本發明涉及一種在離子液體介質中進行的微波輔助的脂肪酶催化合成曲酸月桂酸單酯的方法，屬于食品生物技術領域。
背景技術：
曲酸(kojicacid)是由曲霉屬中某些菌株利用葡萄糖、果糖、山梨糖和糖醉等原料，好氧發酵產生的一種弱酸化合物。曲酸具有抑菌能力、抗氧化性、與金屬離子鰲合等性質，并具有抑制酪氨酸酶減少黑色素生成的作用，因此在食品中可作為防腐劑、保鮮劑、護色劑。可安全應用于食品、護膚品及醫療行業。目前對于曲酸的開發研究，大多數集中在尋找能夠保留甚至提高曲酸抑制酪氨酸酶活力的性能，又可以克服曲酸易變性的缺點的曲酸衍生物。因而，曲酸衍生物的制備成為近年來的研究應用上的焦點和相關產品開發的新動向。
ariff等人(jbiomedbiotechnol.2012；2012:952452.)通過研究曲酸酯對細胞及mushroom酪氨酸酶的抑制活性，結果表明，曲酸酯是安全無毒的除色劑，能有效抑制b16f1黑色素瘤細胞的酪氨酸酶活性。人們嘗試通過其與脂肪酸的酯化反應，以期提高曲酸的脂溶性，尤其是通過利用生物轉化法獲得更為安全可靠的曲酸脂肪酸酯衍生物(jamoilchem-soc.1998,75:1507–1511；enzymeandmicrobtechnol.2014,55:128–132；enzymeandmicrobtechnol.2005,37:739–744.)，進一步擴大其在疏水性食品中的應用范圍。
我們的前期研究結果表明，曲酸月桂酸單酯(kojicmonolaurate，kml)具有良好的抑菌能力、抗氧化性能，有望被開發成為防腐劑、保鮮劑、護色劑，應用于果蔬及甲殼類水產品保鮮領域。合成kml的方法主要有化學合成與生物催化法。化學合成法使用大量有機溶劑和價格昂貴的金屬催化劑，通過復雜的保護與去保護步驟，提高產物的單酯選擇性。分離純化復雜、投資成本大、易污染環境等缺點。而生物催化法具有條件溫和、能耗低、無有害副產物、分離純化操作簡便等特點。此外生物催化劑可以重復利用，降低了成本。
酶促法制備kml，主要利用脂肪酶作為催化劑，使曲酸與月桂酸發生直接酯化反應。但從國內外的研究發現，常規脂肪酶在有機溶劑(叔戊醇、叔丁醇等)介質中催化酯化反應仍存在反應活性低、時間過長、產率低、酶用量大等問題。基于以上研究現狀，如何縮短反應時間、提高轉化率，同時減少脂肪酶及揮發性有機溶劑的使用成為制備kml亟待解決的問題。
自1986年gedye等利用微波輻射有效地加速有機反應以來，人們對微波的研究越來越深入。目前微波加速有機反應主要用微波的熱效應和非熱效應來解釋。微波的熱效應表現在其高效加熱特性使反應速率加快。微波的非熱效應表現在微波輻射還起到催化劑的作用，改變了反應的動力學，降低了反應活化能，提高反應速率。1990年以來，微波被應用于生物催化領域特別是在非水相酶催化方面。微波輻射對生物催化反應的影響主要表現在：適宜強度的微波輻射能使酶分子的活性部位更加“裸露”，便于更好地與底物結合，結果表現出酶活升高。微波輻射能增加反應體系及底物分子的能量，加強底物分子的有效碰撞，從而實現加快反應速率的目的。
離子液體因具備對環境友好的特性而被稱為“綠色”溶劑，己經在有機合成與生物化學、電化學、分離過程、催化等領域得到廣泛的應用。離子液體具有優異的化學和熱力學穩定性，有很好的底物溶解性，較寬的溫度適用范圍，且幾乎無蒸汽壓，是綠色的反應介質。同時，其自身結構的“可調節性”，使得離子液體可對微波能量有著較好的吸收效果。并且已經有研究表明，與有機溶劑相比，脂肪酶在一些離子液體中較有機溶劑中表現出更高的催化活性和反應立體及區域選擇性。
本發明是利用脂肪酶在離子液體中催化合成曲酸月桂酸單酯。該方法以固定化狀脂肪酶為生物催化劑，離子液體作為反應介質，曲酸與月桂酸為底物，在微波反應裝置中利用微波加熱促進脂肪酶催化合成食品添加劑曲酸月桂酸單酯。提高了脂肪酶的催化活性及選擇性，縮短了反應時間，避免環境污染，為生物法制備kml提供了又一成功范例
