本發明涉及番茄灰霉病的生物防治
技術領域：
，特別是涉及一種誘抗番茄灰霉病的混合發酵液及其制備方法。
背景技術：
：植物誘導抗病性也稱系統獲得抗性(SAR)，是指植物的某些部位在受到低毒或弱毒的病原菌或病原菌代謝物處理后，可誘導植物體產生一些保護物質，從而使植物由原來的易感狀態轉變為局部或整體對抗某種或某類病原物侵染的現象。由誘抗劑引發的SAR有以下四大特點和優點：一是系統性，即這種反應可以從誘導部位傳遍全株，既可在誘導部位發生，也可以被傳導到植物未經處理的其他組織或器官起作用，還可通過嫁接傳遞；二是持久性，SAR一經誘導，一般能持續幾周至幾個月，甚至在植物整個生長期起作用，持效期長；三是廣譜性，SAR雖然是被特定誘抗劑誘導的，但作用卻是廣譜的，對真菌、細菌和病毒等多種病原物都起作用，這是因為誘導引起了SAR基因的啟動和表達，導致一系列生理、生化和細胞學上的變化，進而抑制了病害的發生和擴展；四是安全性，即對人畜無毒、對環境安全，因為誘抗劑的作用機制是誘導植物內在抗病潛力，對病原物沒有選擇壓力，不易產生抗藥性，所以對環境也不產生副作用，這是許多化學殺菌劑所沒有的優點，符合綠色、生態農業的發展趨勢。番茄主要在設施內種植，設施的特殊環境條件使番茄灰霉病的發生越來越嚴重，每年有30％左右面積的番茄死苗和爛果，尤其早期第1-2穗果受害最嚴重，流行年份的發病率更高達50％以上，甚至絕產。同時由于生產上仍缺少抗病品種，且灰霉病菌已對多種化學殺菌劑產生了抗藥性，防治效果大大降低，并且施藥主要以果實為靶標，造成果實的農藥殘留超標，嚴重制約了番茄的安全生產。菜農在生產中主要利用化學農藥來防治該病，能挽回總產量的15-30％，但農產品污染事件接連不斷的發生，食品安全問題已成為民生的熱點話題。目前市場也有防治番茄灰霉病的生物農藥銷售和使用，但現有的生物農藥主要是在番茄灰霉病發生后使用，并且生物農藥見效較慢，對使用環境的溫度、光照等條件較為苛刻，另外對番茄產量也有一定影響。技術實現要素：針對上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種誘抗番茄灰霉病的混合發酵液及其制備方法。該混合發酵液以黑根霉和擬康氏木霉的次生代謝物作為有效成分，可提早、并有效的提高番茄對灰霉病的抗性，大幅降低番茄灰霉病的發生；而且該混合發酵液的使用環境更為寬松，對人畜安全無害，環境兼容性好。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：本發明的第一方面，提供一種誘抗番茄灰霉病的混合發酵液，所述混合發酵液是由黑根霉和擬康氏木霉經混合發酵制備而成。本發明所選用的黑根霉為保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9；該菌株已經記載在專利“一種具有抗癌活性的黑根霉多糖及其應用”(CN104017736A)中。本發明所選用的擬康氏木霉為保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉(Trichodermapseudokiningii)TRIPI；該菌株已經記載在專利“一種復合生物土壤改良劑及其應用”(CN102391876A)中。本發明的第二方面，提供上述誘抗番茄灰霉病的混合發酵液的制備方法，步驟如下：(1)將黑根霉和擬康氏木霉進行活化處理；(2)將活化后的黑根霉和擬康氏木霉接種于發酵培養基中，在22-30℃、100-130r/min的條件下培養5-7天，過濾，濾液濃縮，即得誘抗番茄灰霉病的混合發酵液。步驟(1)中，所述活化處理的方法為：將黑根霉和擬康氏木霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。步驟(2)中，活化后的擬康氏木霉和黑根霉接種量的比為(3-5)：1。步驟(2)中，所述發酵培養基為PDB培養基。所述PDB培養基的組成為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000ml；其制備方法如下：將馬鈴薯切成0.5cm左右厚的小塊，放入水中，煮沸20min后，4層紗布過濾，取濾液(加水定容至1000ml)，煮沸后加入葡萄糖，完全溶解后，分裝于500ml的三角瓶中，裝量為200ml，126℃、0.15MPa條件下高壓蒸汽滅菌30min，備用。