本發明涉及生物醫藥領域，尤其一種環肽化合物及其制備和應用。
背景技術：
糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大威脅人類健康的疾病。ⅱ型糖尿病是因為靶細胞對胰島素的敏感性降低所致，導致餐后血糖水平高。α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前臨床治療ⅱ型糖尿病的一線口服降糖藥物（如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇），它通過可逆性地抑制腸系膜刷狀緣的α-糖苷酶，延緩α-糖苷酶將多糖分解為葡萄糖，從而減慢葡萄糖的吸收速度，從而降低餐后血糖。
海洋天然產物作為藥物開發的重要來源，從中尋找新型α-葡萄糖苷酶抑制劑對發現高效低毒的治療ii型糖尿病藥物具有重要意義。近幾年來，從海洋天然產物中尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究越來越得到學者們的到重視，目前已經發現了45個海洋來源的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑。為了尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑，本發明人研究得知，海洋球孢枝孢菌cladosporiumsphaerospermumys3-1-5的發酵產物的粗提物具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，遂對其活性成分進行了研究。研究發現所示環肽化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，目前尚未見該化合物的化學結構及作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的報道，因此市場上也尚未見有與此相關的藥物。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種環肽類的α-葡萄糖苷酶抑制劑及其制備方法和應用。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：
一種環肽化合物，含有1個亮氨酸殘基、2個n甲基亮氨酸殘基和一個苯丙氨酸殘基構成的環四肽化合物，其結構式如ⅰ所示：
上述環肽化合物的制備方法，具體包括如下步驟：
（1）發酵生產和浸膏的獲取
將保藏編號為cctccno：m2014098的球孢枝孢菌ys3-1-5（cladosporiumsphaerospermumys3-1-5）菌落接種到裝有液體培養基的錐形瓶中，于28℃、180r/min搖床培養10天，獲得發酵液，發酵液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮蒸干，獲得粗浸膏；
（2）分離精制
將上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑溶解后，加粗浸膏2倍體積的200-300目硅膠拌樣，通過減壓硅膠柱層析，以石油醚/乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，將獲得的洗脫物再經sephadexlh-20凝膠柱層析以二氯甲烷和甲醇混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，所得洗脫液再經反相制備hplc分離純化，以甲醇/水(v/v90∶10)為流動相進行分離純化得到環肽化合物(10mg)，其結構如式i所示：
步驟（1）所述的液體培養基配制方法如下：將甘露醇10.0g，酵母膏3.0g，麥芽糖20.0g，味精10.0g，葡萄糖20.0g，kh2po40.5g和mgso40.3g，溶于1l海水中，于121℃高壓滅菌20min即可。
步驟（2）所述的二氯甲烷和甲醇混合溶劑中二氯甲烷與甲醇的體積比為1：1。
步驟（2）所述的減壓硅膠柱的大小為高20cm和直徑4cm。
步驟（2）所述的石油醚/乙酸乙酯中石油醚與乙酸乙酯的體積比為8:1至5：1。
步驟（2）所述的制備反相高效液相色譜的洗脫劑為甲醇與水按體積比90:10的比例混合。
上述一種環肽化合物的應用，所述的環肽化合物在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑方面的用途。
進一步所述的環肽化合物在制備治療糖尿病、肥胖癥藥方面的用途。
與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明一種環肽化合物及其制備方法和應用，通過海洋球孢枝孢菌（cladosporiumsphaerospermumys3-1-5）發酵培養，然后將發酵產物用乙酸乙酯萃取獲得粗浸膏，將該粗浸膏經減壓硅膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析和反相制備高效液相色譜分離純化得到一種環肽化合物，該方法具有成本低，繁殖周期短，提純工藝簡單等優點。所述環肽化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可以作為治療糖尿病、肥胖癥的藥物先導化合物。
上述球孢枝孢菌ys3-1-5cladosporiumsphaerospermumys3-1-5，于2014年3月21日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：cctccno:m2014098，保藏地址為中國.武漢.武漢大學。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
實施例1
一種環肽化合物，其結構特征是：含有1個亮氨酸殘基、2個n甲基亮氨酸殘基和一個苯丙氨酸殘基構成的環四肽化合物，結構式如ⅰ所示：
實施例2
如i式所示的環肽化合物的制備方法，具體包括如下步驟：
（1）發酵生產和浸膏的獲取
將保藏編號為cctccno：m2014098的球孢枝孢菌（cladosporiumsphaerospermumys3-1-5）菌落接種到裝有300ml液體培養基（甘露醇10.0g，酵母膏3.0g，麥芽糖20.0g，味精10.0g，葡萄糖20.0g，kh2po40.5g，mgso40.3g和海水1l）的1l錐形瓶中（共100瓶），于28℃、180r/min搖床培養10天，獲得發酵液，發酵液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮蒸干，獲得粗浸膏（共100瓶獲得20g粗浸膏）；
（2）分離精制
將上述粗浸膏（20g）用二氯甲烷和甲醇混合溶劑（其中二氯甲烷與甲醇的體積比為1：1）溶解后，加40克200-300目硅膠拌樣，通過減壓硅膠柱（柱大小為高20cm和直徑4cm）層析，以體積比8:1至5:1的石油醚/乙酸乙酯為溶劑進行梯度洗脫，獲得洗脫物再經sephadexlh-20凝膠柱層析以甲醇/二氯甲烷為洗脫劑(甲醇與二氯甲烷的體積比為1∶1)進行洗脫，所得洗脫液再經反相制備hplc分離純化，以甲醇/水(v/v90∶10)為流動相進行分離純化得到環肽化合物(10mg)，其結構如式i所示：
該化合物ⅰ，白色粉末，分子式c29h46n4o4，陽離子hresimsm/z：515.3590[m+h]+，1h和13c-nmr數據見表1。
表1化合物ⅰ的1h和13cnmr數據（500和125mhz，indmso-d6）
實施例3
α-葡萄糖苷酶抑制活性的測試（96孔板法）
（1）實驗樣品
被測樣品溶液的配制：測試樣品為上述實施例1中分離純化的化合物ⅰ純品，精密稱取適量樣品，配制成所需濃度的溶液，供測活性。
（2）實驗方法
以4-硝基苯-α-d-吡喃葡萄糖苷為底物，在96孔酶標板上反應，最終反應體積為200μl，測定α-葡葡萄糖苷酶抑制活性。將不同濃度的樣品溶液（40μl）加入到40μl0.04u/mlα-葡萄糖苷酶溶液中，于37℃下反應5min，加入20μl0.5mmol/l4-硝基苯-α-d-吡喃葡萄糖苷溶液，于37℃反應30min后，用100μl0.1mol/lna2co3溶液終止反應，在405nm波長處測定溶液的吸收值。阿卡波糖作為陽性對照。樣品對酶活性的抑制率(%)按下式計算:
抑制率(%)=［ablank－(a0－a)］/ablank×100%式中，ablank為不加待測樣品溶液的吸收值；a0為加入待測樣品反應后溶液的吸收值；a為只加待測樣品溶液的吸收值。
（3）實驗結果
當化合物ⅰ在0.5mg/ml的濃度時對α-葡葡萄糖苷酶的抑制活性可達78.2%，當為1mg/ml時可達90%，而阿卡波糖在1mg/ml時，僅為85%。
由此可知化合物ⅰ對α-葡葡萄糖苷酶較好的抑制作用，可作為α-葡葡萄糖苷酶抑制劑，用于治療糖尿病、肥胖癥的藥物先導化合物。
上述說明并非對本發明的限制，本發明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質范圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保護范圍。