高效復合沼氣發酵催化劑的制作方法

本發明涉及沼氣發酵領域，特別涉及一種高效復合沼氣發酵催化劑。

背景技術：

沼氣發酵是以各種有機質為原料，通過微生物的一系列復雜發酵作用最終生成沼氣的過程。

沼氣厭氧發酵過程是一個由多種微生物結合、交替相互作用的復雜生化反應過程，產甲烷菌和不產甲烷菌之間相互制約，又相互依賴。

沼氣發酵過程具有以下三個階段：

第一階段

液化階段，微生物（纖維素分解菌、蛋白質水解菌等）通過胞外酶的作用使固體有機物質轉化成可溶性的有機物質。

第二階段

產酸階段，可溶性物質在胞內酶的作用下繼續分解轉化成低分子物質，如甲醇、乙醇、甲酸、乙酸等，同時部分釋放出氫和二氧化碳。在第二階段中，主要產物是乙酸，占70%以上。

第三階段

產甲烷階段，在這個階段中嚴格厭氧的產甲烷細菌把產酸階段的小分子化合物通過一步或幾步的還原作用，最終形成甲烷和二氧化碳，得到沼氣。

為了提高沼氣原料的降解效率和沼氣產量，目前主要是通過添加輔助劑，通過提高各階段微生物的產酶、分解轉換效率，以達到提高沼氣原料的降解效率和沼氣產量的目的。然而，這些方案僅針對沼氣發酵的第一階段、第二階段，即，提高對發酵原料的利用效率，如此雖能促進產酸，對產甲烷菌提供充足原料，但沒有提高產甲烷菌對這些產酸階段生成的小分子化合物的轉化利用效率，也沒有針對三個主要階段的總體協同促進措施方案。因此，目前沼氣發酵技術仍然具有進一步提升的空間。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種高效復合沼氣發酵催化劑，發酵催化劑中的復合菌劑產生沼氣發酵對應階段的酶，包括纖維素酶和淀粉酶，這些酶通過酶激活劑提高酶活性，有效提高沼氣池中各原料的分解利用效率，復合菌劑中的酵母菌和醋酸菌增加重要中間代謝產物乙酸的積累，發酵催化劑中的還原性鹽降低產沼氣體系氧化還原電位、減少溶解氧，對產甲烷菌提供嚴格厭氧環境條件，利于產甲烷菌高效產甲烷，有效提高沼氣池的沼氣產量。

本發明的技術方案是：一種高效復合沼氣發酵催化劑，包括復合菌劑，以及添加在復合菌劑中的酶激活劑、還原性鹽，

所述復合菌劑由低溫產纖維素酶菌液、常溫產纖維素酶菌液、常溫產淀粉酶菌液、常溫醋酸菌液、常溫酵母菌液按體積比1-1.5：1：1：1：1混合制得，各菌液的菌體濃度均為1x10⁹cfu/ml；

添加在復合菌劑中的所述酶激活劑包括纖維素酶激活劑、產甲烷相關酶激活劑，所述纖維素酶激活劑由硝酸鉀、氯化鋅、硝酸鈣組成，所述產甲烷相關酶激活劑由氯化錳、硝酸鈷、硫酸鎳組成；

所述還原性鹽由硫酸亞鐵、亞硫酸鈉、硝酸銨、硫化鈉組成。

所述低溫產纖維素酶菌為假單孢菌。

所述常溫產纖維素酶菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種。

所述常溫產淀粉酶菌為枯草芽胞桿菌。

所述常溫醋酸菌為巴氏醋桿菌。

所述常溫酵母菌為釀酒酵母。

所述硝酸鉀、氯化鋅、硝酸鈣的濃度均為30-60mg/ml。

所述氯化錳、硝酸鈷、硫酸鎳的濃度均為30-60mg/ml。

所述硫酸亞鐵、亞硫酸鈉、硝酸銨、硫化鈉的濃度均為30-60mg/ml。

所述復合菌劑中添加有0.12-0.15wt%的吐溫。

產甲烷菌是專性嚴格厭氧菌，對氧化還原電位的要求苛刻，最適氧化還原電位為-400~-500mv，尤其在培養初期，氧化還原電位甚至不能高于-330mv。沼氣池在加料過程中不可避免會帶入空氣，使液體原料中溶解氧，不利于產甲烷菌產甲烷。