步驟(2)中，在35-45℃下濃縮濾液5-10倍。(即濃縮后濾液的質量為濃縮前濾液質量的1/5-1/10)。步驟(2)中，制備的誘抗番茄灰霉病的混合發酵液中，孢子數不少于108個/ml。本發明的第三方面，提供上述混合發酵液在制備誘抗番茄灰霉病的生防制劑中的應用。本發明的第四方面，提供一種誘抗番茄灰霉病的生防制劑，由上述的混合發酵液和常規的助劑制備而成；其活性成分為上述的混合發酵液。所述生防制劑的劑型為粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑、水分散顆粒劑和懸浮劑等。本發明還提供上述混合發酵液或生防制劑誘抗番茄灰霉病的應用方法，步驟為：將上述的混合發酵液或生防制劑加水稀釋，在番茄初花后7-10天內葉面噴施，之后每隔10-15天可噴施一次。本發明的有益效果：(1)本發明以保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉作為誘抗菌株，其混合發酵液可以明顯提高番茄對灰霉病的誘抗作用。其中，保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉，前期主要是關于該菌株能夠產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的研究；保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉，前期主要是關于該菌株在防治黃瓜黃萎病和棉花枯萎病中的應用研究。本發明意外的發現，以保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉作為中心組分，經發酵后得到的混合發酵液能明顯提高番茄對灰霉病的誘抗作用，番茄灰霉病的誘抗效果可達87.9％。(2)本發明的混合發酵液是由黑根霉和擬康氏木霉經混合發酵而成，涉及上述兩株誘抗菌株的初級代謝和次級代謝，化學成分復雜；而且，通過混合發酵的過程，增加了上述兩菌株的協同作用方式和化學成分的滲透性，提高了作用效率。(3)本發明所使用的黑根霉和擬康氏木霉均來源于自然環境，能有效誘導番茄對灰霉病菌的系統抗性，其使用方法簡便，對環境無污染，對人畜無毒；發酵液生產方法簡便、周期短，所用原料廉價，易于大規模批量生產，生產成本低。具體實施方式應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬
技術領域：
的普通技術人員通常理解的相同含義。需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。正如
背景技術：
所介紹的，現有技術中防治番茄灰霉病的生物農藥主要是在番茄灰霉病發生后使用，生物農藥的見效較慢，對使用環境的溫度、光照等條件較為苛刻。基于此，本發明提供了一種新型的誘抗番茄灰霉病的混合發酵液。在本申請的一種實施方式中，提供了該誘抗番茄灰霉病的混合發酵液的制備方法，步驟如下：(1)將保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉進行活化處理；活化處理的方法為：將黑根霉和擬康氏木霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。(2)將活化后的黑根霉和擬康氏木霉接種于發酵培養基中，在22-30℃、100-130r/min的條件下培養5-7天，過濾，在35-45℃下濃縮濾液5-10倍，即得誘抗番茄灰霉病的混合發酵液。由于保藏編號為CGMCCNO.1443的黑根霉目前已知的功能為：產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖，可用于制備抗腫瘤藥物或輔助藥物。