本發明涉及在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
細胞微囊泡是人、動物、植物或微生物的細胞自動分泌釋放的或破碎后獲得的，具有脂質膜結構的，直徑從幾十納米到幾微米不等的囊泡。包括細胞外囊泡(extracellularvesicle)、微囊泡(microvesicle)、外泌體(exosome)、調亡小體(apoptoticbody)、脫落囊泡(sheddingvesicle)、微粒(microparticle)。細胞微囊泡攜帶有生物活性的蛋白質、脂質、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、非編碼rna(ncrna)以及dna片段。并且能夠將這些活性分子傳遞給受體細胞，調節靶細胞、組織和器官的生物功能。某些類型的細胞，如間充質干細胞，產生的細胞微囊泡含有多種能夠保護受損組織，促進生長和修復，以及調節免疫功能的活性生物分子。注射入體內之后可以減少損傷、抑制炎癥、促進組織再生和功能恢復。同時，利用電穿孔、化學穿孔、超聲等方法還能夠將人工合成的小干擾rna(sirna)、mirna、化療藥物裝載入細胞微囊泡，使其成為一種藥物載體。因此細胞微囊泡是一種新型的生物治療方法和遞送載體。現已在動物模型上驗證細胞微囊泡能夠促進血管生成、降低炎癥反應、促進神經再生、減少心肌和大腦缺血損傷、保護急性腎損傷和肺損傷、治療糖尿病和神經退行性疾病。然而，靜脈注射的細胞微囊泡很快被肝、脾等網狀內皮系統(res)所吞噬和清除，較少到達靶器官。因此，通過表面修飾配體的方法增強其靶向性、體內穩定性和組織穿透性，以及降低血漿清除率具有重要意義。
目前的方法包括工程化供體細胞和膜插入兩大類方法，都具有較多步驟，操作復雜、費時。其中，工程化供體細胞的方法需要專門的生物學技術對細胞進行處理，無法修飾任意類型的配體，也不能對體液來源的細胞微囊泡進行修飾。膜插入的方法可能對細胞微囊泡原本的膜結構和理化性質產生較大影響，插入效率較難控制，游離的配體較難去除。因此，相關方面的研究和應用進展受到很大限制。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種在細胞微囊泡表面修飾配體的快速、高效的方法。本發明在細胞微囊泡表面修飾各種配體，有利于對其治療作用進行進一步研究，有利于加速臨床應用。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
一種在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，包括如下步驟：
(a)在細胞微囊泡表面連接二苯基環辛炔(dibenzocyclooctyl，dbco)；
(b)去除游離的二苯基環辛炔；
(c)在細胞微囊泡表面的二苯基環辛炔上連接疊氮基修飾的配體；
(d)對修飾好的細胞微囊泡進行提純。
其中，所述細胞微囊泡為人、動物、植物或微生物的細胞所分泌或破碎后獲得的，具有脂質膜結構的，直徑從幾十納米到幾微米不等的囊泡。
其中，所述細胞微囊泡為細胞外囊泡(extracellularvesicle)、微囊泡(microvesicle)、外泌體(exosome)、調亡小體(apoptoticbody)、脫落囊泡(sheddingvesicle)或微粒(microparticle)。
步驟(a)中，利用雙功能化分子將二苯基環辛炔共價偶聯到細胞微囊泡表面天然存在的氨基末端上；其中，所述的雙功能化分子為同時帶有二苯基環辛炔和n-羥基琥珀酰亞胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)的分子；優選為dbco-sulfo-nhs(dibenzocyclooctyne-sulfo-n-hydroxysuccinimidylester，分子式c25h21n2nao8s，分子量532.50)、或dbco-nhs(dibenzocyclooctyne-n-hydroxysuccinimidylester，分子式c23h18n2o5，分子量402.40)、或dbco-peg4-nhs(dibenzocyclooctyne-peg4-n-hydroxysuccinimidylester，分子式c34h39n3o10，分子量649.69)。
步驟(a)中，pbs(ph7.4)緩沖液重懸細胞微囊泡，與雙功能化分子混合，按照每1012細胞微囊泡數量加入1nmol～20nmol(優選3nmol)雙功能化分子的比例混合，在室溫下反應2～12小時(優選4小時)。
步驟(b)中，通過超濾去除沒有偶聯在細胞微囊泡上的雙功能化分子。優選，將步驟(1)得到的產物用100～300kd(最優選100kd)超濾管在8000～12000g(最優選10000g)離心5～10分鐘(最優選10分鐘)，棄濾液，重復3～6次(最優選3次)。
步驟(c)中，所述配體為肽、蛋白質(包括抗體)、核酸或高分子化合物。
步驟(c)中，利用疊氮化的配體與細胞微囊泡表面的二苯基環辛炔進行無銅點擊化學(copper-freeclickchemistry)反應，從而將配體共價偶聯在細胞微囊泡表面。