本發明高效復合沼氣發酵催化劑中復合菌劑的低溫產纖維素酶菌在低溫環境下產纖維素酶，分解原料中的纖維素為可溶性有機物質（糖類），常溫產纖維素酶菌、常溫產淀粉酶菌分別在常溫環境下產纖維素酶、淀粉酶，對應分解原料中的纖維素、淀粉為可溶性有機物質（糖類），使沼氣發酵原料在低溫、常溫條件下均能快速分解成可溶性有機物質，形成產乙酸、乙醇的底物。復合菌劑中常溫酵母菌和常溫醋酸菌將可溶性有機物質（糖類）進一步轉化乙酸，生成產甲烷的重要中間代謝產物，通過添加纖維素酶激活劑，提高纖維素的酶活性，促進纖維素的分解速率，通過添加產甲烷相關酶激活劑，提高這些相關酶的酶活性，提高產甲烷菌對乙酸的利用效率，提高甲烷的產氣速率和產氣量。本發明高效復合沼氣發酵催化劑通過添加還原性鹽硫酸亞鐵、亞硫酸鈉、硝酸銨、硫化鈉，降低產沼氣體系氧化還原電位、減少溶解氧，為發酵體系提供嚴格的厭氧環境條件，為產甲烷菌的生長創造適宜的氧化還原電位條件，利于產甲烷細菌生長繁殖。隨著氧化還原電位的降低，各種微生物的活性隨之發生改變，首先表現為氮呼吸，產生氨氮、亞硝酸鹽；氧化還原電位繼續降低，表現為鐵錳呼吸，三價鐵逐漸被還原成二價鐵，這個過程耗氧產酸，發酵環境的ph下降；氧化還原電位繼續降低，表現為硫呼吸，原本存在的硫酸根被還原成硫化氫，硫化氫與二價鐵（亞鐵離子）反應，產生黑臭現象；最后發酵環境在極度缺氧情況下，產甲烷菌分解有機質產生甲烷，實現高效產甲烷、有效提高沼氣池沼氣產量的目的。

復合菌劑中添加有0.12-0.15wt%的吐溫，用于提高酶激活劑、還原性鹽和菌的均勻分布度。

附圖說明

圖1為實施例1發酵期間產氣量曲線圖；

圖2為實施例2發酵期間產氣量曲線圖。

具體實施方式

本發明中，硝酸鉀、氯化鋅、硝酸鈣、氯化錳、硝酸鈷、硫酸鎳、硫酸亞鐵、亞硫酸鈉、硝酸銨、硫化鈉、吐溫均購自重慶韻博科技有限公司，均為化學純度。

本發明中，各菌種的來源為：

假單胞菌（pseudomonadaceae）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：cicc10441。

枯草芽孢桿菌枯草亞種（bacillussubtilissubspecies）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：cicc10832。

巴氏醋桿菌（acetobacterpasteurianus）購自廣東省微生物菌種保藏中心，菌株編號：gim1.67。

釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株編號：cicc1049。

枯草芽胞桿菌（bacillussubtilis）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：cicc10066。

實施例1：

試驗組：

取購買的假單胞菌菌種，在牛肉膏蛋白胨培養基（1000ml蒸餾水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g瓊脂）中培養60-72h，培養溫度28℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的枯草芽孢桿菌枯草亞種，在牛肉膏蛋白胨培養基（1000ml蒸餾水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g瓊脂）中培養60-72h，培養溫度28℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的巴氏醋桿菌，在ypd培養基（1000ml蒸餾水中添加100g葡萄糖、10g酵母膏、20gcaco3、15g瓊脂，調節ph至6.8）的中培養80h，培養溫度28℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的釀酒酵母，在5bé麥芽汁瓊脂培養基（1.0l5bé麥芽汁中添加15.0g瓊脂，自然ph）中培養75h，培養溫度為28-30℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的枯草芽胞桿菌，在牛肉膏蛋白胨培養基（1000ml蒸餾水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g瓊脂）中培養60h，培養溫度為37℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml。

取制備好的各菌液，按體積比1.5：1：1：1：1混合制得復合菌劑。

取制得的復合菌劑3ml，添加硝酸鉀150mg、氯化鋅150mg、硝酸鈣150mg、氯化錳150mg、硝酸鈷150mg、硫酸鎳150mg、硫酸亞鐵150mg、亞硫酸鈉150mg、硝酸銨150mg、硫化鈉150mg、吐溫3.9mg，混勻，制得高效復合沼氣發酵催化劑。