本發明在試驗過程中發現：該黑根霉對番茄灰霉病還具有一定的誘抗作用；特別是將保藏編號為CGMCCNO.1443的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉組合使用，進行混合發酵，制備得到混合發酵液，可以顯著提高對番茄灰霉病的誘抗作用，具有明顯的協同增效效果。黑根霉和擬康氏木霉的形態性質各不相同，而且在生長過程中也會分泌多種具有不同生理功能的活性物質，本發明將黑根霉和擬康氏木霉進行混合發酵可以起到功能互補和增強的作用；而且這兩株菌在混合發酵過程中可以互為對方提供所需的生長因子，有效促進了微生物的生長速度和產物得率。但在混合發酵過程中，如何實現各微生物之間最佳平衡的控制是難點所在，為了綜合篩選黑根霉和擬康氏木霉的特異功效和相互間的增效作用以及最佳復合配比，本發明對此進行了優化篩選。在本發明的一個優選的實施方案中，活化后的擬康氏木霉和黑根霉接種量的比為(3-5)：1。篩選試驗發現，黑根霉和擬康氏木霉接種量的比例會影響對番茄灰霉病的誘抗作用，將擬康氏木霉和黑根霉按(3-5)：1接種進行混合發酵時，其對番茄灰霉病的誘抗效果較佳。為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本申請的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本申請的技術方案。本發明實施例中所用的試驗材料均為本領域常規的試驗材料，均可通過商業渠道購買得到。實施例1：誘抗番茄灰霉病的混合發酵液的制備(1)菌株的活化將保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。PDA平板培養基：馬鈴薯(去皮、挖凈芽眼)200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml，馬鈴薯切0.5cm左右厚的小塊，放入水中，煮沸20min后，4層紗布過濾，取濾液(加水定容至1000ml)，煮沸后依次加入葡萄糖、瓊脂，完全溶解后，分裝于250ml的三角瓶中，裝量為100ml，126℃、0.15MPa條件下高壓蒸汽滅菌30min，倒平板，備用。(2)混合發酵液的制備：用Φ6mm打孔器在長滿擬康氏木霉和黑根霉菌落的PDA培養基邊緣打菌餅，將擬康氏木霉和黑根霉菌餅按4:1的比例用無菌接種環接種于PDB培養基中，在28℃、120r/min的恒溫振蕩器中培養6天后，4層紗布過濾，在40℃下濃縮濾液8倍，即得誘抗番茄灰霉病混合發酵液，其孢子數>108個/ml，置于4℃冰箱備用。PDB培養基：馬鈴薯(去皮、挖凈芽眼)200g、葡萄糖20g、水1000ml，馬鈴薯切0.5cm左右厚的小塊，放入水中，煮沸20min后，4層紗布過濾，取濾液(加水定容至1000ml)，煮沸后加入葡萄糖，完全溶解后，分裝于500ml的三角瓶中，裝量為200ml，126℃、0.15MPa條件下高壓蒸汽滅菌30min，備用。實施例2：誘抗番茄灰霉病的混合發酵液的制備(1)菌株的活化將保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。PDA平板培養基同實施例1。(2)混合發酵液的制備：用Φ6mm打孔器在長滿擬康氏木霉和黑根霉菌落的PDA培養基邊緣打菌餅，將擬康氏木霉和黑根霉菌餅按3:1的比例用無菌接種環接種于PDB培養基中，在22℃、130r/min的恒溫振蕩器中培養7天后，4層紗布過濾，在35℃下濃縮濾液5倍，即得誘抗番茄灰霉病混合發酵液，其孢子數不少于108個/ml，置于4℃冰箱備用。PDB培養基同實施例1。實施例3：誘抗番茄灰霉病的混合發酵液的制備(1)菌株的活化將保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉和保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。PDA平板培養基同實施例1。(2)混合發酵液的制備：用Φ6mm打孔器在長滿擬康氏木霉和黑根霉菌落的PDA培養基邊緣打菌餅，將擬康氏木霉和黑根霉菌餅按5:1的比例用無菌接種環接種于PDB培養基中，在30℃、100r/min的恒溫振蕩器中培養5天后，4層紗布過濾，在45℃下濃縮濾液10倍，即得誘抗番茄灰霉病混合發酵液，其孢子數不少于108個/ml，置于4℃冰箱備用。