步驟(c)中，步驟(b)的產物與疊氮化的配體在pbs(ph7.4)緩沖液中混勻，如果有其他要修飾的配體可在上述摩爾比范圍內同時加入，在4℃下反應4～24小時(優選12小時)，其中，每1012囊泡微粒數加入0.1nmol～5nmol(優選0.3nmol)疊氮化的配體。
其中，所述的疊氮化的配體優選是將azide-nhs(分子式c6h6n4o4，分子量198.14)與配體按照摩爾比10∶1混合，在室溫下反應2～12小時(優選4小時)，獲得疊氮化的配體。azide-nhs可以用azide-sulfo-nhs(分子式c8h9n4nao7s，分子量328.23)或azide-peg4-nhs(分子式c15h24n4o8，分子量388.37)替代。
步驟(d)中，使用超速離心的方法對修飾好的細胞微囊泡進行提純。優選將步驟(c)得到的產物用pbs(ph7.4)緩沖液稀釋至25ml，100000～200000g(最優選150000g)離心70～120分鐘(最優選90分鐘)，棄去全部上清液。用0.5mlpbs(ph7.4)重懸沉淀，得到最終修飾好的細胞微囊泡，凍存于-80℃。
與現有技術相比，本發明有益效果體現在：
1.節省時間，全部過程可在24h內完成；
2.過程簡便，易操作，不需要專門的生物學技術；
3.反應效率高，節約配體用量，從而降低成本；
4.全部過程在ph7.4pbs溶液的溫和環境下完成，不需要添加催化劑，有利于最大限度保持細胞微囊泡的生理活性；
5.對配體的類型較少限制，各種類型的肽、蛋白質、糖、脂質、核酸、高分子化合物都可以共價偶聯到細胞微囊泡的表面。
利用本發明在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，可以在細胞微囊泡表面修飾各種靶向性分子。使細胞微囊泡獲得靶向特定的器官、組織或細胞的能力，從而增強其治療效果。
利用本發明在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，可以在細胞微囊泡表面修飾各種功能性分子。能提高細胞微囊泡的體內穩定性，增加組織穿透性，增強跨血腦屏障的能力，減少被吞噬細胞攝取，以及延長血漿清除時間，從而增強其治療效果。
利用本發明所得修飾配體的細胞微囊泡可用于靜脈注射或局部給藥，治療腦缺血、腦外傷、心肌缺血、糖尿病、神經退行性疾病、惡性腫瘤、關節炎、肝肺腎損傷或纖維化，也可用于美容或延緩衰老。
附圖說明
圖1是本發明在細胞微囊泡表面修飾配體方法的工藝流程圖；
圖2是修飾了配體的細胞微囊泡的原子力顯微鏡形態鑒定圖；
圖3是修飾了配體的細胞微囊泡的直徑分布測量結果圖。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
以下實施例所用試劑和材料均可以通過市場購買渠道獲得。
實施例1，外泌體表面修飾rgd多肽。
如圖1所示。
步驟(a)，將1×1012外泌體重懸于1mlph7.4pbs中，加入1.5ml離心管中。再加入3μmdbco-sulfo-nhs。外泌體與dbco-sulfo-nhs的微粒數/摩爾數比為1012：3nmol，將離心管固定在旋轉混勻儀上，室溫下反應4小時。
步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入兩個超濾管(孔徑100kd，容量0.5ml)上層，10000g離心10分鐘。棄掉下層濾液，在上層補充ph7.4pbs至體積達到0.5ml。按照同樣步驟再重復超濾兩次，得到1ml修飾了dbco的外泌體。
步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于1.5ml離心管中。加入0.3μm疊氮基修飾的rgd多肽(所述的疊氮基修飾的多肽分子是將azide-nhs與rgd多肽分子反應獲得)。步驟(b)的產物中囊泡微粒數與疊氮化rgd的摩爾數比為1012：0.3nmol，同時加入0.3μmcy5.5-azide用于熒光標記外泌體。將離心管固定在旋轉混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應12小時。
步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。150000g離心90分鐘，棄去全部上清液。用0.5mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經高效液相色譜分析，參與反應的配體有85％～90％成功偶聯在外泌體上。
鑒定方法：使用原子力顯微鏡觀察所得外泌體的形態(如圖2)；使用納米粒子追蹤分析(nanoparticletrackinganalysis，nta)設備測量所得外泌體的直徑分布(如圖3)。
實施例2，微囊泡表面修飾egfr抗體。
步驟(a)，將1×1013微囊泡重懸于10mlph7.4pbs中，加入15ml離心管中。再加入8μmdbco-nhs。微囊泡與dbco-nhs的微粒數/摩爾數比為1012：8nmol，將離心管固定在旋轉混勻儀上，室溫下反應6小時。
