與流程

本發明屬于黃瓜育種領域，具體涉及植物基因型的鑒定方法，特別涉及一種鑒定黃瓜全雌性狀的分子水平鑒別方法，該方法適用于黃瓜全雌性分子輔助育種。

背景技術：

黃瓜是我國第二大設施蔬菜栽培作物，全雌性黃瓜是目前設施黃瓜生產的主栽品種，黃瓜全雌性育種在生產中具有極其重要的地位。全雌性黃瓜的生產優勢主要表現為：其一，黃瓜生產主要以幼嫩果實為主，雌花/子房生長期較短，采收頻繁。因此，植株上雌花數量在很大程度上決定黃瓜的生物學產量，所以所有節位均著生雌花的全雌性黃瓜具有極高的增產潛力；其二，由于整個植株沒有雄花，全雌性黃瓜材料在雜交育種中更具優勢，是大規模商業制種的理想材料。

然而，大量理論研究和生產實踐發現，控制黃瓜全雌性的f基因具有明顯的計量效應，主要表現為：在純合（ff）背景下，黃瓜植株表現為嚴格的全雌性，即在正常生長條件下植株所有節位均著生雌花；在雜合（ff）背景下，黃瓜植株表現為亞全雌性，即植株下部（早期）節位往往著生雄花，隨后才逐漸被雌花取代，且這種部分雄性化的現象還可以被不利環境條件所加劇。因此，在黃瓜育種中能否早期準確鑒定f基因背景的純合/雜合性即成為需要解決的育種難題。

黃瓜全雌性控制f基因的研究由來已久。目前的研究結果認為，在全雌性黃瓜中存在一個包含csacs1基因在內的約30kb基因組序列的加倍現象，而加倍后的兩個基因組片段產生串聯重復結構，串聯重復的交界點形成一個新基因，及csacs1g基因，也就是全雌性控制f基因。由于dna結構的復雜性，迄今為止，利用分子標記技術針對黃瓜f基因的檢測辦法僅是針對csacs1g基因的顯性檢測體系，沒有可能直接開發出檢測f基因拷貝數（用于區分純合ff和雜合ff遺傳背景）的共顯性檢測體系。這使得黃瓜全雌性遺傳育種工作存在不確定性隱患。

技術實現要素：

針對上述現有技術中存在的問題與缺陷，本發明的目的在于提供一種鑒定黃瓜全雌性狀的分子鑒別方法，該方法利用qpcr反應對于初始dna計量的檢測能力，開發出針對f基因拷貝數的檢測辦法，可以準確鑒定黃瓜f基因位點的基因型，達到區別全雌性和亞全雌性黃瓜的目的。

為了實現上述目的，本發明采用如下的技術解決方案是：一種鑒定黃瓜全雌性狀的分子鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：

人工合成四對核苷酸序列作為引物，這些引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中：

引物組合一，正向引物：5’-aaggcattggtagaatttatggcgg-3’

反向引物：5’-tggatagtatggagttgggaggaga-3’

引物組合二，正向引物：5’-tagattgatgagcaaaagcaggagc-3’

反向引物：5’-tatgggatgatgccaagcagtagta-3’

引物組合三，正向引物：5’-aaatctcttgggactggcagaaaag-3’

反向引物：5’-aaatggtgttggggttgtttcaca-3’

引物組合四，正向引物：5’-tcactgcttccacaaactgatcaac-3’

反向引物：5’-tgagggtctaaaggcgtacagaaaa-3’

提取黃瓜基因組的dna，以引物對黃瓜基因組dna進行qpcr檢測，獲得各引物組合對應的基因組dna擴增反應的ct值。

取引物組合一至組合三的qpcr擴增ct均值，與引物組合四擴增ct值進行

比較，比值計算方法采用2^-δct方法計算，比值≥2則檢測材料為全雌性黃瓜，比值≈1則檢測材料為非全雌系黃瓜，比值≈1.5則檢測材料為亞全雌系黃瓜。

所述的qpcr擴增反應包括：

使用sybrgreenrealtimepcrmastermix試劑盒，20μlpcr反應體系，包括10μl2xpcrmix，10μmol·l^-1正向引物0.5μl，10μmol·l^-1反向引物0.5μl，基因組dna20ng，使用ddh2o補齊反應體系至20μl；