PDB培養基同實施例1。對比例1：(1)菌株的活化將保藏編號為CGMCCNO.1443的擬康氏木霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。PDA平板培養基同實施例1。(2)單獨發酵液的制備：將活化后的擬康氏木霉用無菌接種環接種于PDB培養基中，在28℃、120r/min的恒溫振蕩器中培養6天后，4層紗布過濾，在40℃下濃縮濾液8倍，得擬康氏木霉單獨發酵液，其孢子數不少于108個/ml。PDB培養基同實施例1。對比例2：(1)菌株的活化將保藏編號為CGMCCNO.8436的黑根霉接種在PDA平板培養基上，24℃恒溫培養48h。PDA平板培養基同實施例1。(2)單獨發酵液的制備：將活化后的黑根霉用無菌接種環接種于PDB培養基中，在28℃、120r/min的恒溫振蕩器中培養6天后，4層紗布過濾，在40℃下濃縮濾液8倍，得黑根霉單獨發酵液，其孢子數不少于108個/ml。PDB培養基同實施例1。對比例3：將對比例1和對比例2制備的擬康氏木霉單獨發酵液和黑根霉單獨發酵液按質量比為4：1混合，其余按實施例1的方法制備得到混合發酵液。對比例4：將實施例1中的“黑根霉”替換為“枯草芽孢桿菌”，按實施例1的方法制備得到混合發酵液。該枯草芽孢桿菌的保藏編號為CGMCCNO.1442，該菌株已經記載在專利“一種復合生物土壤改良劑及其應用”(CN102391876A)中。對比例5：將實施例1中的“擬康氏木霉”和“黑根霉”接種量的比例調整為1：1，其余按實施例1的方法制備得到混合發酵液。對比例6：將實施例1中的“擬康氏木霉”和“黑根霉”接種量的比例調整為1：4，其余按實施例1的方法制備得到混合發酵液。應用例1：1.試驗材料：番茄試驗材料為安達3號，來源于壽光市金圣種苗有限公司，在山東農業工程學院院內日光溫室內種植，采用大小行栽培方式(大行80cm、小行60cm)，株距40cm。生防制劑材料為實施例1、對比例1-3制備的發酵液，市售的產品腐霉利(50％可濕性粉劑1000x，日本住友化學株式會社)、嘧菌胺(400g/l懸浮劑800x，拜耳作物科學公司)。2.試驗方法：將番茄試驗材料分為7個處理組，每個處理組的面積為60m2，每個處理設置3個重復。在番茄初花后7天，處理組1用實施例1制備的混合發酵液稀釋100倍后葉面噴施；處理組2-4分別用對比例1-3制備的混合發酵液稀釋100倍后葉面噴施；處理組5用腐霉利進行葉面噴施；處理組6用嘧菌胺進行葉面噴施；7天后各處理組再噴一次。處理組7不進行任何處理，作為空白對照。10天后調查各處理組番茄植株灰霉病的病情指數并計算誘抗(防治)效果和植株座果率。3.試驗結果：試驗結果見表1。表1：各處理番茄灰霉病病情指數和誘抗(防治)效果處理病情指數誘抗(防治)效果(％)番茄植株座果率(％)處理組14.287.0495.0處理組212.960.1981.0處理組315.651.8572.4處理組47.975.6284.7處理組55.383.6491.2處理組64.685.8094.0處理組732.4-80.2由表1可以看出：在溫室條件下，本發明實施例1制備的混合發酵液能夠較好的誘導番茄植株對灰霉病的系統抗性；與單獨使用擬康氏木霉發酵液(處理組2)和單獨使用黑根霉發酵液(處理組3)相比，番茄灰霉病的病情指數明顯降低，誘抗效果得到較大提升，說明擬康氏木霉和黑根霉聯合使用具有協同增效作用，并且可提高番茄植株的座果率；與處理組4相比，處理組1的防治效果仍有較顯著的改善，說明將擬康氏木霉和黑根霉進行混合發酵可以進一步的增強這兩株菌之間的協同作用；與市售的產品(處理組5和處理組6)相比，其對番茄灰霉病的誘抗效果與之相當，甚至更優；但上述市售的化學農藥產品如果施用不當或過度施用后，會造成番茄產品的農藥殘留超標。而本發明的混合發酵液生產方法簡便、周期短，所用原料廉價，可提早、有效提高番茄植株的系統抗性，并且環境兼容性好。應用例2：1.試驗材料：番茄試驗材料為巴頓，來源于山東金種子公司，在山東農業工程學院院內日光溫室內種植，采用大小行栽培方式(大行80cm、小行60cm)，株距40cm。