本發明屬于化學合成領域，涉及一組用于標記羧基的同位素標記試劑及其合成方法。
背景技術：
：：隨著質譜(massspectrometry)技術的不斷發展和蛋白質組學研究的不斷深入，用于定量分析的穩定同位素標記(stableisotopelabeling)技術獲得了飛速發展。該方法中所涉及的同位素及其標記試劑是一種具有高技術含量和高附加值的商品。通過對目標分析物中的可反應基團進行修飾并引入同位素標記物，結合lc-ms可以實現高效準確的相對或絕對定量。自上世紀70年代以來，該方法被廣泛應用于農業、食品安全、生命科學、環境、臨床醫學、藥學等領域。對于含有羧基的目標分析物，可選擇對羧基進行修飾，通過縮合反應將含有同位素的標記試劑聯接到目標物上。在眾多修飾試劑中，帶伯氨基的試劑是應用最為廣泛的修飾試劑之一，可通過與目標物中的羧基形成酰胺鍵實現修飾。在制備同位素修飾試劑的過程中，本發明選用了含同位素的碘甲烷作為同位素來源試劑，通過其與叔胺基的親核取代反應，將同位素引入到最終的目標產物上，即用于羧基標記的同位素標記試劑。在對樣品進行分析時，先用該標記試劑與樣品中的目標分析物進行反應，將帶有同位素標記的季銨引入到原分析物中，再用lc-ms對標記后的產物進行分析。技術實現要素：本發明主要內容為合成一組新型的同位素標記試劑，以n,n-二甲基乙二胺及其同系物為原料，通過親核取代反應，將同位素引入到最終的目標產物。為得到所期望的產物，在進行親核取代反應時，需要將其伯胺進行屏蔽，阻止伯胺被甲基化；親核取代反應完成后，再將原來伯胺基上的保護基團去除，復原得到用于與羧基反應的伯胺基。本發明的技術方案為：一組用于羧基標記的同位素標記試劑，所述的同位素標記試劑的結構特點是一端為伯胺，另一端為三甲基銨鹽，伯胺與三甲基銨鹽之間通過多個碳鏈相連，中部碳鏈上碳原子個數為2-7個，結構式如下：上述同位素標記試劑的合成方法，合成過程先用二碳酸二叔丁酯((boc)2o)對伯氨基進行保護，然后在堿性條件下與碘甲烷或同位素取代的碘甲烷(氘及碳13)等反應，最后在酸性條件脫去保護基團得到(2-氨基乙基)三甲基銨的系列類似化合物，所述的系列類似化合物為同位素標記試劑。具體包括以下步驟：第一步：以n,n‐二甲基乙二胺及其同系物(n＝1‐6)為反應原料，采用二碳酸二叔丁酯((boc)2o)對伯氨基進行保護，反應式如下：具體步驟為：1.1)在反應瓶中加入摩爾比為1:1‐1:3的水和有機溶劑后，再依次加入反應原料和堿，室溫下攪拌均勻后得到混合溶液。所述的反應原料在水中的濃度為0.5-5mmol/ml；所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或三乙胺，堿在水中的濃度為0.75-25mmol/ml；所述的有機溶劑為四氫呋喃、1，4-二氧六環、二氯甲烷中的一種。1.2)在0-5℃條件下，將二碳酸二叔丁酯(boc)2o逐滴加入步驟1.1)得到的混合溶液中，冰水浴反應10-30min，再常溫反應2-4h得到反應溶液。所述的反應原料與(boc)2o的摩爾比為1:1.-3。第二步：反應體系中引入碘甲烷或同位素取代的碘甲烷，得到相應的季銨產物；該步驟中引入同位素的方式是借助含同位素的碘甲烷與叔氨基之間的親核取代反應實現的。具體步驟：調節步驟1.2)得到的反應溶液ph到中性左右，旋轉蒸干溶劑后，在反應瓶中依次加入溶劑、堿和碘甲烷或同位素取代的碘甲烷試劑，在60-80℃條件下，加熱回流反應2-4h后得到反應溶液。所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸鉀中的一種；所述的溶劑為乙腈、丙酮、dmf中的一種；所述的反應原料、碘甲烷或同位素取代的碘甲烷、堿的摩爾比為1:1.1-2:1.5-10；所述同位素取代的碘甲烷為ch2di、chd2i、cd3i、13ch3i、13ch2di、13chd2i、13cd3i。以不含同位素的碘甲烷為例，反應式如下：第三步：在酸性條件脫去保護基團得到相應的三甲基銨鹽用鹽酸調節第二步得到的反應溶液的ph至6-8，旋轉蒸干溶劑，在反應瓶中加入氯化氫的乙酸乙酯溶液，氯化氫的濃度為1-4mol/l，磁力攪拌，在20-40℃條件下反應20-60min后，析出相應的三甲基銨的鹽酸鹽，旋蒸干燥后就得到目標產品，結構式為：其中r為ch3、ch2d、chd2、cd3、13ch3、13ch2d、13chd2、13cd3；n＝1-6，即目標產物中間碳鏈的碳原子個數可以為2-7個。本發明選用了含同位素的碘甲烷作為同位素源頭試劑，以n,n‐二甲基乙二胺同系物(中間碳鏈上碳原子數為2‐7個)為原料，通過含同位素的碘甲烷與原料中叔胺基的親核取代反應，將同位素引入到最終的目標產物上。通過這種帶有同位素標記的季銨鹽與含有羧基的物質進行酰胺化反應，可以對羧基進行標記，得到其相應的同位素內標物。本發明的有益效果為，通過以價格較為低廉的d或13c取代的碘甲烷，用高效的親核取代反應合成了一組新型的可用于高效標記羧基的同位素標記試劑。當用ms或lc-ms對含有羧基的目標物進行定量分析時，無需借助為各自的同位素內標。可將樣品及已知濃度的待測目標物的標準品分別用所合成的標記試劑進行衍生，將其轉化為帶有同位素的目標物。經過標記之后，目標物的羧基被轉化為季銨，在ms或lc-ms的分析中，其檢測模式由常用的負離子模式轉變為正離子模式，離子化效率變高，可提高分析的靈敏度及檢測能力。當對多個樣品進行相對定量或絕對定量時，同時對5-8個樣品平行進行標記處理，在完成標記反應之后對這些樣品進行混合，用ms或lc-ms一次完成分析，儀器分析時間縮減至原始方面的1/5-1/8。與每個樣品單次進樣分析相比，利用該系列同位素試劑進行標記后可顯著提高分析的效率及準確性。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例1：(1)將1ml水和1ml四氫呋喃加入25ml圓底燒瓶中，再加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和7.5mmolnaoh水溶液，混合均勻并置于0℃冰水浴中。在混合溶液中緩慢滴加2.5mmol(boc)2o溶液，磁力攪拌下反應20min后，再室溫反應2h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，2mmolch3i和6mmolnaoh水溶液，在65℃下磁力攪拌反應3h。(3)用鹽酸調節第二步得到的反應溶液的ph為7，旋蒸干燥溶劑后，在反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(濃度為1mol/l)，磁力攪拌，在25℃的反應溫度下反應25min。(4)反應完成后，析出(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽，旋蒸干燥后得到目標產品。實施例2：(1)取1ml水和2ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和6mmol三乙胺水溶液，混合均勻，并置于2℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應10min，后室溫下反應2h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，1.7mmolcd3i和6mmolnaoh水溶液，在70℃下磁力攪拌反應4h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝6，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(2mol/l)，反應溫度25℃，磁力攪拌進行反應30min。