小麥光腥黑粉菌原生質體的制備方法與流程

本發明涉及細胞工程中真菌原生質體制備與再生技術領域，具體涉及一種小麥光腥黑粉菌原生質體的制備方法。

背景技術：

小麥光腥黑粉菌(tilletiafoetidawalle.lindr.)引起的小麥光腥黑穗病(commonbuntofwheat)是一種世界性病害，具有分布廣泛、流行性強，危害嚴重等特點，嚴重影響小麥的生產。感病植株通常在外觀上沒有明顯的癥狀，在發病后期，穎殼略向外張開，整個麥穗變成病穗，病粒外有一層灰色薄膜，內部充滿黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有魚腥味，引起小麥產量和品質降低。小麥光腥黑粉菌屬于擔子菌亞門(basidiomycotina)、冬孢菌綱(teliomycetes)、黑粉菌目(ustilaginales)、腥黑粉菌科(tilletiaceae)、腥黑粉菌屬(tilletia)。冬孢子呈褐色，球形或近球形，可隨種子傳播，在土壤中能夠存活多年，一旦條件適宜并遇到大面積的寄主植物，便會引起發病。

國內外對于小麥光腥黑穗病的研究主要集中在病原菌生物學特性以及分子標記技術，對該病原菌的致病機制研究較少。遺傳轉化技術是實現大規模定點突變的重要方法，利用該技術能夠改變真菌的遺傳物質，研究植物病原菌的的致病機理。目前，真菌遺傳轉化的方法有很多，常見的有聚乙二醇介導的原生質體轉化、限制性內切酶介導的整合以及農桿菌轉化等。原生質體是大多數轉化方法的受體細胞，因此原生質體的制備和再生直接關系到轉化能否順利進行。獲得產率高、可再生的小麥光腥黑粉菌原生質體的制備方法，將為建立該病原菌的遺傳轉化體系奠定基礎，推動對該病原菌致病機制的研究。

技術實現要素：

針對上述領域存在的需求，本發明的目的在于提供一種小麥光腥黑粉菌原生質體的制備方法。

本發明通過如下技術方案實現：

小麥光腥黑粉菌原生質體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)菌絲培養：將小麥光腥黑粉菌的冬孢子在水瓊脂培養基中培養6-9天后，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液，離心去上清，得到菌絲；

(2)細胞壁裂解：以氯化鉀溶液作為滲透壓穩定劑，配制混合酶液，加入菌絲中，28℃振蕩酶解1.5-2.5h，即得到小麥光腥黑粉菌原生質體；

所述混合酶液包括質量百分比濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶。

優選地，所述水瓊脂培養基的制備方法為：稱取20g瓊脂粉，加水定容到1l，高壓蒸汽滅菌。

優選地，所述小麥光腥黑粉菌冬孢子在水瓊脂培養基中培養7天。

優選地，所述氯化鉀溶液的濃度為1.2mol/l。

優選地，所述28℃振蕩酶解的時間為2h。

優選地，所述混合酶液與所述菌絲的配比為20ml：1g。

優選地，所述振蕩酶解在180r/min的轉速下進行。

優選地，所述小麥光腥黑粉菌的冬孢子在水瓊脂培養基中培養的條件為溫度為16℃和相對濕度為80％。

原生質體是許多真菌進行遺傳轉化的受體細胞，優化原生質體的制備方法，能更好的建立小麥光腥黑粉菌的遺傳轉化體系。本發明以小麥光腥黑粉菌菌株為供試材料，研究了菌株培養時間、細胞壁裂解酶、酶解時間和滲透壓穩定劑等對原生質體制備的影響，獲得了小麥光腥黑粉菌原生質體制備的最佳條件。