實時定量qpcr擴增反應在abi7500fastreal-timepcr儀上進行，反應條

件為：95°c預變性10min；95°c變性20s，65°c退火/延伸30s，進行40個循環，讀取各反應ct值。

本發明的鑒別黃瓜全雌性狀的分子分析方法，步驟簡單快捷、穩定可靠，鑒定結

果與田間表型鑒定結果準確一致、重復性好，特別適用于黃瓜全雌性分子輔助育種，能夠很好地提高選擇效率，加速育種進程。

附圖說明

圖1為利用本發明檢測41個黃瓜種質資源和雜交組合的分析結果，a為引物組合一至引物組合三與引物組合四qpcr反應ct值分別計算相對比值的結果；b為引物組合一至引物組合三qpcr反應ct均值與引物組合四qpcr反應ct值的比值計算結果。

圖2為亞全雌系gy14*am56自交后代分離群體植株表型分析，a為分離群體中的全雌株；b為分離群體中的亞全雌株；c為分離群體中的非雌性株（雌雄異花同株植株）。

以下結合附圖和實施例對本發明作更詳細的說明。

具體實施方式

本發明的鑒定黃瓜全雌性狀的方法，首次以黃瓜全雌系、亞全雌系和非雌性系為試材，根據全雌性控制f基因附近基因組序列特點，利用生物信息學方法分析含有csacs1基因附近區段的dna含量變化，以及拷貝數變化的基因序列在黃瓜基因組中的同源序列分布情況。進而針對簡單拷貝數變異區域設計引物，以黃瓜基因組dna為模板進行qpcr分析。通過對于f基因附近基因組區段dna序列拷貝數分析，創建和優化黃瓜全雌性狀的分子鑒定體系，以期明確黃瓜全雌性控制基因遺傳背景，用以加快全雌性黃瓜分子育種進程。

具體包括如下步驟：

1、四對核苷酸序列為引物，這些引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中：

引物組合一，正向引物：5’-aaggcattggtagaatttatggcgg-3’

反向引物：5’-tggatagtatggagttgggaggaga-3’

引物組合二，正向引物：5’-tagattgatgagcaaaagcaggagc-3’

反向引物：5’-tatgggatgatgccaagcagtagta-3’

引物組合三，正向引物：5’-aaatctcttgggactggcagaaaag-3’

反向引物：5’-aaatggtgttggggttgtttcaca-3’

引物組合四，正向引物：5’-tcactgcttccacaaactgatcaac-3’

反向引物：5’-tgagggtctaaaggcgtacagaaaa-3’

2、黃瓜基因組dna的提取：選取黃瓜材料幼嫩未展開葉，采用ctab方法提取黃瓜基因組dna。

3、以步驟1所述核苷酸分子為引物，對步驟2黃瓜基因組dna進行qpcr擴增，獲得各引物組合對應的qpcr反應的ct值。qpcr擴增體系如下：

1)使用sybrgreenrealtimepcrmastermix試劑盒，20μlpcr反應體系，包括10μl2xpcrmix，10μmol·l^-1正向引物0.5μl，10μmol·l^-1反向引物0.5μl，基因組dna20ng，使用ddh2o補齊反應體系至20μl。

2)實時定量qpcr擴增反應在abi7500fastreal-timepcr儀上進行，反應條件為：95°c預變性10min；95°c變性20s，65°c退火/延伸30s，進行40個循環。讀取各反應ct值。

4、取引物組合一~三的qpcr擴增ct均值，與引物組合四擴增ct值進行比較，比值計算方法采用2^-δct方法計算。如比值≥2則檢測材料為全雌性黃瓜，如比值≈1則檢測材料為非全雌系黃瓜，如比值≈1.5則檢測材料為亞全雌系黃瓜。

以下是發明人給出的實施例，該實施例僅是用于理解本發明，本發明不限于這些實施例。

實施例1

1、人工設計合成的核苷酸序列作為引物：

引物組合一，正向引物：5’-aaggcattggtagaatttatggcgg-3’

反向引物：5’-tggatagtatggagttgggaggaga-3’

引物組合二，正向引物：5’-tagattgatgagcaaaagcaggagc-3’

反向引物：5’-tatgggatgatgccaagcagtagta-3’

引物組合三，正向引物：5’-aaatctcttgggactggcagaaaag-3’

反向引物：5’-aaatggtgttggggttgtttcaca-3’

引物組合四，正向引物：5’-tcactgcttccacaaactgatcaac-3’

反向引物：5’-tgagggtctaaaggcgtacagaaaa-3’