步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入兩個超濾管(孔徑300kd，容量5ml)上層，12000g離心10分鐘。棄掉下層濾液，在上層補充ph7.4pbs至體積達到5ml。按照同樣步驟再重復超濾兩次，得到10ml修飾了dbco的微囊泡。
步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于15ml離心管中。加入2μm疊氮基修飾的egfr抗體(所述的疊氮基修飾的抗體分子是將azide-sulfo-nhs與egfr抗體分子反應獲得)。步驟(b)的產物中囊泡微粒數與疊氮化egfr抗體的摩爾數比為1012：2nmol，同時加入2μmfitc-azide用于熒光標記外泌體。將離心管固定在旋轉混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應24小時。
步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。200000g離心120分鐘，棄去全部上清液。用10mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經高效液相色譜分析，參與反應的egfr抗體有80％～85％成功偶聯在微囊泡上。
鑒定方法：使用原子力顯微鏡觀察所得微囊泡的形態；使用納米粒子追蹤分析設備測量所得微囊泡的直徑分布。
實施例3，細胞外囊泡表面修飾sirna。
步驟(a)，將1×1014細胞外囊泡重懸于1mlph7.4pbs中，加入1ml離心管中。再加入1mmdbco-peg4-nhs。細胞外囊泡與dbco-peg4-nhs的微粒數/摩爾數比為1012：10nmol，將離心管固定在旋轉混勻儀上，室溫下反應12小時。
步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入兩個超濾管(孔徑100kd，容量0.5ml)上層，12000g離心8分鐘。棄掉下層濾液，在上層補充ph7.4pbs至體積達到0.5ml。按照同樣步驟再重復超濾三次，得到1ml修飾了dbco的細胞外囊泡。
步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于1ml離心管中。加入0.5mm疊氮基修飾的sirna(所述的疊氮基修飾的sirna是將azide-peg4-nhs與氨基sirna分子反應獲得，氨基sirna購自上海吉瑪生物技術公司)。步驟(b)的產物中囊泡微粒數與疊氮化sirna的摩爾數比為1012：5nmol，同時加入0.5mmrhodamine-azide用于熒光標記外泌體。將離心管固定在旋轉混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應12小時。
步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。100000g離心70分鐘，棄去全部上清液。用1mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經高效液相色譜分析，參與反應的sirna有80％～85％成功偶聯在細胞外囊泡上。
鑒定方法：使用電子顯微鏡觀察所得細胞外囊泡的形態；使用納米粒子追蹤分析設備測量所得細胞外囊泡的直徑分布。
實施例4，微粒表面修飾peg2000。
步驟(a)，將1×1013微粒重懸于4mlph7.4pbs中，加入8ml離心管中。再加入5μmdbco-sulfo-nhs。微粒與dbco-sulfo-nhs的微粒數/摩爾數比為1012：2nmol，將離心管固定在旋轉混勻儀上，室溫下反應8小時。
步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入8個超濾管(孔徑300kd，容量0.5ml)上層，9000g離心8分鐘。棄掉下層濾液，在上層補充ph7.4pbs至體積達到0.5ml。按照同樣步驟再重復超濾三次，得到4ml修飾了dbco的微粒。
步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于8ml離心管中。加入1μm疊氮基修飾的peg2000(所述的疊氮基修飾的peg2000是將azide-sulfo-nhs與nh2-peg2000分子反應獲得，nh2-peg2000購自北京鍵凱科技有限公司)。步驟(b)的產物中囊泡微粒數與疊氮化peg2000的摩爾數比為1012：0.4nmol，同時加入1μmcy3-azide用于熒光標記外泌體。將離心管固定在旋轉混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應18小時。
步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。100000g離心90分鐘，棄去全部上清液。用4mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經高效液相色譜分析，參與反應的peg2000有80％～85％成功偶聯在微粒上。
鑒定方法：使用電子顯微鏡觀察所得微粒的形態；使用納米粒子追蹤分析設備測量所得微粒的直徑分布。