菌齡：制備真菌的原生質體一般都采用新鮮的菌絲或孢子，細胞壁的結構和成分在不同的生長時期會有所不同。小麥光腥黑粉菌冬孢子萌發后先產生先菌絲和初生擔孢子，之后初生擔孢子h結合產生侵染菌絲，侵染菌絲既對小麥有侵染性，又容易被酶解。培養時間過短，產生的先菌絲和擔孢子相對比較幼嫩，在原生質體釋放后容易受到酶的作用而破裂，降低原生質體得率；培養時間過長，菌絲細胞壁老化、成分改變，酶系統對其作用不顯著，原生質體得率較低。因此，小麥光腥黑粉菌冬孢子的培養時間直接影響原生質體數量。本發明實驗結果表明，在水瓊脂培養基中培養7天的小麥光腥黑粉菌最適宜制備原生質體，產生的原生質體數量最多。

裂解酶及酶解時間：真菌細胞壁成分復雜多樣，在原生質體制備中，用于裂解細胞壁的酶的種類及酶解時間，對原生質體產出率有非常重要的影響。酶解時間過短，細胞壁破解不完全，許多原生質體不能從菌絲上分離下來，使原生質體產率降低；時間過長，酶對得到的原生質膜傷害作用過大，容易造成原生質體的破裂，也會降低原生質體的產率。擔子菌菌絲的細胞壁主要成分是幾丁質和葡聚糖。本發明采用崩潰酶、溶壁酶和蝸牛酶對小麥光腥黑粉菌細胞壁進行溶解實驗，其中崩潰酶是含有木聚糖酶、昆布多糖酶、及纖維素酶等的復合酶；溶壁酶具有幾丁質酶、纖維素酶及蛋白酶等活性；蝸牛酶中含有纖維素酶、果膠酶、葡糖酸酶、幾丁質酶和脂酶等多種酶。結果表明，一種酶或者兩種酶都不能很好地溶解小麥光腥黑粉菌細胞壁，本發明采用質量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復合酶液，在28℃振蕩條件下對菌體細胞壁酶解2h后，獲得的原生質體產率最高。

滲透壓穩定劑：滲透壓穩定劑可以保護細胞膜使其不受裂解酶過度破壞，對原生質體起到保護作用，能影響原生質體的制備和再生。滲透壓穩定劑通常包括有機和無機兩種，針對不同的真菌，作用效果不同。本發明研究發現，以1.2mol/l的kcl為滲透壓穩定劑，所得的小麥光腥黑粉菌原生質體數量最多，且釋放的原生質體能夠均勻散亂分布，不聚集成堆。

綜上，采用本發明的方法制備小麥光腥黑粉菌原生質體，產量高達17.0×10⁵～18.0×10⁵個/ml，且釋放的原生質體均勻散亂分布，不聚集成堆。得到的原生質體可以在tb3培養基上長出較多單菌落，可用于小麥光腥黑粉菌的原生質體再生。

附圖說明

圖1為小麥光腥黑粉菌原生質體的釋放過程，

其中，a：在酶解初始階段，菌絲細胞開始向內凹陷成念珠狀；b：隨著酶解進行，細胞壁逐漸被降解，原生質體釋放出來，呈圓形透明的小球；c：有的原生質體會連在一起；d：最后菌絲酶解完全，大量的原生質體釋放出來。

圖2為菌齡對原生質體形成的影響，

其中，橫坐標為菌體的培養天數，縱坐標為原生質體數量(×10⁵個/ml)。

圖3為不同酶解時間對原生質體產量的影響，

其中，橫坐標為酶解時間(小時)，縱坐標為原生質體數量(×10⁵個/ml)。

圖4為不同滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響，

其中，橫坐標為不同的滲透壓穩定劑，縱坐標為原生質體數量(×10⁵個/ml)。

圖5為使用不同滲透壓穩定劑制備的原生質體釋放后的狀態，

其中，a：以山梨醇作為滲透壓穩定劑，所釋放的原生質體易聚集分布，箭頭所示為原生質體；b：以蔗糖為滲透壓穩定劑，很多原生質體聚集在一起，箭頭所示為原生質體；c：以mgso4為滲透壓穩定劑，原生質體釋放后分散分布，箭頭所示為原生質體；d：以kcl為滲透壓穩定劑，原生質體釋放后分散分布，箭頭所示為原生質體。