2、黃瓜基因組dna的提取：采用ctab方法分別提取41個黃瓜種質資源和品系的基因組dna。這41個黃瓜材料的詳細描述如下（圖1中使用試驗編碼，下文括號中為黃瓜品系原名），其中包括30個全雌系黃瓜自交系，分別為am001（wi2757），am003（2a），am008（ccmc），am011（nz1），am019（gp5158），am025（gy14），am116（pi292012），am120（pi308915），am132（pi356809），am142（pi370643），am168（pi432864），am188（pi483340），am192（pi500365），am195（pi508453），am196（pi508456），am206（1351a1），am207（7155b），am209（baparthm10-139），am213（cuzs0806），am214（cuzs0833），am216（dp1），am217（eom-402-10），am243（zeppelin），am249（msu713-5），am261（generallee），am263（harmonie），am267（excelsior），am269（ivoryqueen），am286（wi1983h），am297（cu110）；8個非雌性黃瓜自交系am260（jacksonclassic），am002（7012a），am004（midget），am97（pi267942），am98（pi271327），am99（pi271328），am272（northernpickling），am277（sv4719s）；以及3個亞全雌黃瓜材料tl*2757f1，gy14*am56，gy14*7284。

3、以步驟1所述四組核苷酸分子為引物，分別對上述41個黃瓜材料基因組dna

進行qpcr擴增。qpcr擴增體系如下：

1)使用sybrgreenrealtimepcrmastermix試劑盒，20μlpcr反應體系，包括10μl2xpcrmix，10μmol·l^-1正向引物0.5μl，10μmol·l^-1反向引物0.5μl，基因組dna20ng，使用ddh2o補齊反應體系至20μl。

2)實時定量qpcr擴增反應在abi7500fastreal-timepcr儀上進行，反應條件為：95°c預變性10min；95°c變性20s，65°c退火/延伸30s，進行40個循環。讀取各反應ct值。

4、以引物組合四的ct數值對其它三組的數值進行標準化，計算方法采用2^-δct

公式，結果如圖1a所示，a為引物組合一至引物組合三與引物組合四qpcr反應ct值分別計算相對比值的結果。隨后取引物組合一至引物組合三的平均值，與引物組合四相比較，計算獲得最終比值，結果如圖1b所示，b為引物組合一至引物組合三qpcr反應ct均值與引物組合四qpcr反應ct值的比值計算結果。由最終檢測結果可以發現，30個全雌性黃瓜材料中有29個材料的比值≈2，剩余的一個材料比值≈3；所有8個非雌性材料比值≈1；同時3個亞全雌材料比值≈1.5。

5、對亞全雌性材料gy14*am56進行自交驗證，結果在其后代分離群體中觀察

到全雌株系（圖2a），亞全雌株系（圖2b），以及非雌性株系（雌雄異花同株系，圖2c），且分離比例接近1:2:1，由此可以判定，株系gy14*am56的亞全雌性是由于具有ff基因型決定的，即其具有單拷貝的f基因。

綜合步驟4和步驟5可以發現，具有2拷貝（及多于2拷貝）f基因的個體，表現為全雌系，即本發明中表現為比值≥2；具有1拷貝f基因的個體，表現為亞全雌系，即本發明中表現為比值≈1.5；不具有f基因的個體，表現為非雌性系，即本發明中表現為比值≈1。因此，利用本發明創制的鑒別黃瓜全雌性狀的分子檢測方法與植株真實表型相一致，并且可以準確區別黃瓜全雌性和亞全雌性表型，適用于黃瓜全雌性狀分子輔助育種。

<110>西北農林科技大學

<120>一種鑒定黃瓜全雌性狀的分子鑒別方法

<160>8

<210>1

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合一正向引物序列

<400>1

5’-aaggcattggtagaatttatggcgg-3’25

<210>2

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合一反向引物序列

<400>2

5’-tggatagtatggagttgggaggaga-3’25

<210>3

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合二正向引物序列

<400>3

5’-tagattgatgagcaaaagcaggagc-3’25

<210>4

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合二反向引物序列

<400>4

5’-tatgggatgatgccaagcagtagta-3’25

<210>5

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合三正向引物序列

<400>5

5’-aaatctcttgggactggcagaaaag-3’25

<210>6

<211>25p

<212>dna

<213>引物組合三反向引物序列

<400>6

5’-aaatggtgttggggttgtttcaca-3’24

<210>7

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合四正向引物序列

<400>7

5’-tcactgcttccacaaactgatcaac-3’25

<210>8

<211>25bp

<212>dna

<213>引物組合四反向引物序列

<400>8

5’-tgagggtctaaaggcgtacagaaaa-3’25