技術實現要素：
本發明目在于提供一種脂肪酶在離子液體中催化合成kml的方法，縮短反應時間、減小環境污染，提高產物得率。
本發明的技術方案如下：
一種微波輔助的離子液體中酶促合成kml的方法，包括以下步驟：
將曲酸、月桂酸、分子篩、脂肪酶與離子液體加入生物反應器中，將反應器移入微波反應裝置中，啟用微波輻射進行反應。反應結束后反應體系進行離心分離，并用乙酸乙酯洗滌固體相兩次，收集有機相，減壓除溶劑得白色固體粗產物；再經過色譜分離，收集樣品組分，合并有機相，干燥，減壓除溶劑，得白色產物。
本發明是在微波加熱條件下，利用脂肪酶在離子液體中催化合成kml，不僅提高的脂肪酶的催化反應活性及選擇性，反應條件溫和、工藝條件簡單，縮短反應時間，更減小了環境污染。
其中，上述脂肪酶為疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶、褶皺假絲酵母脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶、洋蔥布克氏菌脂肪酶；或上述一種或多種的脂肪酶。
其中，上述固定化脂肪酶的用量為2.0-3.0％(w/v)。
其中，上述離子液體為三辛烷基甲基季銨鹽、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑鹽、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正離子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羥乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑硝酸鹽；或上述一種或多種的混合離子液體。
其中，上述曲酸的用量為5-8g/l,且與月桂酸的摩爾比為1:1-1:8。
其中，上述酶促反應溫度為50-70℃。
其中，上述催化反應時間為0-3h。
其中，上述分子篩為3a，且分子篩的用量為10-12％(w/v)。。
對反應進行微波加熱的輻射功率為30～200w，優選30～80w，輻射頻率2000mhz。
本發明中，最佳的反應條件為：反應溫度62℃，輻射功率60w，輻射頻率為2000mhz，反應時間為1h。
本發明還提供了一種曲酸月桂酸單酯在制備食品添加劑中的應用，所述的食品添加劑用于抑菌或者抗氧化。
作為優選，所述的曲酸月桂酸單酯用于抑制金黃色葡萄球菌。
同現有技術相比，本發明的有益效果體現在：本發明采用微波輔助下在綠色離子液體介質中脂肪酶催化合成kml，不僅操作簡便，反應迅速，而且提高了脂肪酶的選擇性，提高產物得率。同時采用了綠色離子液體作為反應介質，即提高了對微波的吸收效果，促進微波效應，又減少環境污染，符合綠色化學的要求。
附圖說明
圖1為實施例4中曲酸月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的生長曲線的影響圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，但本發明不限于此。
氣相色譜(gc)分析條件：不同時間從反應器中取出適量樣品用色譜純甲醇稀釋并置于樣品瓶中。立刻加樣入gc色譜儀(agilent6890n)中，以防止樣品的分解。色譜柱：ht-5fusedsilicacapillarycolumn(0.15μm,0.53mm,0.30m),檢測器：fid，進樣口及檢測器溫度340℃和350℃，柱溫采用程序升溫：70℃到340℃，升溫速率20℃/min。載氣為n2，流速：1.0ml/min，進樣量：2μl。kml得率(摩爾轉化率)＝曲酸月桂酸單酯摩爾數/初始曲酸摩爾數×100％。