圖6為小麥光腥黑粉菌原生質體的再生，

其中，左側為tb3培養基，右側為pda培養基。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步描述本發明，需要理解的是，下述實施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發明的范圍。

生物材料

小麥光腥黑粉菌：本發明所使用的小麥光腥黑粉菌為現有文獻《小麥光腥黑穗菌萌發的超微結構研究》，西北農業大學學報，1999，03期(3)：110-112所記載的菌株。

上述生物材料本實驗室亦有保存，申請人聲明可自申請日起二十年內向公眾發放用于驗證實驗。

主要試劑

溶壁酶(lysingenzyme)，購于sigma公司，貨號：sigml1412；

崩潰酶(driselase)，購于sigma公司，貨號：d9515；

蝸牛酶(snailase)，購于上海生化所，貨號：d2412；

pda粉末，購于北京奧博星生物技術有限責任公司，貨號：02-023；

硫酸鎂，購于北京化工廠，貨號：34156-69-9；

氯化鉀，購于國藥集團化學試劑有限公司，貨號：7447-40-7；

山梨醇，購于amresco公司，貨號：0691-500g；

蔗糖，購于國藥集團化學試劑有限公司，貨號：57-50-1。

培養基

2％水瓊脂培養基制備方法：稱取20g瓊脂粉，加水定容到1l，121℃高壓蒸汽滅菌。

馬鈴薯葡萄糖固體培養基(pda)：稱取pda粉末37g，加水定容到1l，121℃高壓蒸汽滅菌。

tb3培養基：酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，酵母粉10g，加水定容到1l，121℃高壓蒸汽滅菌。

下述實施例中未特別說明的生物化學試劑均為本領域常規試劑，可按照本領域常規方法配制而得或商購獲得，規格為實驗室純級。

實施例1：小麥光腥黑粉菌原生質體制備方法的優化

將小麥光腥黑粉菌的冬孢子在2％的水瓊脂培養基中培養，溫度16℃，相對濕度為80％，選取不同培養天數的菌體用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，分別加入20ml不同種類的復合酶液，28℃，180r/min振蕩酶解，每隔半小時用血球計數板觀察原生質體得率，篩選出最適宜原生質體制備的菌齡、酶解時間、酶解體系、滲透壓穩定劑。

1、菌體培養時間

在水瓊脂培養基上培養小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對濕度為80％，4d后開始萌發長出先菌絲，5d后先菌絲上長出初生擔孢子，初生擔孢子h型融合，之后長出侵染絲和次生擔孢子。選取不同生長階段(6d、7d、8d、9d)的菌體，用滅菌蒸餾水沖洗下來，過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，加入20ml用1.2m氯化鉀溶液配制的質量濃度為1.5％崩潰酶，1.5％溶壁酶和1.5％蝸牛酶的復合酶液，28℃，180r/min振蕩酶解1.5h，觀察并記錄原生質體獲得量，選出最適宜制備原生質體的菌體培養時間。

試驗結果如圖2所示，培養7d后的侵染菌絲用作初始材料進行酶解，比較容易得到原生質體，且酶解相同時間后得到的原生質體數量最多，為17.0×10⁵個/ml。

2、細胞壁裂解酶

用1.2m的氯化鉀溶液分別配制質量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶，研究單一酶和不同組合的酶液對小麥光腥黑粉菌原生質體產量的影響。

在水瓊脂培養基上培養小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對濕度為80％，選取培養8天的菌絲，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，分別加入20ml單種酶和不同組合的酶液，28℃，180r/min振蕩酶解1.5h，觀察并記錄原生質體獲得量。

結果如表1所示，原生質體的產量受細胞壁裂解酶的種類和濃度的影響較大，且混合酶的作用效率高于單一酶。在單個酶作用時，1.5％的崩潰酶得到的小麥光腥黑粉菌的原生質體數量最多，為3.2×10⁵個/ml；1.5％的蝸牛酶得到的原生質體數量最少，為2.4×10⁵個/ml；兩種酶組合時，原生質體的數量與單種酶相比有所提高；三種酶混合時，得到的原生質體最多。因此，在小麥光腥黑粉菌原生質體的制備中，選擇崩潰酶、溶壁酶和蝸牛酶三種酶混合效果較好。