生防制劑材料為實施例2、對比例4-6制備的發酵液，市售的產品腐霉利(50％可濕性粉劑1000x，日本住友化學株式會社)、嘧菌胺(400g/l懸浮劑800x，拜耳作物科學公司)。2.試驗方法：將番茄試驗材料分為7個處理組，每個處理組的面積為60m2，每個處理設置3個重復。在番茄初花后7天，處理組1用實施例2制備的混合發酵液稀釋100倍后葉面噴施；處理組2-4分別用對比例4-6制備的混合發酵液稀釋100倍后葉面噴施；處理組5用腐霉利進行葉面噴施；處理組6用嘧菌胺進行葉面噴施；7天后各處理組再噴一次。處理組7不進行任何處理，作為空白對照。10天后調查各處理組番茄植株灰霉病的病情指數并計算誘抗(防治)效果和植株座果率。3.試驗結果：試驗結果見表2。表2：各處理番茄灰霉病病情指數和誘抗(防治)效果處理病情指數誘抗(防治)效果(％)番茄植株座果率(％)處理組14.387.9972.8處理組214.260.3470.9處理組37.479.3371.2處理組410.869.8370.5處理組55.584.6468.3處理組65.385.2069.8處理組735.8-64.2由表2可以看出：在溫室條件下，本發明實施例2制備的混合發酵液能夠較好的誘導番茄植株對灰霉病的系統抗性；與處理組2相比，處理組1的番茄灰霉病的病情指數顯著降低，誘抗效果顯著提高，說明制備混合發酵所選用的菌株種類會顯著影響番茄灰霉病的防治效果；并且混合發酵液也有益于番茄植株座果率的提高。與處理組3和處理組4相比，處理組1的防治效果仍有較顯著的改善，說明擬康氏木霉和黑根霉進行混合發酵時接種的比例也會影響制備的混合發酵液對番茄灰霉病的防治效果。與市售的產品(處理組5和處理組6)相比，其對番茄灰霉病的誘抗效果相當，甚至更優，而本發明的混合發酵液生產方法簡便、周期短，所用原料廉價，可提早、有效提高番茄植株的系統抗性，并且環境兼容性好。應用例3：1.試驗材料：番茄試驗材料為金種子，來源于山東金種子公司，番茄種植地點為山東省齊河縣祝阿鎮大楊村，種植方式為露地栽培，株行距為40cm×60cm。生防制劑材料為實施例3、對比例1-2制備的發酵液，市售的產品腐霉利(50％可濕性粉劑1000x，日本住友化學株式會社)、嘧菌胺(400g/l懸浮劑800x，拜耳作物科學公司)。2.試驗方法：將番茄試驗材料分為6個處理組，每個處理組的面積為667m2。在番茄初花后8天，處理組1用實施例3制備的混合發酵液稀釋200倍后葉面噴施；處理組2-3分別用對比例1-2制備的單獨發酵液稀釋200倍后葉面噴施；處理組4用腐霉利進行葉面噴施；處理組5用嘧菌胺進行葉面噴施；處理組6不進行任何處理，作為空白對照；10天后各處理組再噴一次。15天后調查各處理組番茄植株灰霉病的病情指數并計算誘抗(防治)效果和植株座果率。3.試驗結果：試驗結果見表3。表3：各處理番茄灰霉病病情指數和誘抗(防治)效果處理病情指數誘抗(防治)效果(％)番茄植株座果率(％)處理組14.679.1976.5處理組29.357.9269.7處理組310.652.0466.2處理組45.873.7672.3處理組54.280.9978.2處理組622.1-60.5由表3可以看出：在露地條件下，本發明實施例3制備的混合發酵液能夠較好的誘導番茄植株對灰霉病的系統抗性；與處理組2、處理組3相比，處理組1的番茄灰霉病的病情指數明顯降低，誘抗效果得到較大提升，說明擬康氏木霉和黑根霉聯合使用具有協同增效作用，并且可提高番茄植株的座果率。與市售的產品(處理組4和處理組5)相比，其對番茄灰霉病的誘抗效果相當；但上述市售的化學農藥產品如果施用不當或過度施用后，會造成番茄產品的農藥殘留超標，本發明的混合發酵液生產方法簡便、周期短，所用原料廉價，可提早、有效提高番茄植株的系統抗性，并且環境兼容性好。以上所述僅為本申請的優選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護范圍之內。當前第1頁1 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