取新鮮禽畜屠宰場的廢水260ml，調節廢水中固體物質含量（ts）至10%，作為發酵原料。

在恒溫厭氧沼氣發酵裝置中，加入發酵原料260ml、3ml高效復合沼氣發酵催化劑，30℃中溫發酵。

設3個平行，每2天定時記錄產沼氣氣量，并取樣留存，最后將所有取樣混合，測沼氣中甲烷（ch4）含量。

對照組：

取新鮮禽畜屠宰場的廢水260ml，調節廢水中固體物質含量（ts）至10%，作為發酵原料。

在恒溫厭氧沼氣發酵裝置中，加入發酵原料260ml，30℃中溫發酵。

設3個平行，每2天定時記錄產沼氣氣量，并取樣留存，最后將所有取樣混合，測沼氣中甲烷（ch4）含量。

結果：

試驗組、對照組的產氣量如圖1所示，試驗組產氣中平均甲烷（ch4）含量為53.8%，發酵期間共產氣39.2ml，對照組產氣中平均甲烷（ch4）含量為50.15%，發酵期間共產氣27.64ml。

實施例2：

試驗組：

取購買的假單胞菌菌種，在牛肉膏蛋白胨培養基（1000ml蒸餾水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g瓊脂）中培養60-72h，培養溫度28℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的枯草芽孢桿菌枯草亞種，在牛肉膏蛋白胨培養基（1000ml蒸餾水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g瓊脂）中培養60-72h，培養溫度28℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的巴氏醋桿菌，在ypd培養基（1000ml蒸餾水中添加100g葡萄糖、10g酵母膏、20gcaco3、15g瓊脂，調節ph至6.8）的中培養80h，培養溫度28度，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的釀酒酵母，在5bé麥芽汁瓊脂培養基（1.0l5bé麥芽汁中添加15.0g瓊脂，自然ph）中培養75h，培養溫度為28-30℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml；

取購買的枯草芽胞桿菌，在牛肉膏蛋白胨培養基（1000ml蒸餾水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g瓊脂）中培養60h，培養溫度為37℃，至濃度為1x10⁹cfu/ml。

取制備好的各菌液，按體積比1.5：1：1：1：1混合制得復合菌劑。

取15l復合菌劑，添加硝酸鉀750g、氯化鋅750g、硝酸鈣750g、氯化錳750g、硝酸鈷750g、硫酸鎳750g、硫酸亞鐵750g、亞硫酸鈉750g、硝酸銨750g、硫化鈉750g、吐溫19.5g，混勻，制得高效復合沼氣發酵催化劑。

取新鮮禽畜屠宰場的廢水1000l，調節廢水中固體物質含量（ts）至8%，作為發酵原料。

在大型發酵池中加入發酵原料1000l、15l高效復合沼氣發酵催化劑，常溫發酵。

每2天定時記錄產沼氣氣量，并取樣留存，最后將所有取樣混合，測沼氣中甲烷（ch4）含量。

對照組：

取新鮮禽畜屠宰場的廢水1000l，調節廢水中固體物質含量（ts）至8%，作為發酵原料。

在大型發酵池中加入發酵原料1000l，常溫發酵。

每2天定時記錄產沼氣氣量，并取樣留存，最后將所有取樣混合，測沼氣中甲烷（ch4）含量。

結果

試驗組、對照組的產氣量如圖2所示，試驗組產氣中平均甲烷（ch4）含量54.3%，發酵期間共產氣197.55l，對照組產氣中平均甲烷（ch4）含量50.35%，發酵期間共產氣140.6l。

結論：

由實施例1、實施例2的結果可知，通過在發酵原料中添加本發明高效復合沼氣發酵催化劑，相對于對照組，試驗組在整個發酵期間產氣量遠大于對照組產氣量，證明本發明高效復合沼氣發酵催化劑能有效提高大分子物質的降解效率和產甲烷菌對乙酸的利用效率，提高甲烷的產氣速率和產氣量。而且相對于對照組，試驗組沼氣中甲烷（ch4）含量更高，證明本發明高效復合沼氣發酵催化劑能產生更適宜的氧化還原電位條件，利于產甲烷菌生長代謝。