樣品處理條件：反應結束后，反應體系進行離心分離，并用乙酸乙酯洗滌固體相兩次，收集有機相，減壓除溶劑得白色固體粗產物；再經過色譜分離，收集樣品組分，合并有機相，干燥，減壓除溶劑，得白色產物。
實施例1
本實施例探究有機溶劑中常規加熱和微波加熱的脂肪酶催化反應的差異。
用常規加熱的脂肪酶催化反應：
在生物反應器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子篩和60mg脂肪酶novozym435(candidaantarcticalipaseimmobilizedonmacroporouspolyacrylicresin)，3ml叔丁醇，水浴恒溫62℃，反應10h后的kml產率為20.3％。
微波加熱的脂肪酶催化反應：
在微波反應器中加入0.2mm曲酸、1.0mm月桂酸、24mg/ml3a分子篩和1.2mg/ml脂肪酶novozym435，3ml叔丁醇，將微波反應器移入微波反應裝置中，啟用微波輻射，設定反應溫度62℃，輻射功率30w，輻射頻率為2000mhz，反應1h后的kml產率為22.3％。
實施例2
與實施例1對比，本實施例探究了微波加熱脂肪酶催化反應在離子液體中的反應情況。
在微波反應器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子篩和160mg脂肪酶novozym435與3ml離子液體[peg350im]pf6，將微波反應器移入微波反應裝置，啟用微波輻射，設定反應溫度62℃，輻射功率30w，輻射頻率為2000mhz，反應1h后的kml產率為35.1％。
實施例3
與實施例2相較，本實施例探究在離子液體中用不同功率微波加熱脂肪酶催化反應的差異。
在離子液體中用60w功率微波加熱脂肪酶催化反應：在微波反應器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子篩和160mg脂肪酶novozym435與3ml離子液體[peg350im]pf6，將微波反應器移入微波反應裝置，設定反應溫度62℃，輻射功率60w，輻射頻率為2000mhz，反應為1h的kml產率為37.3％。
實施例4
本實施例探究了曲酸月桂酸酯對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。選取金黃色葡萄球菌作為代表菌屬，研究抑制劑對它們生長曲線的影響。固定菌液的初始濃度，將1mic，2mic，4mic,6mic的濃度的曲酸月桂酸酯加入含菌液體培養基中。然后定期取樣用無菌水稀釋至適當濃度，涂布，進行平板計數。總時間取微生物的一個生長周期24h。從圖1看出，濃度為2mic時，2h內可以將109cfu/ml的金黃色葡萄球菌抑制到小于104cfu/ml左右，并能持續作用到4h。濃度大于4mic時，在4h內對金黃色葡萄球菌直接殺死。
實施例5
本實施例探究了曲酸月桂酸酯的體外模擬脂質過氧化的抑制作用。于比色管中加入3.0mlhci溶液(1.2mol/l)，3.0mltba溶液和0.2ml油酸，60℃水浴共熱1h，水冷至室溫，吸出油酸，用10.0ml正丁醇萃取，靜置5min，測量上層溶液熒光強度i1。加入不同濃度的曲酸月桂酸酯0.5ml，于ex＝543nm處測量其熒光強度is，未加清除劑的空白體系熒光強度為io，實驗選擇激發波長為543nm，光譜帶寬為10nm.按以下公式計算抑制率i：
i＝[(i1-is)/(i1-io)]×100％
表1抗氧化劑抑制脂質過氧化能力
丙二醛可用來反映生物體內脂質過氧化狀態及機體受損傷的程度。根據上述實驗結果，曲酸不具有抑制脂質過氧化能力，而曲酸月桂酸酯具有較強的脂質過氧化抑制能力，且隨著濃度的增大，抑制作用不斷增強。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應該視為本發明的保護范圍。