表1不同裂解酶組合對小麥光腥黑粉菌原生質體產量的影響

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

3、酶解時間

酶解時間影響原生質體的獲得率和再生，因此確定合適的酶解時間至關重要。用1.2m的氯化鉀溶液配制質量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復合酶液，備用。

在水瓊脂培養基上培養小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對濕度為80％，選取培養8天的菌絲，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，加入20ml配制好的復合酶液，28℃搖床中180r/min振蕩酶解，設置酶解時間分別為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5、3h，顯微鏡檢觀察是否獲得原生質體以及原生質體的數量。

結果如圖3所示，在酶解0.5h時原生質體數量較少，很多菌絲的細胞壁雖然被不同程度的破壞，但大多數還沒有破解完全，原生質體還沒有從菌絲上分離下來；之后隨著酶解時間的增加，原生質體的數量也增加，2h時達到最大值，為17.6×10⁵個/ml；繼續酶解，原生質體的數量減少。

4、滲透壓穩定劑

本實驗分別選擇1.2mol/l的mgso4、kcl、d-山梨醇、蔗糖作為滲透壓穩定劑，觀察不同滲透壓穩定劑對小麥光腥黑粉菌原生質體制備的影響。

在水瓊脂培養基上培養小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對濕度為80％，選取培養8天的菌絲，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，分別加入20ml不同滲透壓穩定劑配制的質量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復合酶液，28℃搖床中180r/min振蕩酶解1.5h，記錄原生質體的數量。

如圖4和圖5所示，不同類型的滲透壓穩定劑對原生質體制備的影響不同，在所選的四中滲透壓穩定劑中，相同條件的處理下，無機溶劑比有機溶劑原生質體得率更高，且以山梨醇和蔗糖作為滲透壓穩定劑所得到的原生質體易聚集，采用氯化鉀作為滲透壓穩定劑，得到原生質體最多，為12.1×10⁵個/ml，且原生質體不會聚集成堆。

實施例2：采用優化后的方法制備小麥光腥黑粉菌原生質體

用1.2mol/l的氯化鉀配制質量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復合酶液。然后按照如下步驟制備原生質體：

(1)菌絲培養：在2％水瓊脂培養基上培養小麥光腥黑粉菌的冬孢子7d，培養條件為溫度16℃，相對濕度80％，然后將萌發的冬孢子用滅菌蒸餾水沖洗下來后，收集菌液。

(2)酶解菌絲細胞壁：將收集的菌液過濾，然后5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，加入20ml復合酶液，28℃，180r/min，振蕩酶解2h，將酶解液過濾，5000r/min離心10min，即得到小麥光腥黑粉菌原生質體。

結果表明，采用本發明優化的方法制備小麥光腥黑粉菌原生質體，原生質體得率可達到17.0×10⁵～18.0×10⁵個/ml。

小麥光腥黑粉菌原生質體的釋放過程如圖1所示，在酶解初始階段，菌絲細胞開始向內凹陷成念珠狀(圖中1a)，隨著酶解進行，細胞壁逐漸被降解，原生質體釋放出來，呈圓形透明的小球(圖1中b),有的原生質體會連在一起(圖1中c)，最后菌絲酶解完全，大量的原生質體釋放出來(圖1中d)，成游離狀態，均勻分散。

實施例3：小麥光腥黑粉菌原生質體的再生

將實施例1和2制備得到的原生質體分別用1.2mol/l的氯化鉀重新懸浮后，分別涂布在pda和tb3固體培養基中，16℃培養4天，觀察長出的單菌落。

結果如圖6所示，小麥光腥黑粉菌的原生質體在tb3培養基上長出較多單菌落，而pda培養基上無單菌落長出，因此，tb3培養基比pda培養基更適合原生質體再生，可用于小麥光腥黑粉菌原生質體的再生培養。