(4)反應完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例3：(1)取1.5ml水和1.5ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和6mmolnaoh水溶液，混合均勻，并置于3℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3.5mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應15min，后室溫下反應3h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，2mmolch2di和6mmolnaoh水溶液，在65℃下磁力攪拌反應3h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝6.5，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應溫度30℃，磁力攪拌進行反應35min。(4)反應完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例4：(1)取1ml水和1ml1，4-二氧六環于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和7.5mmolnaoh水溶液，混合均勻，并置于4℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應25min，后室溫下反應3h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml丙酮，2mmolchd2i和6mmolnaoh水溶液，在75℃下磁力攪拌反應4h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝7.5，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(4mol/l)，反應溫度40℃，磁力攪拌進行反應30min。(4)反應完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例5：(1)取1ml水和3ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmol4-二甲基氨基丁胺和7.5mmol三乙胺水溶液，混合均勻，并置于3℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應20min，后室溫下反應3h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3mldmf，2mmolch3i和7mmol碳酸鈉水溶液，在80℃下磁力攪拌反應3h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝6.5，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應溫度35℃，磁力攪拌進行反應40min。(4)反應完成后，有相應的三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例6：(1)取1ml水和2ml1，4-二氧六環于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和10mmol三乙胺水溶液，混合均勻，并置于1℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加4mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應20min，后室溫下反應2h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，1.8mmol13ch3i和6mmolnaoh水溶液，在75℃下磁力攪拌反應4h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝7，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應溫度30℃，磁力攪拌進行反應30min。(4)反應完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例7：(1)取1ml水和3ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和5mmolnaoh水溶液，混合均勻，并置于0℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加2.8mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應20min，后室溫下反應2h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml丙酮，2mmol13cd3i和6mmolnaoh水溶液，在70℃下磁力攪拌反應3h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝7，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應溫度25℃，磁力攪拌進行反應50min。(4)反應完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例8：(1)將1ml水和2ml四氫呋喃加入25ml圓底燒瓶中，再加入1.5mmol6-(二甲胺基)己胺和8mmolnaoh水溶液，混合均勻并置于0℃冰水浴中。在混合溶液中緩慢滴加2.5mmol(boc)2o溶液，磁力攪拌下反應15min后，再室溫反應2h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3mldmf，2mmolcd3i和7mmolnaoh水溶液，在70℃下磁力攪拌反應4h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝6，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(4mol/l)，反應溫度30℃，磁力攪拌進行反應40min。(4)反應完成后，有相應的三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。實施例9：(1)將1ml水和2ml1，4-二氧六環加入25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmol7-(二甲氨基)庚胺和7mmolnaoh水溶液，混合均勻并置于0℃冰水浴中。在混合溶液中緩慢滴加2.5mmol(boc)2o溶液，磁力攪拌下反應20min后，再室溫反應4h。(2)反應結束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，2mmolch3i和7mmolnaoh水溶液，在75℃下磁力攪拌反應4h。(3)將第二步反應中的溶液用鹽酸調節ph＝7，旋轉蒸干，往反應瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(4mol/l)，反應溫度30℃，磁力攪拌進行反應50min。(4)反應完成后，有相應的三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標產品。當前第1頁12當前第1頁12